Summary
Wir zeigen, dass die Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) die Beweglichkeit der neuralen Stammzellen (NSCs) unter Verwendung eines neuartigen Agarosegel basierten mikrofluidischen Gerät verbessert. Diese Technologie kann ohne weiteres auf andere Säugetierzellen Systeme, bei denen Zellen Quellen sind rar, wie menschliche neurale Stammzellen, und die Umdrehung um Zeit ist von entscheidender Bedeutung.
Abstract
Während Mikrofluidik-Technologie erreicht einen neuen Grad der Reife für makromolekulare Assays sind zell-basierte Assays noch in den Kinderschuhen Stufe 1. Dies ist vor allem wegen der Schwierigkeit, mit denen man eine Zelle-kompatibel und stabil Mikroumgebung mit herkömmlichen Mikrofabrikation Techniken und Materialien zu erstellen. Wir lösen dieses Problem durch die Einführung eines neuartige Mikro-Material, Agarosegel, als Basismaterial für die Mikrofluidik-Gerät. Agarose-Gel ist sehr formbar und gas-und Nährstoffe, die für das Überleben der Zelle und somit ein ideales Material für zell-basierte Assays. Wir haben früher die Agarosegel-basierte Geräte wurden bei der Untersuchung von Bakterien und neutrophilen Zellwanderung 2 erfolgreichen gezeigt. In diesem Bericht werden drei parallel mikrofluidischen Kanälen in einem Agarosegel Membran von etwa 1 mm Dicke gemustert. Constant fließt mit Medien / Puffer sind in den beiden seitlichen Kanälen mittels einer peristaltischen Pumpe aufrechterhalten. Die Zellen werden in den Center-Kanal für die Beobachtung gehalten. Da die Nährstoffe und Chemikalien in die Seitenkanäle ständig diffundieren von der Seite zu Center-Kanal, die chemische Umgebung des Center-Kanals sind, ist leicht über die Strömung entlang der seitlichen Kanälen gesteuert. Mit diesem Gerät zeigen wir, dass die Bewegung der neuralen Stammzellen optisch kann mit Leichtigkeit unter verschiedenen chemischen Bedingungen überwacht werden, und die experimentellen Ergebnisse zeigen, dass die Überexpression des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren (EGFR) die Beweglichkeit der neuralen Stammzellen erhöht. Motilität von neuralen Stammzellen ist ein wichtiger Biomarker für die Beurteilung der Zellen Aggressivität, damit tumorigenen Faktor 3. Die Entschlüsselung der zugrunde liegende Mechanismus NSC Beweglichkeit erhalten einen Einblick in beide Störungen der neuronalen Entwicklung und in Hirntumoren Stammzellen Invasion ergeben.
Protocol
Verfahren
Coating Folien mit Fibronektin
Vor der Montage der Mikrofluidikvorrichtung, sterilisieren Glasplättchen mit Fibronektin. Streichen Sie die Folien in einer biohood auf der Aufrechterhaltung der Sterilität. Richten Sie eine sterile PDMS spacer entlang der Ränder der Folie und markieren Sie die Seite, nach oben ist mit einem Permanent-Marker. 1 ml einer 5 mg / ml Lösung von Fibronektin (Sigma) im Inneren des PDMS spacer über die Gesamtheit der dem Glasträger. Lassen Sie die Dias ungestört für eine Stunde, dann vollständig trocknen mit einer N2-Pistole. Die Folien können bei 4 o C für spätere Experimente aufbewahrt werden.
Zusammenbau des Geräts
Die gesamte Vorrichtung Montage-Protokoll ist in einer biohood unter sterilen Bedingungen durchgeführt, unter Verwendung der folgenden Verfahren:
- Reinigen Sie die Silizium-Master mit den Mikrokanälen, die ihm durch Abwischen es mit 70% Ethanol und Trocknung mit dem N 2 Waffe gemustert. Legen Sie eine sterile PDMS spacer von 1 mm Höhe mit einer Pinzette in das Relief Features des Meisters.
- Bereiten Sie das Agarosegel in das Gerät durch Wiegen 0,3 g Agarose-Pulver (Fisher Scientific) und 10 ml CO verwendet 2-unabhängigen Medien (Invitrogen) in einer 50 ml-Becherglas. Rühren Sie die Mischung mit einem Spatel und Hitze in der Mikrowelle für 20 Sekunden auf HIGH. Wenn ungelöste Granulat vorhanden sind, das Gemisch für weitere 10 Sekunden und wirbeln die heiße Mischung, um loszuwerden, die letzten verbliebenen Körner. Wiederholen Sie den Vorgang mit einer Aufheizzeit von 8 Sekunden, und dann 5 Sekunden.
- Schnell gießen Sie die Agarose-Lösung auf die Silizium-Master durch die PDMS spacer umgeben und sofort Deckung der Agarose-Gemisch mit einem sterilen Objektträger aus Glas. Tragen Sie einen konstanten, sanften Druck auf die Folie für ca. 2 Minuten, um sicherzustellen, dass die Agarose wird Gel auf die gleiche konstante 1 mm Höhe wie die PDMS spacer.
- Nach dem Agarosegelen, Abziehen der gemusterten Agarosegel mit dem PDMS spacer aus dem Silizium-Master und den Transfer zu einem Fibronektin beschichteten Objektträger mit den Mikrokanälen im Agarosegel vor der Folie. Verwenden Sie eine 16-Gauge-Kanüle, um Löcher in das Reservoir Regionen der Mikrokanäle für Ein-und Auslass greift Punsch. Add 500 ul der CO 2-unabhängigen Medien, die gemusterten Agarosegel auf der Folie, um ein Austrocknen der Mikrokanäle zu verhindern.
- Waschen Sie den Acryl-Verteiler in das Gerät mit 70% Ethanol verwendet und gründlich mit VE-Wasser. Richten Sie die Löcher in den Verteiler mit den Löchern in den Agarosegel mit den Mikrokanälen gestanzt. Dann richten Sie den Verteiler mit dem Gel, PDMS Spacer und das Fibronektin Folie mit dem Metallrahmen des Gerätes. Bringen Sie die Schrauben in das Gerät und ziehen Sie den Punkt des Widerstands mit einem Schraubendreher. Dies geschieht, um sicherzustellen, dass das Gerät nicht, um das Ausmaß der Verformung der Mikrokanäle in die Agarose zu stark angezogen. Ziehen Sie die Schrauben im Uhrzeigersinn, um sicherzustellen, dass das Gel im Inneren des Gerätes nicht verschiebt. Testen Sie das Gerät auf Undichtigkeiten und Verstopfungen in den Mikrokanälen mit einem 1ml Spritze. Die Spritze ist mit Tygon-Schlauch mit einem Gel-loading Pipettenspitze am Ende des Rohres angebracht, um CO 2-unabhängigen Medien in den Mikrokanälen zu injizieren. Ein Mikrokanal ist erfolgreich gebildet, wenn Medien beobachtet wird, nur aus der Steckdose des Mikrokanals verlassen, wenn Medien in die entsprechenden Einlass injiziert wird. Jetzt ist das Gerät einsatzbereit.
Vorbereitung und Aussaat der Zellen in das Gerät
Wenn die Zellen 70% Konfluenz (Zelldichte etwa 100.000 Zellen / ml) zu erreichen, sind sie bereit, in das Gerät ausgesät werden.
Vorbehaltlich der Zellen zu zwei DPBS (Invitrogen) wäscht. Geben Sie 200 ul von Trypsin-EDTA (Invitrogen), um die Zellen zu lösen. Übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit 5 ml M2 serumhaltigen, um das Trypsin zu inaktivieren. Zentrifugiert das Wachstum Medien mit den Zellen bei 1000 rpm für 5 Minuten. Abgesaugt Überstand und das Pellet von Zellen mit 5 ml DPBS. Zentrifugieren Sie die DPBS Zellen wieder unter den gleichen Bedingungen. Abgesaugt Überstand wieder, und das Pellet der Zelle in 500 ul der CO 2-unabhängige Medien.
Seed resultierenden Suspension von Zellen in der Mitte Mikrokanal des Geräts über die Schwerkraft angetriebene Strömung. Fügen Sie die Ein-und Auslass des Zentrums Mikrokanal mit 60 ul der Zellsuspension und 20 ul CO 2-unabhängige Medium bzw.. Beachten Sie die Mitte Mikrokanal unter einem Hellfeld-Mikroskopie für die Zelladhäsion zu suchen. Die Zellen in der Regel nach 10 Minuten zu halten. Nachdem die Zellen, um den Kanal unten bei einer richtigen Dichte haften, pipettiert die restlichen Zellsuspension in den Einlass und den Medien in der Steckdose. Legen Sie 60 ul CO 2-unabhängigen Medien in beiden Ein-und Auslass des Center-Kanals. Legen Sie PDMS umfasst über the-Center Ein-und Auslass zu minimieren Verdunstung von Medien aus dem Center-Kanal.
Imaging der Zellen in das Gerät
Vor der Montage der Vorrichtung, Gewinde der sterile Schlauch-Schlauch durch die Wetterstation des Mikroskops (Olympus X81) und schließen mit der Schlauchpumpe (Watson-Marlow 205U/CA). Flush PBS durch den Schlauch mit einer Rate von 4 RPM. Nach der Montage des Gerätes, bereiten geeigneten Konzentrationen des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) (Sigma)-Lösungen in der CO 2-unabhängigen Medien in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. Vortex die EGF-Lösungen für 5 Sekunden und schließen mit dem Schlauch. Verbinden Sie die Schläuche mit entsprechenden EGF-Konzentrationen auf das Gerät markiert. Es dauert etwa eine Stunde für den EGF über den Kanal Grat diffundieren und einen stetigen chemischen Gradienten.
Ein Imaging-Software, Slidebook, wird verwendet, um eine Reihe von Bildern in alle 10 Minuten für ca. 5 Stunden in einem experimentellen Lauf zu nehmen. Die xy automatisierte Bühne ist so programmiert, dass zwei Teilbereiche (jeweils mit einer Fläche von 400μm x400μm) des gleichen Center-Kanal, und insgesamt drei Center-Kanäle zu einem bestimmten Zeitpunkt abgebildet werden. Zellen in verschiedenen Center-Kanäle (in der Regel 3 in einem Lauf) haben unterschiedliche EGF-Konzentrationen, wie auf dem Schlauch markiert.
Materialien und Geräte
Zelllinien: C17.2 Zellen NSCs aus dem externen Keimblattes der postnatalen Kleinhirn der Maus 6, 7 abgeleitet. Mit Hilfe dieser Zelllinie, haben wir zwei andere Mäuse-Stammzellen-Linien mit Retrovirus Transfektion Methode entwickelt. Diese beiden stabil transfizierter Zelllinien sind (1) wtEGFR -, dass über-Ausdruck der menschlichen Wildtyp-EGFR, und (2) ΔEGFR - das ist eine konstitutiv aktive EGFR-Mutante. Zur Erleichterung der Erkennung führen Retroviren ein Rückgrat mit dem Gen von Interesse durch eine interne Website für ribosomalen Bindungsstellen (IRES) und dem grün fluoreszierenden Protein (GFP) gefolgt.
Zellkultur: Die Maus C17.2 NSCs und deren Varianten wurden in einer 6-Well-Platte in M2-Medium (DMEM (Invitrogen) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Invitrogen), 5% Pferdeserum (HS) (Invitrogen gewachsen ) und 1% Penicillin / Streptomycin (Invitrogen).) Zellen wurden bei 37 o C in 80% Luft und 5% CO 2 gehalten.
Mikrofluidik-Gerät: Ein Kunststoff-Verteiler, ein PDMS spacer und einem Edelstahl-Rahmen zur Aufnahme des Gerätes in Kraft.
Imaging
Eine invertierte Fluoreszenzmikroskop (Olympus IX-81) verwendet wird, in Verbindung mit einer intensivierten CCD-Kamera (Orca, Hamamatsu). Die mikrofluidischen Gerät basiert auf einer automatisierten xyz Bühne montiert, und die Bühne wird von einer Klimakammer, die eine Temperatur von 37 o C. unterhält eingeschlossen Es gibt in der Regel 3-4 Geräte auf dem gleichen Chip, die zur gleichen Zeitpunkt mit dem automatisierten xyz Bühne gefilmt werden.
Flow-Pflege
Eine peristaltische Pumpe mit 8 parallelen Linien (Watson-Marlow 205U/CA) auto wird verwendet, um Strömungen in allen Sink-und Source-Kanäle zu erhalten.
Abb.. 1 Motilität von drei NSC-Stämme (Eltern, wtEGFR und D EGFR) in verschiedenen Konzentrationen EGF Alle Bahnen sind von der Verfolgung einen Film von 5 Stunden (mit Ausnahme von wtEGF 100ng/ml, 4 Stunden) genommen, und der Ursprung aller Tracks wurden neu auf (0,0) zu Vergleichszwecken.
Abb.. 2 Korrelation von EGFR Expression und Motilität (a) zwei Bilder wtEGF NSCs auf der Oberfläche eines mikrofluidischen Kanal mit 100ng/ml EGF. Das linke Bild ist ein Fluoreszenzbild und das Recht ist eine Übertragung Hellfeldbild. Der Maßstab ist 100 um, und die Kanalbreite 400 um. Die Zellen werden in zwei Populationen von der Helligkeit der GFP zum Ausdruck getrennt. Cells in den blauen Kreisen Dimmer sind, haben somit weniger EGFR-Expression Ebene; und Zellen in roten Kreise sind brigher, haben also höhere EGFR-Expression auf. (B) Trajektorien von Zellen mit niedriger und hoher EGFR-Expression auf. Diese Bahnen sind von einem 4 Stunden langen Film übernommen.
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Discussion
Abb.. 1 zeigt Trajektorien von drei NSC-Stämme, die elterliche Zellen, die wtEGFR und die ΔEGFR (Kontrolle). Jeder Satz von Trajektorien wurden aus einer 5 Stunden langen Film erhalten. Für Eltern Zellen, erreichte Zellbewegung bei EGF-Konzentration betrug ~ 10ng/ml; für wtEGFR Zellen verschoben Zellmotilität Spitze 100ng/ml oder höher; für ΔEGFR Zellen wurde die Zellbewegung unabhängig von EGF-Konzentration wie erwartet.
Die wtEGF Zellen mit 100ng/ml waren die beweglichen Zellen, zogen sie etwa 1,5 mal schneller als der elterlichen Zellen mit 10ng/ml. Dies deutet darauf hin, dass (1) Überexpression von EGFR erhöht Zellen Motilität, (2) die Anzahl der EGF-Ligand-Rezeptor-biding Ereignisse hat einen direkten Einfluss auf die Zellbewegung. ΔEGFR Zelllinie ist eine konstitutiv aktive EGFR-Mutante. Diese Mutante erscheint in ~ 60% der menschlichen Glioblastom. Es hat eine verkürzte extrazelluläre Domäne, die eine konstitutive aktive Liganden-unabhängige Kinase wird. Die Intensität der Autophosphorylierung ist klein (ca. 10%), verglichen mit Liganden aktiviert Wildtyp-EGFR (wtEGFR) 4. Dieser zugrunde liegt die Beobachtung, dass ΔEGF Zellen etwas höher als die Motilität der Eltern und wtEGFR (in Abwesenheit von EGF), aber die Beweglichkeit ist immer eine Konstante in verschiedenen EGF-Konzentrationen.
Da die wtEGFR Zellen durchgeführt gleichen Kopien von GFP (grün fluoreszierendes Protein) und EGFR, zeigen die Fluoreszenz-Intensität des wtEGFR Zellen der EGFR-Expression Ebenen. Dies ermöglicht uns eine direkte Korrelation der EGFR-Protein Expression (grün fluoreszierendes Intensität) mit der Zellbewegung. Abb.. 2 zeigt die Bahnen von zwei Zell-Population, die Zellen in roten Kreis heller sind, so hat eine höhere EGFR-Expression auf, und die Zellen in blauen Kreis sind Abendessen, damit eine geringere EGFR-Expression auf. Die Ergebnisse belegen erneut, dass je höher die EGFR-Expression Level, desto mehr beweglich sind diese Zellen.
Traditionell ist die Beweglichkeit der NSCs wurde bestimmt mit einem Boyden-Kammer-Assay, wobei der Anteil der Zellen wandern durch eine Membran 5 ausgewertet wird. Dies ist eine bevölkerungsbezogene Assay, wo das Verhalten der Zelle nicht beurteilt werden kann individuell eingestellt werden. Die mikrofluidischen hier gezeigte Vorrichtung eine Chance zu Zelle Bewegung in einer einzigen Zelle Ebene zu studieren, und in einer gut kontrollierten chemischen Umgebung. Er erlaubt es, zum ersten Mal, eine direkte Korrelation der EGFR-Protein-Expression Ebene mit den NSCs Motilität Phänotyp in lebenden Zellen. Die geringe Größe des Gerätes ist besonders nützlich für Experimente, bei denen Zellen sind begrenzt, wie die menschlichen Stammzellen.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wird von der New York State Office of Science, Technology and Academic Research (NYSTAR) (in Form eines Center for Advanced Technology gewähren) und durch Zuschüsse aus dem Nanobiotechnologie Center (NBTC), eine STC-Programm der Nationalen unterstützt Science Foundation unter Vertrag Nr. ECS-9876771 und dem amerikanischen Brain Tumor Association und der New York Academy of Medicine (JAB).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1356-500 |
References
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- Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).
- Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer. Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).
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