Summary
Aplysia californica neurones de développer des cônes de croissance important dans la culture qui sont excellents pour l'imagerie haute résolution de la motilité du cône de croissance et d'orientation. Ici, nous présentons un protocole pour la dissection et le placage de neurones cellulaires aplysie sac ainsi que pour la mise en place d'une chambre pour l'imagerie de cellules vivantes.
Abstract
Cônes de croissance neuronale sont les structures très mobiles à la pointe des axones qui peut détecter des signaux de guidage dans l'environnement et transduire cette information dans le mouvement directionnel vers la cellule cible appropriée. Pour bien comprendre comment les informations de guidage est transmis de la surface de la cellule à l'dynamique sous-jacente des réseaux du cytosquelette, on a besoin d'un système modèle approprié pour l'imagerie de cellules vivantes de la dynamique des protéines à résolution temporelle et spatiale élevée. Typiques des cônes de croissance de vertébrés sont trop petits pour analyser quantitativement F-actine et la dynamique des microtubules. Les neurones de la californica lièvre de mer Aplysia sont 5-10 fois plus grandes que les neurones des vertébrés, peuvent facilement être conservés à température ambiante et sont des cellules très robuste pour la micromanipulation et de mesures biophysiques. Leurs cônes de croissance ont de très défini régions cytoplasmiques et d'un système bien décrit cytosquelette. Les corps cellulaires des neurones peut être microinjectés avec une variété de sondes pour étudier la motilité du cône de croissance et d'orientation. Dans le présent protocole, nous démontrons une procédure pour la dissection du ganglion abdominal, la culture cellulaire des neurones sac et mise en place d'une chambre d'imagerie pour l'imagerie de cellules vivantes des cônes de croissance.
Protocol
Solutions
- L15-ASW milieu de culture cellulaire (1L)
- 1 sachet de poudre à L15
- Ajouter 800 ml de H 2 O ultrapure
- NaCl 400 mM
- MgSO 4 27 mM
- MgCl 2 28 mM
- L-Glutamine 4 mM
- Gentamicine 50 pg / ml
- HEPES 5 mM
- Ajuster le pH à 7,9
- Ajouter goutte à goutte CaCl2 9,3 mM (arrêt si précipités)
- Ajouter H 2 O ultrapure à 1 l
- Vérifiez osmolarité (950-1000 mmol / kg) avec osmomètre (pression de vapeur, Wescor # 5520)
- Filtre 0,22 um en utilisant une unité de filtration à pression positive (Filtres: SVGV010RS Millipore)
- Conserver à 4 ° C jusqu'à un mois
- Poly-L-lysine (70-150 kD) 200 pg / ml en solution stock stériles H 2 O ultrapure conservés à -20 o C
- 0,5 M solution de MgCl2
Jour 1: Dissection de l'aplysie ganglion abdominal
Préparation de la solution enzymatique de dissociation
- Peser 90-10 mg de Dispase enzyme (Worthington, Cat: LS02111) dans un tube Eppendorf
- Ajouter 900 pi de L15-ASW milieu de culture, et 100 pi de stériles H 2 O ultrapure
- Mélanger et placer à température ambiante (RT)
Dissection de ganglion abdominal
- Remplir une seringue de 50 ml avec 0,5 M de solution de MgCl2.
- Prendre un animal de réservoir, la poignée doucement pour éviter de réponse animal encrage de la défense.
- Placez le aplysie sur le côté sur une planche à dissection (styromousse bord), côté rostrale à la droite, côté caudale vers la gauche.
- Insérez l'aiguille dans les animaux juste derrière la tête et injecter toutes les solution de MgCl2 dans la cavité du corps.
- Frottez doucement l'animal pour disperser la solution de MgCl2 à travers la cavité du corps, attendre quelques minutes pour que l'animal soit complètement anesthésiés.
- Epingler la tête et la queue de l'animal au conseil d'administration de dissection avec deux aiguilles.
- Utilisez une pince pour soulever la peau, couper à travers la peau et la couche musculaire avec de grands ciseaux vers la tête et la queue pour faire une grande ouverture sur le côté.
- Trouvez le ganglion abdominale sous l'ovaire forme de brosse. Utilisez une pince pour tenir les nerfs reliant environ 1 cm en avant du ganglion abdominal, couper les nerfs avec des ciseaux de dissection en avant de la position Davier et derrière le ganglion abdominal.
- Ganglionnaires Placer dans la solution Dispase et incuber pour 15-16 h à 22 ° C en utilisant un bain d'eau à température contrôlée.
Jour 2: Placage de cellules sac aplysie
Préparation poly-lysine lamelles
- Dans un banc de flux, préparer trois boîtes de Pétri de 35mm que le travail des plats pour la dissection du ganglion, les remplir avec 4 ml L15-ASW moyenne chacun. Transfert du ganglion abdominal de la solution de dispase à l'un des plats ouvrables après 15,5 heures de digestion.
- En utilisant des pinces de prendre nettoyés à l'acide # 1.5 lamelles (22x22 mm) conservés dans l'éthanol, enlever l'alcool et de stériliser des lamelles en les flamboyants brièvement sur un bec Bunsen. Laissez-les refroidir avant de placer brièvement les lamelles dans les boîtes de culture.
- Préparer une astuce bordé courbe en pliant un bout jaune sur le brûleur Bunsen (flamme que brièvement pour éviter la fusion du plastique!).
- Préparer la quantité appropriée de 20 ug / ml de poly-lysine solution en diluant 200 pg / ml de solution concentrée avec des stériles H 2 O ultrapure.
- Couvrir chaque lamelle avec 500 ul de 20 ug / ml de poly-lysine et incuber pendant 20 min à température ambiante.
- Laver chaque lamelle 3-5 fois avec 500 pl stériles H 2 O ultrapure chacun.
- Enlevez l'eau de lamelles, remplissez chaque plat avec 4 ml de milieu de culture L15-ASW.
La dissociation des cellules sac
- Sous un microscope de dissection, couper le ganglion abdominal de moitié des ciseaux et des pinces à dissection à l'aide préalablement nettoyé avec de l'éthanol à 95% (figure 1 ligne 1).
- Sur une moitié du ganglion, coupé entre la grappe de cellules sac et les cellules hemiganglion (figure 1 ligne 2), et couper les extensions nerveuses restantes de l'autre côté du sac de cellules (figure 1 ligne 3). Travailler sur une moitié du ganglion à un moment, laisser l'autre moitié dans le plat alors que les cellules du premier groupe sont plaqués.
- En utilisant deux pinces (ou une pince et des ciseaux de dissection), pôle de la cellule communiqué sac en écartant la gaine de tissu conjonctif qui entoure la grappe des piles à sac. Coupez le tissu conjonctif avec des ciseaux de dissection, si nécessaire. Attention à ne pas presser et toucher la grappe des piles à sac de trop pendant ce processus.
- Quand la plupart des tissus conjonctifs est enlevé, le transfert de la bgrappe des piles ag dans un nouveau plat de travailler avec le bout plié jaune préparée plus tôt. Soyez prudent de ne pas laisser l'amas de cellules valise soit emprisonné à l'intérieur de la pointe jaune ou coincés à l'interface air / support.
- Triturer le cluster avec pointe jaune pour éliminer les cellules sac individuel. Pour ce faire, le cluster de pipetage dans et hors de la pointe. Commencez avec de faibles forces de cisaillement et d'augmenter la force si nécessaire. Toujours utiliser le plus bas force nécessaire pour retirer les neurones sans tuer trop de cellules.
- Recueillir 3-5 cellules saines sac et transférez-les dans un plat avec une lamelle poly-lysine. Éviter d'aspirer des cellules mortes (elles sont noires / transparentes au centre) et des débris de tissu conjonctif.
- Répétez l'étape 6. et au lieu d'environ 15-25 neurones vivants dans le centre de chaque lamelle. Si les cellules mortes ou des débris sont transférés ainsi, retirer le matériel indésirable par le ramasser ou de le souffle dans les cellules saines. Ce processus prend environ 2-3 heures pour les deux groupes.
- Une fois terminé, laisser les boîtes de culture sur le banc de débit pendant au moins 2 heures à température ambiante pour permettre aux cellules de joindre (garder banc de flux de soufflerie pour éviter les vibrations hors indésirables).
- Placez les plats dans un incubateur à 14 ° C pendant la nuit, ou jusqu'à une utilisation ultérieure. Cônes de croissance peut se développer dans 4-10 heures.
Figure 1. Schéma d'Aplysia californica ganglion abdominal. Couleur des lignes indiquent où couper pour obtenir des amas de cellules sac.
Jour 3: Mise en place de chambre pour l'imagerie des cellules vivantes sac aplysie
Assemblée de l'imagerie de chambre
- Avant d'utiliser les cellules sac pour vivre des expériences d'imagerie cellulaire, d'inspecter les cellules sur un microscope de faible puissance. Si les cellules n'ont pas développé les cônes de croissance saine, l'approvisionnement en milieu frais et laisser à température ambiante pendant 1-2 heures.
- Pour alimenter plaques avec le milieu L15-ASW frais, retirer la moitié (~ 2 ml) de milieu ancienne avec une ligne vide, et ajouter 2 ml de nouveaux L15-ASW milieu par boîte de Pétri. Il est important de ne pas supprimer complètement tous les moyens de l'antenne tout à la fois, car cela élimine les cellules de la lamelle.
- Pour l'imagerie cellulaire sac, nous assembler deux lamelles et deux entretoises en plastique dans une chambre d'imagerie sandwich. La lamelle supérieure dans le sandwich est coupé plus court pour permettre un échange facile des moyennes et des réactifs. Lors du montage, des lamelles avec des cellules sac attaché doit être immergé dans L15-ASW moyenne, en tout temps pour empêcher les cellules de déloger.
- Pour préparer la chambre, coupé ~ 2mm du côté droit d'un mm lamelles # 1 22x22 avec le diamant stylo (coupe-verre) et la règle.
- En utilisant une seringue de 1 ml, appliquer de la graisse sous vide poussé à deux côtés de la plus courte lamelle, et joindre entretoises en plastique de chaque côté. Appliquer de la graisse à vide au sommet de deux entretoises.
- Inversez la lamelle et l'entretoise, puis placer en boîte de Pétri contenant des cellules sac sur une lamelle. Aligner et appuyez doucement pour coller la lamelle de haut en bas avec la lamelle la fin inversée de deux Q-tips.
- En utilisant des pinces, soulever délicatement assemblage en sandwich de la boîte de Pétri, sans le support fuite. Alignez les deux lamelles, si nécessaire, et essuyez l'excédent avec un support Kimwipe. Placez le sandwich sur la partie inférieure de la porte lame de microscope et fixer le couvercle avec soin en utilisant des clips.
- Nettoyez le centre de la face supérieure du sandwich avec Q-tips dans tamponné nettoyant à vitres (Sparkle est utilisé comme nettoyant pour vitres). Vite sécher le nettoyant à vitre avec une seconde, coton tige sec pour éviter les lignes série. Faites de même pour la lamelle du bas. Nettoyer sans lamelles de lignes série sont importants pour l'imagerie de haute qualité.
Sac cellules au microscope
Puisque les cultures de cellules aplysie sac de neurones sont à faible densité, il est préférable si votre configuration de microscope est doté de fonctions de positionnement scène pour faciliter le passage entre les cellules. Sac cellules peut être facilement conservé à température ambiante pendant plusieurs heures sur scène lors des expériences d'imagerie. Bourse à moyen périodiquement pour éviter l'évaporation.
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Discussion
Aplysie neurones cellulaires sac fournir un milieu sans sérum système neuronal de culture cellulaire avec très peu de cellules non-neuronales. Ces neurones forment des cônes de croissance très grand approprié pour aborder un certain nombre de questions importantes de cellules biologiques. Neurones cellulaires sac peut être facilement manipulé et imagée à la température ambiante pendant plusieurs heures. Utiliser fluorescent chatoiement de microscopie (FSM), on peut analyser quantitativement les différents paramètres de F-actine et la polymérisation des microtubules et la dynamique de la translocation. Ces outils d'imagerie ainsi que les informations récemment publié aplysie génome ainsi que les techniques d'expression améliorée rendre ces neurones d'un système puissant modèle pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires de la motilité de croissance neuronale cône et d'orientation.
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Acknowledgments
Nous tenons à remercier Ryan Maneri (Productions Huîtrier, LLC) pour le tournage de notre procédure et Rodney McPhail (Département des sciences biologiques, Université de Purdue) pour l'aide à l'édition de la vidéo de dissection. La recherche dans le laboratoire de Suter est soutenu par des subventions du NIH (R01 NS049233) et le Centre Bindley Bioscience à l'Université Purdue à DMS
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| #1 glass coverslips 22x22 mm | Tool | VWR international | 48366067 | |
| #1.5 glass coverslips 22x22 mm | Tool | Corning | 2870-22 | |
| 35 mm Petri dishes | Tool | Falcon BD | 353001 | |
| Filters for medium filtration | Tool | EMD Millipore | SVGV010RS | |
| High vacuum grease | Tool | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmometer | Tool | Wescor | 5520 | |
| Plastic shims | Tool | Small Parts, Inc. | SHSP-200 | |
| Calcium chloride | Reagent | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Gentamicin | Reagent | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4030 | |
| L15 medium | Reagent | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Reagent | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Magnesium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 5958-04 | |
| Magnesium sulfate | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Reagent | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Sodium chloride | Reagent | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581 | |
| Neutral Protease (Dispase) | Reagent | Worthington Biochemical | LS02111 |
References
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
- Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
- Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).
