Summary
Aplysia californica нейроны развиваются крупные конусы роста в культуре, отлично подходит для изображений с высоким разрешением роста подвижности конуса и руководство. Здесь мы приводим протокол вскрытия и покрытия нейронов Aplysia сумку клеток, а также для настройки камеры для живого изображения клетки.
Abstract
Нейронные конусы роста очень подвижные структуры на кончике аксоны, которые могут обнаружить руководством сигналы в окружающей среде и преобразовывать эту информацию в направленное движение к соответствующей клетки-мишени. Чтобы полностью понять, как руководство информация передается от поверхности клетки к основным динамическим цитоскелета сетей, нужно модель системы, пригодной для живого изображения ячейки динамики белков на высоких временным и пространственным разрешением. Типичные позвоночных конусы роста слишком малы, чтобы количественно проанализировать F-актина и микротрубочек динамику. Нейроны из морской заяц Aplysia californica в 5-10 раз больше, чем нейронов позвоночных, может быть легко хранить при комнатной температуре и очень надежный клеток для микроманипуляция и биофизических измерений. Их конусы роста очень определенных цитоплазматических регионах и хорошо описаны цитоскелета системы. Тела нейронов может быть microinjected с различными зондами для изучения роста подвижности конуса и руководство. В настоящее время протокол мы продемонстрируем процедуру вскрытия брюшной ганглий, культуре нейронов сумку клеток и создания изображений камера для живого изображения ячейки роста конусов.
Protocol
Решения
- L15-ASW культуре клеток среды (1л)
- 1 мешок L15 порошок
- добавить 800 мл H 2 O сверхчистых
- 400 мМ NaCl
- MgSO 4 27 ммоль
- MgCl 2 28 мМ
- L-глютамин 4 мМ
- Гентамицин 50 мкг / мл
- HEPES 5 мМ
- Отрегулируйте до рН 7,9
- Добавить по капле CaCl 2 9,3 мм (остановиться, если осадков)
- Добавить H 2 O сверхчистой до 1 л
- Проверьте осмолярность (950-1000 ммоль / кг) с осмометре (давление пара, Wescor # 5520)
- Фильтр 0,22 мкм использованием положительного единица давления фильтрации (фильтры: Millipore SVGV010RS)
- Хранить при температуре 4 ° С до 1 месяца
- Поли-L-лизин (70-150 кДа) 200 мкг / мл раствора акции в стерильной H 2 O сверхчистых храниться при температуре -20 ° С
- 0,5 М раствор MgCl 2
День 1: Препарирование Aplysia брюшной ганглий
Подготовка ферментативных решение диссоциации
- Взвесьте 9-10 мг Dispase фермента (Уортингтон, Cat: LS02111) в пробирку Эппендорфа
- Добавить 900 мкл L15-ASW культуральной среде, и 100 мкл стерильной H 2 O сверхчистых
- Смешайте и месте при комнатной температуре (RT)
Вскрытие брюшной ганглий
- Заполните шприц 50 мл 0,5 М MgCl 2 решения.
- Возьмите одно животное из бака, ручки осторожно, чтобы не красочных обороны животного ответ.
- Место Aplysia на бок на вскрытии платы (пенополистирола совета), ростральной сторона права, хвостовой части в левую.
- Вставьте иглу в животных прямо за голову, и внедрить все MgCl 2 раствора в полость тела.
- Аккуратно руб животных, чтобы разогнать MgCl 2 решения всей полости тела, подождите несколько минут, чтобы животное могло быть полностью наркозом.
- Pin голова и хвост животного вскрытия доска с двумя иглами.
- Используйте пинцет, чтобы поднять кожу, разрезать кожу и мышечный слой с большими ножницами на голову и хвост, чтобы сделать большое отверстие на стороне.
- Найти брюшного ганглия под кистью, как яичника. Используйте пинцет, чтобы удерживать соединения нервов около 1 см в передней части брюшной ганглий, вырезать нервы рассечение ножницами перед щипцы проведения позиции и позади брюшной ганглий.
- Место ганглия в Dispase раствора и инкубировать в течение 15-16 ч при 22 ° С с использованием регулируемой температурой водяной бане.
День 2: Покрытие клеток Aplysia сумки
Подготовка поли-лизин покрытием покровные
- В потоке скамейку, подготовить три 35-мм чашки Петри в качестве рабочего блюда для вскрытия ганглия, наполняя их 4 мл L15-ASW среда каждого. Передача брюшной ганглий из dispase решение одной из рабочих блюда после 15,5 часов пищеварения.
- Использование щипцов принять кислоты очисткой № 1.5 покровные (22x22 мм), которые хранятся в этаноле, удалить алкоголь и стерилизовать покровные на пылающие их кратко над горелкой Бунзена. Пусть они кратко остыть прежде, чем размещение в покровные культуры блюд.
- Подготовка изогнутый наконечник покрытие, сгибая желтый опрокинуться горелка Бунзена (пламя лишь вкратце, чтобы избежать плавления пластика!).
- Подготовка соответствующее количество 20 мкг / мл поли-лизин решение путем разбавления 200 мкг / мл раствора фондовом стерильной H 2 O сверхчистых.
- Обложка каждого покровное с 500 мкл 20 мкг / мл поли-лизина и инкубировать 20 минут при комнатной температуре.
- Промыть каждую покровное 3-5 раза с 500 мкл стерильной H 2 O сверхчистых каждый.
- Удалите воду из покровных; заполнить каждое блюдо с 4 мл L15-ASW культуральной среде.
Диссоциация сумку клетки
- Под микроскопом рассечение, разрезать брюшную ганглия в половине использованием рассечение ножницами и щипцами предварительно очищенные с 95% этанола (рис. 1 линия 1).
- На одной половине ганглия, разрез между сумку кластеров клеток и hemiganglion клетки (рис. 1 линия 2), и вырезать оставшиеся нерва расширений на другой стороне сумки клетки (рис. 1 строка 3). Работа на одной половине ганглия в то время, оставьте другую половину в блюдо в то время как клетки из первого кластера в настоящее время покрытие.
- Использование двух щипцы (или один щипцы и ножницы рассечение), отпустите сумку клетка кластера оттеснив соединительной ткани, окружающей оболочку кластера сумку клетки. Срежьте соединительной ткани с рассечение ножницами, если необходимо. Осторожно, чтобы не сжимать и сенсорный кластер сумку клетка слишком много в этом процессе.
- Когда большинство из соединительной ткани удаляются, передача бА. Г. клетка кластера в новых рабочих блюдо с желтым кончиком согнуты подготовленных ранее. Будьте осторожны и не позволяйте кластера сумку Cell BE в ловушке внутри желтый наконечник или застряли на воздух / среда.
- Измельченного в порошок кластера с желтым кончиком, чтобы удалить отдельные клетки сумку. Сделайте это с помощью пипетки кластера в и из наконечника. Начните с низкой силы сдвига и увеличение силы по мере необходимости. Всегда используйте самую низкую усилие, необходимое для удаления нейронов, не убивая слишком много ячеек.
- Сбор 3-5 здоровых клеток мешок и передавать их на блюдо с поли-лизин покрытием покровное. Избегайте поднимая мертвых клеток (они черный / прозрачный в центре) и соединительной ткани мусора.
- Повторите шаг 6. и место около 15-25 живых нейронов в центре каждого покровное. Если мертвые клетки и мусор передаются, а также, удалить нежелательные материалы, подняв его вверх или взорвать его от здоровых клеток. Этот процесс занимает около 2-3 часов для обоих кластеров.
- После завершения сохранить культуру блюда на поток скамейке не менее 2 часов при комнатной температуре, чтобы клетки приложить (держать поток вентилятор от скамьи, чтобы избежать нежелательной вибрации).
- Место блюда в инкубаторе при 14 ° С в течение ночи, или до последующего использования. Рост конусов может развиться через 4-10 часов.
Рисунок 1. Схема Aplysia californica брюшного ганглия. Цвет линии показывают, где резать, чтобы получить кластеры сумку клетки.
День 3: Настройка камеры для живого изображения клеток Aplysia сумки
Ассамблея изображения камеры
- Перед тем как использовать сумку для живых клетках экспериментов визуализации ячейки, осмотрите клеток на низких микроскопом власти. Если клетки не разработали здорового конусы роста, поставки свежей среды и оставить при комнатной температуре в течение 1-2 часов.
- Для питания пластин свежей средой L15-ASW, удалить половину (~ 2 мл) старого среде с вакуумной линии, а также добавить 2 мл новых L15-ASW среды в чашке Петри. Это важно не для полного удаления всех среды от блюдо сразу, так как это удалить клетки покровного стекла.
- Для сумку изображений клетки, мы собираем два покровных и две пластиковые прокладки в сэндвич-подобные изображения камеры. Верхнего покровного в сэндвич разрезают короче, что позволяет легко обмениваться среднего и реагентов. Во время сборки, покровные клетки с сумкой прилагается должны быть погружены в L15-ASW среду во все времена, чтобы предотвратить смещение клетки.
- Для подготовки камеры, отрезали ~ 2 мм от правой части № 1 покровные 22x22 мм с алмазным пером (стеклорез) и правителя.
- Использование 1 мл шприцев, применять высокие смазки вакуумного двум сторонам короче покровного и прикрепите пластиковые прокладки в каждую сторону. Применение вакуумной смазки на вершину и распорки.
- Обратить покровное и дистанционных собраний, и поместить в чашку Петри содержащие сумку клеток на покровного стекла. Выравнивание и слегка придавить, чтобы придерживаться верхнего покровного вниз покровное с обратного конца двух Q-подсказки.
- Использование щипцов, осторожно поднимите сэндвич сборки из чашки Петри без средой утечки. Совместите два покровных, при необходимости, и вытрите избыток среды с Kimwipe. Место сэндвича на нижнюю часть держателя слайдов микроскоп и приложите крышку медицинской помощи с помощью зажимов.
- Чистая центре верхней части бутерброд с Q-советы вонзилась в жидкости для чистки стекла (Искра используется как чистящее средство для стекла). Быстро высушить для чистки стекол со второй, сухой Q-Tip, чтобы избежать полоса линий. Сделайте то же самое для нижнего покровного. Чистая покровные полосы свободны от линии имеют важное значение для качества снимков.
Сумка клеток на микроскоп
С Aplysia сумку ячейки нейронов культуры при низкой плотности, лучше всего, если ваш микроскоп установка имеет этапе позиционирования функций с целью облегчения переключения между ячейками. Сумка клетки могут быть легко хранится при комнатной температуре в течение нескольких часов на сцене во время съемки экспериментов. Биржа среду периодически, чтобы избежать испарения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aplysia нейронов сумку ячейки обеспечивают бессывороточной нейронной системе культуры клеток с очень немногими без нервных клеток. Эти нейроны образуют очень большого роста конусов подходящий для решения ряда важных биологических ячейки вопросы. Нейронов сумка клетка может легко манипулировать и отображаемого при комнатной температуре в течение нескольких часов. С помощью флуоресцентной микроскопии Спекл (ФШМ), можно количественно анализировать различные параметры F-актин и полимеризации микротрубочек и транслокации динамики. Эти инструменты визуализации вместе с недавно выпущенной Aplysia геноме информации, а также более совершенные методы выражения делают эти нейроны мощная система модель для изучения молекулярных и клеточных механизмов нейронных моторики конуса роста и руководство.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Райан Maneri (кулик-сорока Productions, LLC) для съемок нашего процедуры и Родни Макфейл (Отделение биологических наук, Purdue University) за помощь в редактировании видео вскрытия. Исследования в Suter лаборатории поддержана грантами NIH (R01 NS049233) и Bindley Bioscience центр в Университете Пердью в СУД
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 glass coverslips 22x22 mm | Tool | VWR international | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22x22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | EMD Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts, Inc. | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington Biochemical | LS02111 |
References
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
