Summary
С ростом интереса к терапии стволовыми клетками, молекулярные методы визуализации, которые идеально подходят для мониторинга поведения стволовых клеток после трансплантации. Люциферазы гены репортер позволили неинвазивным, повторяющейся оценки выживаемости клеток, расположение и распространение в естественных условиях. Это видео будет показано, как отслеживать чЭСК распространение в живой мыши.
Protocol
- Строительство Дважды Гена Reporter Fusion
- В целях выполнения биолюминесценции изображений человеческих эмбриональных стволовых клеток, в первую очередь необходимо получить клетки, которые стабильно выразить гена люциферазы репортер, таких как люциферазы светляков обусловлен конститутивного промотора, как Убиквитин или EF1a.
- В центре внимания этого протокола по применению гена-репортера, так что детальные процедуры не предусмотрены здесь. Тем не менее, общая стратегия нашей лаборатории заключается в использовании двойной вектор построить сплав, который содержит люциферазы светляков (флуктуации) и расширения зеленого флуоресцентного белка (EGFP), разделенных спейсером в pCDNA 3.1 +.
- Короче говоря, наш двойной слияния генов первоначально находился ниже по течению от цитомегаловируса промотора в pCDNA 3.1 (+), так что 3,3 т.п.н. фрагмент был вырезан использованием NdeI и NotI пищеварения и тупой конец лигируют сайт множественного клонирования само-инактивации (SIN ) лентивирусов вектор, под контролем Убиквитин промоутера.
- Лентивирусов трансдукция
- ЭСК может быть трансдуцированных 3-5 дней после прохода в множественности заражения (МВД) из 10 (вирусный титр приблизительно 107 инкубировали с 106 клеток).
- Талой вирусной акции могут быть добавлены непосредственно на свежий СМИ чЭСК.
- Обновить СМИ 12 и 24 часов спустя.
- Через 48 ч, трансдукция эффективность может качественно оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии. Впоследствии, FACS могут быть использованы для изоляции инфицированных клеток.
- Культивирование ЭСК и Знакомство с изображениями Настройка
- Культура вашей люциферазы положительные ЭСК в фидерных свободных условиях. Мы обычно следуют стандартному протоколу WiCell и использование 6-луночных покрытием в фактор роста снижается Матригель, используя либо условный СМИ или коммерческих, фидерных свободных средств массовой информации.
- Для обнаружения люциферазы положительных клеток, то вы должны будете иметь репортер зонда D-люциферин уже подготовлены. Для этого аликвоту люциферин в 1-1,5 мл препаратов при конечной концентрации 45 мг / мл. Держите аликвоты при -20 ° С, когда не используется, и избегать воздействия света покрытие с бумажным полотенцем, когда он не в хранилище.
- Для того, чтобы визуализировать люциферазы положительных клеток, мы используем ИВИС 50 и ИВИС 200 Imaging Systems (Xenogen Corporation, Аламеда, штат Калифорния). Последняя система включает в себя интегрированный isoflourane аппарата и индукции камеры для временного наркоза у мелких животных.
- В пробирке биолюминесценции изображений ЭСК
- Для обработки изображений биолюминесценции пробирке, очень важно для поддержания стерильных условиях. Таким образом, процесс создания образа системы должны быть стерильными, желательно в комнатной культуре клеток.
- Перед изображения, удалить ячейки медиа и добавьте только достаточно, чтобы покрыть PBS клетки. Например, добавьте 1 мл PBS в каждую лунку 6-луночный планшет содержащий культур чЭСК.
- Отношение D-люциферин на PBS должна быть 1:100, для чего необходимо добавить 10 мкл талой D-люциферин в каждую лунку 6-луночный планшет.
- Подождите одну минуту, а затем взять изображения, используя выдержку в 1 секунду. Если сигнал слабый, увеличить интервал между экспозициями и повторите попытку.
- Биолюминесцентного сигнала отражает количество клеток, поэтому количественный анализы могут быть выполнены, которые коррелируют сигнала с различным числом клеток.
- Подготовка мыши и инъекционных клетки для прижизненного изображения
- Репортер гена изображения обеспечивает высокую пропускную способность, недорогой и чувствительный метод для отслеживания клеток после трансплантации в течение дней, недель и даже месяцев. Это особенно важно, так как пересаженные стволовые клетки часто образуют тератомы, отвергаются иммунной системы хозяина, или просто умереть.
- Простейший метод для работы с изображениями тератома образование в естественных условиях является для введения ЭСК, которые выражают люциферазы светляков гена-репортера в спине SCID мышей и приобрести биолюминесцентного изображения с системой ИВИС.
- Когда вы будете готовы к трансплантации клеток, использование dispase или коллагеназы, чтобы ослабить клетки, промойте несколько раз, и приостановить их в смеси 1:1 фактор роста снижается, и Матригель DMEM. Обычно мы сначала смешать с охлажденным клетки DMEM, а затем добавить в Матригель. Для каждого сайта подкожно, мы вводим 200000 клеток, взвешенных в 50-100 ул объема Матригель / DMEM смеси. Номер ячейки могут быть скорректированы в зависимости от вашего приложения. Помните, все, что на льду перед инъекцией.
- Как только клетки готовы, анестезию мыши, поместив его в коробку с индукцией изофлуран поток включен. После 1-5 минут, мышь спит и может быть размещен на операционный стол с непрерывным изофлуран.
- Потому что мех естественно авто-флуоресцирует и может заслонить биолюминесцентного изображения, нам нужно будет удалить волосы от задней стороне мыши. Самый простой способ сделать это состоит в использовании электробритвы, но вы также можете использовать удаления волос гели. Протрите спиртом для стерилизациикожа после
- Затем, нарисуйте вашу клеточную суспензию в шприц. С 23 по 27 игл калибр лучше всего работают, так как они не засоряют с ячейками. Если игла слишком велик (<23 калибра) иглы тракта может оставить большое отверстие, через которые может просочиться клетки обратно.
- Inject клетки под кожу в спине мыши. Потому что кожа совершенно свободно, большим пальцем и указательным пальцами пощипать и протянуть область, которую необходимо вводить. Вводите только под кожей, стараясь не прокол слишком глубоко. Кроме того, старайтесь держать иглу от скольжения из места инъекции в то время как удручающее плунжера: это предотвратит создание отверстия в коже, через которые может просочиться клетки, если вы попытаетесь вводить снова.
- После клетки вводили, подождите несколько часов, чтобы позволить мыши, чтобы проснуться и бегать перед повторным обезболивающим для биолюминесценции изображений. Это позволяет избежать изофлуран токсичности.
- В естественных изображений биолюминесценции трансплантированных клеток
- Для целого изображения биолюминесценции животных, мы делаем при введении препарата в D-люциферин в 375 мг / кг массы тела. Взвесьте животных рассчитать дозировку перед инъекцией.
- Inject D-люциферин в брюшине, в непосредственной близости от средней линии. Будьте осторожны, чтобы не зайти слишком глубоко или вы можете повредить внутренние органы. Если мышь начинает просыпаться, поместить его обратно в нокаут окно и подождите минуту или две. Для мышей, максимальная биолюминесценции происходит обычно 15-40 минут после инъекции.
- Не забудьте поместить матовой черной бумагой в окне изображения, чтобы помочь поглощать свет не испускаемых ЭСК. Место мыши (зад вверх) в изображение камеры с изофлуран, поверх черной бумагой. Начните с выдержкой 10 секунд. Если сигнал насыщения, попробуйте уменьшить время экспозиции, а если слишком слаб, увеличение экспозиции.
- Как только сигнал времени экспозиции была оптимизирована для мыши, начать принимать изображения каждую минуту, пока сигнал не достигнет максимума. Лучше всего это делать с помощью обработки изображений, чтобы выбрать "регионами интереса (ROI)", которые скрывают ваши сайты инъекции. Осуществляя мониторинг интенсивности сигнала на каждом ROI вы можете легко определить, когда сигнал начинает уменьшаться, указывая, что максимальная интенсивность сигнала была достигнута. Максимальный сигнал должен использоваться в качестве вашего окончательные данные.
- Когда вы будете удовлетворены своей изображений, удалять мышь от изофлуран и дать ему проснуться в своей клетке. Как правило, мышь должна проснуться в течение 15 минут.
- Биолюминесценция ген-репортер изображения могут повторяться ежедневно, еженедельно и ежемесячно до тех пор, как выжить в ЭСК животных. Сигнал с развивающимися тератома будут возрастать по экспоненте с течением времени, как правило, на порядок недель, как ЭСК начинают размножаться.
- После нужное время курс биолюминесценции изображения приобретается, животное может быть принесен в жертву и срезах тканей используется для гистологии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
По сравнению с другими методами, такие как ПЭТ и МРТ, биолюминесценции имеет ограниченные пространственным разрешением и снижение проникновения ткани из-за относительно слабой энергией фотонов (2-3 эВ), по этим причинам она до сих пор не применяется в крупных животных. Тем не менее, биолюминесценции имеет преимущество в том, низкой стоимостью, высокой пропускной способностью, и неинвазивные, что делает его весьма желательно, в естественных условиях стволовые клетки слежения в мелких животных. Номера для биолюминесценции репортер генов, таких как ПЭТ и флуоресценции конструкций может быть использован в сочетании с люциферазы для создания слияния генов репортеру, что состоит из различных областей, содержащих отдельные гены репортера. Например, наша группа использует слияние построить содержащие флуктуации, мономерного красного флуоресцентного белка (mrfp) и вирус простого герпеса усеченной тимидинкиназы (ТТК, ген ПЭТ репортер) для мульти-модальности отслеживание поведения стволовых клеток у мелких животных. Со временем, стабильно интегрированных генов репортер может быть предметом генов от эндогенного хромосомных техники. Восприимчивость ген-репортер, чтобы генов тесно связана с выбором промоутер вождения его выражения. Например, цитомегаловирус промотора (pCMV) быстро замолчали в ЭСК. Наша лаборатория была хороший успех с человека убиквитин-С промотора (лобковый) для управления выражением Double Fusion построить в нескольких клеточных линий чЭСК, и наблюдали минимальными потерями сигнала с течением времени.
В заключение, прежде чем чЭСК полученных регенерации клеток становится клинически значимым, несколько основных препятствий биологических должны быть преодолены, а именно - гибели клеток или апоптоза после трансплантации дифференцированных клеток, тератома образования из недифференцированных клеток и иммунного отторжения от организма хозяина. Эти и другие проблемы указывают на необходимость отслеживания чЭСК приживления, выживания и распространения в пределах организма-реципиента. Развитие методов молекулярной визуализации, такие как ген люциферазы светлячка репортер и сверхчувствительных ПЗС-камер позволило неинвазивным, повторяющиеся оценки сотой, миграцию, пролиферацию и дифференциацию в естественных условиях. Такие технологии, как это поможет подтолкнуть перевод чЭСК биологии из лаборатории к клинического применения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Благодаря Тим Дойл, доктор философии и Стэнфордского центра для прижизненного изображения для получения помощи биолюминесценции изображений. Кроме того, благодаря Нган Хуан, доктор философии для совместного использования ее техники на стволовых клеток совместно с матрицей инъекции раствора. Наконец, благодаря Стиву Войлок, к.т.н. за помощь в ветеринарной помощи животным.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Hyclone | |||
| BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix | Growth factor reduced (optional: phenol-red free) | BD Biosciences | ||
| mTeSR1 Maintenance Medium for Human Embryonic Stem Cells | Stem Cell Technologies | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ||||
| D-Luciferin Firefly, potassium salt | Biosynth International, Inc | |||
| Collagenase IV solution | Dissolve 30 mg Collagenase Type IV in 30 mL DMEM-F12 media. Sterile filter and store at 4 degrees (Celsius). | |||
| Baked Pasteur pipets | ||||
| 6-well tissue culture-treated plates | Techno Plastic Products | 92006 |
References
- Passier, R., et al. Increased cardiomyocyte differentiation from human embryonic stem cells in serum-free cultures. Stem Cells. 23, 772-780 (2003).
- Laflamme, M. A., et al. Cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells in pro-survival factors enhance function of infarcted rat hearts. Nature biotechnology. 25, 1015-1024 (2007).
- Baharvand, H., et al. Neural differentiation from human embryonic stem cells in a defined adherent culture conditi. Int J Dev Biol. 51, 371-378 (2007).
- Schulz, T. C., et al. Directed neuronal differentiation of human embryonic stem cells. BMC Neurosci. 4, (2007).
- Jiang, J. Generation of Insulin-producing Islet-like Clusters from Human Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 17, 17- (2007).
- Swijnenburg, R. J., van der Bogt, K. E. A., Sheikh, A. Y., Cao, F., Wu, J. C. Clinical hurdles for the transplantation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells: role of molecular imaging. Current Opinion in Biotechnology. 18, 38-45 (2007).
- Herschman, H. R. Molecular imaging: looking at problems, seeing solutions. Science. 302, 605-608 (2003).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Development and use of fluorescent protein markers in living cells. Science. 300, 87-91 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. Bioluminescent indicators in living mammals. Nature medicine. 4, 245-247 (1998).
- Bhaumik, S., Gambhir, S. S. Optical imaging of Renilla luciferase reporter gene expression in living mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 377-382 (2002).
- Tisi, L. C., et al. Development of a thermostable firefly luciferase. Analyica Chimica Acta. 457, 115-123 (2002).
- Ray, P., Tsien, R., Gambhir, S. S. Construction and validation of improved triple fusion reporter gene vectors for molecular imaging of living subjects. Cancer Res. 67, 3085-3093 (2007).
- Cao, F., et al. In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery. . Circulation. 113, 1005-1014 (2006).
- Cao, F., et al. Molecular Imaging of Embryonic Stem Cell Misbehavior and Suicide Gene Ablation. Cloning and Stem Cells. 9, 107-117 (2007).
- Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects. Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).
- Wu, J. C., et al. Proteomic analysis of reporter genes for molecular imaging of transplanted embryonic stem cells. Proteomics. 6, 6234-6249 (2006).
- Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11, 514-518 (2001).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnol Prog. 22, 825-834 (2006).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 14, 378-383 (2005).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22, 531-543 (2004).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-Level Sustained Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Using Lentiviral Vectors. Stem Cells. 21, 111-117 (2003).
- Menendez, P., Wang, L., Chadwick, K., Li, L., Bhatia, M. Retroviral transduction of hematopoietic cells differentiated from human embryonic stem cell-derived CD45(neg)PFV hemogenic precursors. Molecular therapy. 10, 1109-1120 (2004).
- Thyagarajan, B., et al. Creation of engineered human embryonic stem cell lines using phiC31 integrase. Stem cells. 26, 119-126 (2008).
- Liew, C. -G., Draper, J. S., Walsh, J., Moore, H., Andrews, P. W. Transient and Stable Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cell. , Forthcoming.
