Summary
分子成像技术在干细胞疗法的兴趣与日俱增，是理想的监测干细胞移植后的行为。荧光素酶基因已启用非侵入性，重复评估细胞的存活，位置，并在体内扩散。本视频将演示如何跟踪生活在一个小鼠胚胎干细胞增殖。
Abstract
人类胚胎干细胞（胚胎干细胞）的发现大大增加了在再生医学感兴趣的医学科学家可用的工具。然而，直接注射胚胎干细胞，并从人类胚胎干细胞分化的细胞进入生物体，迄今已阻碍了显着的细胞死亡，畸胎瘤的形成，与宿主的免疫排斥反应。了解在体内的人类胚胎干细胞移植后行为，需要新的成像技术的纵向监测人类胚胎干细胞的本地化，增殖和活力。分子成像已发出超过体内细胞的增殖天，星期，甚至几个月的跟踪调查一个高通量，价格低廉，而敏感的手段。这种进步已经大大提高了人类胚胎干细胞植入，增殖和生活科目的畸胎瘤形成的时空动力学的理解。
分子成像中的一个重大进步，已经从分子和细胞生物学的无创性的记者基因检测在体内的多模态成像平台的延伸。这些记者的基因，控制工程的推动者和促进剂，利用宿主细胞转录机制的优势下，引入使用各种向量和非向量方法的细胞。一旦在细胞中，记者的基因可以被转录组成或只在特定的生物或细胞的条件，对启动子的类型而定。成具有生物活性的蛋白质，记者基因的转录和翻译是那么敏感的，非侵入性的仪器使用探针信号产生的D -荧光素等（例如，CCD摄像头）检测。
为了避免兴奋的光需要跟踪干细胞在体内荧光成像，生物发光报告基因成像系统的要求只是一个外生管理探针诱导光发射。萤火虫荧光素酶，从萤火虫Photinus pyralis的，编码一种酶，它催化D -荧光素的光学活性的代谢产物，oxyluciferin。光学活性，然后可以与外部的CCD摄像头监视。稳定转染细胞进行的记者在他们的染色体DNA的构造，将通过记者构造子细胞的DNA，使人类胚胎干细胞在体内的生存和扩散的纵向监测。此外，记者基因产物的表达，因为信号产生所需，将创建唯一可行的父母和女儿细胞生物发光信号;凋亡或死亡的细胞不会。
在这个视频，跟踪干细胞的增殖和畸胎瘤的形成与生物发光成像所需的具体材料和方法进行说明。
Protocol
- 建设双融合报告基因
- 为了进行人类胚胎干细胞的生物发光成像，你首先需要获得稳定表达如像泛素或EF1a构推动者驱动的萤火虫荧光素酶的荧光素酶记者基因的细胞。
- 本协议的重点是对报告基因的应用，所以这里不提供详细的程序。然而，我们实验室的总体战略是使用双重融合构建载体，包含萤火虫荧光素酶（fluc）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）间隔内pCDNA 3.1 +分隔。
- 简而言之，我们的双融合基因原位于下游pCDNA 3.1巨细胞病毒启动子（+），所以用NdeI和NotI消化，平端结扎成多个克隆网站的自我失活（单3.3 kbp的片段被切除）慢病毒载体，一个Ubiquitin启动的控制之下。
- 慢病毒转导
- 人类胚胎干细胞可转通过后3-5天，在感染复数（MOI），10（约107 106个细胞培养的病毒滴度）。
- 解冻病毒的股票，可以直接添加到新鲜的胚胎干细胞媒体。
- 刷新媒体12日和24小时后。
- 48 h后，转染效率可以通过使用荧光显微镜定性评估。随后，流式细胞仪可用于隔离受感染的细胞。
- 培养人类胚胎干细胞，并介绍到影像设置
- 文化在您的荧光素酶的积极人类胚胎干细胞的馈线自由的条件。我们通常遵循的标准WiCell协议，并使用6孔板，生长因子减少基质胶涂层，无论是使用空调的媒体或商业，馈线自由的媒体。
- 为了检测荧光素酶阳性细胞，你会需要有记者探头的D -荧光素已经准备好。要做到在1-1.5 ml的终浓度为45毫克/毫升的准备，等分荧光素。保持在-20 ° C的分装时不使用避免暴露在光线下和在没有存储时用纸巾覆盖。
- 为了形象化的荧光素酶阳性细胞中，我们使用IVIS 50 IVIS 200成像系统（精诺真公司，阿拉米达，CA）。后者系统包括一个集成的isoflourane器具临时麻醉的小动物和诱导室。
- 在人类胚胎干细胞的体外生物发光成像
- 体外生物发光成像，重要的是要保持无菌条件下。因此，成像系统应该是无菌的，最好是在细胞培养室。
- 成像前，取出细胞媒体，并添加刚够PBS覆盖细胞。例如，加入1ml PBS将每孔6以及含有胚胎干细胞文化的板。
- 的D -荧光素，以PBS的比例应该是1:100，所以每6孔板以及添加10μL解冻ð -荧光素。
- 等待一分钟，然后取一个形象，使用1秒的曝光时间。如果信号弱，增加曝光时间间隔，然后再试一次。
- 发光信号反映了细胞的数量，因此，关联与不同的手机号码信号，可以进行定量分析。
- 制备小鼠和注射细胞在活体成像
- 记者基因显像提供移植后几天，几周，甚至几个月，为追踪细胞的高通量，价格低廉，敏感的方法。这一点尤其重要，因为移植的干细胞通常形成畸胎瘤，是由宿主的免疫系统拒绝，或者干脆死。
- 成像在体内畸胎瘤形成的最简单的方法是注入到SCID小鼠背上的萤火虫荧光素酶报告基因的人类胚胎干细胞，表达和收购IVIS系统的发光图像。
- 当你准备好移植的细胞，用胶原酶dispase或放松的细胞，多洗几次，并暂停在1:1混合生长因子减少，基质胶和DMEM。通常情况下，我们首先冷冻的DMEM混合细胞，然后添加在基质胶。对于每个皮下注射站点，我们注入50-100 UL量在基质胶/ DMEM培养液的混合物悬浮200000细胞。可调节的细胞数，取决于您的应用程序。请记住在注射之前，一切都保持在冰上。
- 一旦细胞准备，麻醉与异氟醚流打开它放置在感应中的鼠标。 1-5分钟后，鼠标是睡着了，可以上手术台连续异氟醚。
- 由于毛皮自然自动发出荧光，并可能掩盖了发光的形象，我们将需要删除的头发从鼠标的背面。要做到这一点最简单的方法是使用一个电动剃须刀，但你也可以使用除毛凝胶。用酒精擦拭消毒皮肤之后
- 下一步，画出一个注射器在你的细胞悬液。 23日至27日表针的工作最好，因为它们不会阻塞与细胞。如果过大（<23压力表）针针道可能会离开细胞，通过它可以泄漏出一个大洞。
- 鼠标的背部皮肤下注入细胞。由于皮肤是相当宽松的，用你的拇指和食指捏，伸出你要注入的区域。只是在皮肤下注射，注意不要穿刺太深。此外，尽量保持针头从注射部位滑动，而令人沮丧的柱塞：这将防止创建一个皮肤细胞孔，通过它可以泄漏，如果您尝试再次注入。
- 注入细胞后，等待了几个小时，让鼠标唤醒和运行之前重新麻醉生物发光成像左右。这样做可以避免异氟醚的毒性。
- 移植细胞在体内的生物发光成像
- 对于整个动物生物发光成像技术，我们做的D -荧光素腹腔注射375毫克/公斤体重。称量动物在注射之前，计算用量。
- 在腹膜注入的D -荧光素，就在中线。小心不太深了，或者你可以损伤内脏。如果鼠标开始唤醒，将它早在淘汰赛中，并等待一两分钟。对小鼠，最大的生物发光，通常发生在注射后15-40分钟。
- 记住放置在成像盒磨砂黑纸，以帮助吸收由胚胎干细胞不发出任何光线。鼠标（背面朝上）放置在与异氟醚的成像室，黑纸的顶部。开始与一个10秒的曝光时间。如果信号饱和，尽量减少暴露时间;如果太弱，增加曝光。
- 一旦信号已经曝光时间优化你的鼠标，开始考虑图像的每一分钟，直到信号达到最大值。最好的做法是通过使用图像处理软件，选择“地区利益率（ROI）”，包括注射部位。通过监控每个ROI的信号强度，你可以很容易地确定信号开始下降时，表明已达到最大的信号强度。作为您的最终数据，应使用最大信号。
- 当您与您的图像满意，除去异氟醚的鼠标，并允许它唤醒在笼子里。通常情况下，鼠标应该在15分钟内醒来。
- 生物发光记者基因显像可以重复，只要每天，每周，每月，作为人类胚胎干细胞在动物生存。信号从一个发展中的畸胎瘤会成倍增加，随着时间的推移，通常在数周的顺序，作为人类胚胎干细胞开始增殖。
- 生物发光图像所需的时间当然是收购后，可能会牺牲和动物组织切片组织学用于。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
相比其他方式，如PET和MRI，生物发光有限的空间分辨率和降低组织的渗透，由于相对薄弱的发射光子的能量（2-3 EV）;，由于这些原因，迄今尚未适用于大型动物。然而，生物发光的优点是低成本，高通量，和非侵入性，使其具有很高的理想，在体内的干细胞在小动物的跟踪。非生物发光记者的基因，如PET和荧光结构，可用于荧光素酶的结合，创造一个融合记者基因，包含个别记者基因的不同的域组成。例如，本集团使用含有fluc，单体红色荧光蛋白（MRFP）融合构建，并截断单纯疱疹病毒胸苷激酶（TTK，PET报告基因）为多模态追踪小动物干细胞的行为。随着时间的推移，记者基因稳定整合可能是受基因沉默内源性的染色体机械。报告基因的基因沉默的易感性密切相关的驾驶其表达的启动子的选择。例如，巨细胞病毒启动子（PCMV）是在人类胚胎干细胞迅速沉默。我们的实验室有良好的成功与人泛素- C的启动子（丹田）驱动双融合表达，构建多个人类胚胎干细胞细胞系，并观察随着时间的推移的信号损失最小。
总之，在人类胚胎干细胞衍生的细胞再生成为临床相关，几个基本的生物障碍必须克服 - 即细胞死亡或凋亡，分化细胞的未分化的细胞，畸胎瘤的形成，由宿主生物体的免疫排斥反应的移植。这些挑战和其他挑战，突出了人类胚胎干细胞植入追踪，生存，和受体生物体内扩散的需要。分子成像技术，如萤火虫荧光素酶报告基因和超灵敏的CCD相机的发展，使非侵入性的，细胞的位置，迁移，扩散，并在体内分化的重复评估。如这些技术将有助于推动人类胚胎干细胞生物学的翻译从实验室走向临床应用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
添多伊尔博士和斯坦福大学在体内与生物发光成像援助的成像中心。同时也感谢银黄，博士分享她的技术，干细胞共同注射矩阵解。最后，感谢史蒂夫认为，博士协助兽医照顾动物。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Hyclone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | Stem Cell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth International, Inc | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | Techno Plastic Products | 92006 |
References
- Passier, R., et al. Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures. Stem Cells. 23, 772-780 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Baharvand, H., et al. Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture conditi. Int J Dev Biol. 51, 371-378 (2007).
- Schulz, T. C., et al. Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells. BMC Neurosci. 4, (2007).
- Jiang, J. Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 17, 17- (2007).
- Swijnenburg, R. J., van der Bogt, K. E. A., Sheikh, A. Y., Cao, F., Wu, J. C. Clinical hurdles for the transplantation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: role of molecular imaging. Current Opinion in Biotechnology. 18, 38-45 (2007).
- Herschman, H. R. Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions. Science. 302, 605-608 (2003).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature medicine. 4, 245-247 (1998).
- Bhaumik, S., Gambhir, S. S. Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 377-382 (2002).
- Tisi, L. C., et al. Development of a thermostable firefly luciferase. Analyica Chimica Acta. 457, 115-123 (2002).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67, 3085-3093 (2007).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. . Circulation. 113, 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation. Cloning and Stem Cells. 9, 107-117 (2007).
- Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Wu, J. C., et al. Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells. Proteomics. 6, 6234-6249 (2006).
- Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnol Prog. 22, 825-834 (2006).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-Level Sustained Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Using Lentiviral Vectors. Stem Cells. 21, 111-117 (2003).
- Menendez, P., Wang, L., Chadwick, K., Li, L., Bhatia, M. Retroviral transduction of hematopoietic cells differentiated from human embryonic stem cell-derived CD45(neg)PFV hemogenic precursors. Molecular therapy. 10, 1109-1120 (2004).
- Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem cells. 26, 119-126 (2008).
- Liew, C. -G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell. , Forthcoming.
