Summary
A dissecção e crescimento de células de uma área do cérebro individuais facilita investigação de parâmetros celulares e fisiológicos. Nós descrevemos um método para cultivo de células primárias, que produz neurônios enriquecido culturas em um ambiente sem soro.
Abstract
As propriedades fisiológicas de neurônios do hipocampo são comumente investigado, especialmente por causa do envolvimento do hipocampo na aprendizagem e memória. Cultura de células primárias do hipocampo permite que os neurocientistas para examinar a atividade e as propriedades dos neurônios na célula individual e nível de sinapse único. Neste vídeo, vamos demonstrar como isolar e cultivar células primárias de hipocampo de ratos recém-nascidos. O hipocampo pode ser isolado de cada animal recém-nascido em tão curto quanto 2 a 3 minutos, e as culturas podem ser mantidas por até duas semanas. Também vamos brevemente demonstrar como usar esses neurônios do hipocampo para a imagem latente de cálcio raciométrica. Embora este protocolo descreve o processo para o hipocampo, com pouca ou nenhuma modificação, ele pode ser aplicado a outras regiões do cérebro.
Protocol
Antes de isolamento do hipocampo
Antes de iniciar o isolamento do hipocampo, certifique-se que todas as ferramentas são estéreis. Spray para baixo do capô cultura com etanol 70%, e colocar as ferramentas dentro do capô. Você vai precisar 6 - e os pratos de Petri de 10 cm, estéril poli-L lamínulas de vidro revestido, pipetadores e dicas, pipetas descartáveis, e um pipetador elétrica. Deste ponto em diante, lembre-se de usar a técnica estéril correta.
- Ligue o banho de água e verifique se ele é aquecido até 37 ° C.
- As seguintes soluções que são armazenados a 4 ° C serão necessários:
- Médio modificado Eagle (MEM)
- Neurobasal
- Solução tampão salina de Hank (HBSS)
- Solução tampão borato
- Solução de piruvato de sódio
- Estéril filtrado solução de glicose 20% em água destilada
- Certifique-se de spray de todas as garrafas para baixo com etanol 70% antes de os colocar na capa.
- Tome essas soluções congeladas fora do freezer e coloque-os em um banho de água aquecida:
- Uma alíquota de 5 ml de soro de cavalo
- Uma alíquota de 1 ml de B-27 suplemento
- Uma alíquota de 1 ml de 100X antibiótico (penicilina mais estreptomicina)
- E uma alíquota de 0,5 ml de L-glutamina
- Após as soluções têm descongelado, tirá-los do banho de água, spray-los com etanol 70%, e colocá-los na capa. Agora, o médio revestimento e Neurobasal podem ser preparadas.
- Após as soluções são preparados, a tampa do recipiente hermeticamente e coloque-os na 37 ° C banho para aquecer durante a realização do isolamento do hipocampo.
- Além disso, tomar uma alíquota da tripsina protease (2,5%) fora do freezer e coloque-o em banho-maria. Tripsina irá digerir o hipocampo dissecados, que será isolada na próxima etapa.
- Pegue um tubo de 15ml cónico, preenchê-lo com HBSS, e rotulá-la com o grupo de tratamento. É aqui que isolado hipocampos serão coletadas na próxima etapa.
O isolamento do hipocampo
- Para começar o isolamento do hipocampo, certifique-se filhotes recém-nascidos são limpos e tivemos bandas de seu leite, placentas e cordões umbilicais removidas por sua mãe.
- Coloque os filhotes em uma placa de Petri, spray com etanol 70% para limpar, e colocá-los na capa. Os animais são sacrificados imediatamente antes de cultivo.
- Para esterilização além disso, tomar um filhote de cachorro do prato, mergulhar o cachorro em etanol 70%, e em seguida em duas lavagens de HBSS estéril.
- Remova a cabeça do corpo com uma tesoura. Usando a tesoura mesmo, cortar a pele eo crânio.
- Usando um par de pinças finas, descasque a caveira longe do cérebro e colocar o cérebro em uma placa de Petri pequena que contém uma pequena quantidade de HBSS estéril.
- Retire os hemisférios cerebrais. O hipocampo é uma pequena estrutura em forma de cavalo-marinho no lobo temporal medial.
- Remova o hipocampo e coloque em 3 ml de HBSS em um tubo de 15 ml. Repita essas etapas com cada filhote, e colocar cada hipocampo isolado dentro do tubo de 15 ml. Agora, é hora de separar o tecido a uma única célula.
Hipocampo célula dissociação
- Afinal hipocampo têm sido isolados, encher o tubo ml de 15-4,5 ml com HBSS.
- Remova a tripsina do banho de água, spray com etanol, e colocar no capô. Adicionar 0,5 ml de tripsina para o tubo e incubar por 15 minutos a 37 ° C.
- No capô, remover a solução HBSS / tripsina do tubo com uma pipeta estéril, tomando cuidado para não perturbar o hipocampo que se instalaram na parte inferior do tubo. Adicionar 5 ml de HBSS ao tubo e agite bem. Incubar a 37 ° C por 5 minutos.
- Repita este passo duas vezes, a remoção do antigo e substituindo HBSS com solução fresca.
- Tomar uma alíquota de DNAse I para fora do freezer. Adicionar 0,5 ml de DNase ao hipocampo em 4,5 ml HBSS. A DNAse é adicionada para promover a inativação da enzima.
- Triturar a solução (ou pipeta cima e para baixo) até que fique homogêneo. Tenha cuidado para não introduzir bolhas no homogeneizado.
- Determinar a viabilidade celular com o método de exclusão pelo azul de tripan.
- Tome de 10 cm placa de Petri contendo 6-8 lamínulas, e adicione 10 ml de meio de placas. Pipetar o número desejado de células para o prato contendo as lamelas. Agite cuidadosamente para dispersar as células, e certifique-se as lamelas não se sobrepõem.
- Permitir que as células para anexar por 2-4 horas em um umidificado 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. Após a confirmação de que as células são viáveis e têm anexados, transferir as lamelas de pratos individuais contendo meio Neurobasal. Coloque esses pratos de volta para a incubadora.
- Uma vez por semana, substituir um terço da média com média Neurobasal fresco e tratamentos experimentais, conforme necessário. Agora, as propriedades funcionais dessas células em cultura estão prontos para serem estudados.
Fura-2 Imagem de cálcio de neurônios do hipocampo
- Depois de cultivadas neurônios do hipocampo têm sido in vitro por 48 horas (mas não anterior), experimentos com imagens de cálcio pode começar. Neste ponto, esses neurônios deveria ter começado a estender os processos. A faixa etária ideal para imagens de cálcio é de dia in vitro 3-7.
- Culturas de carga com Fura-02:00 por 30 minutos a 37 ° C, após o que pode ser trabalhada sob um objetivo 20X usando uma lâmpada de arco de xenônio para excitar o corante indicador de cálcio e uma de 512 bits câmera CCD, que amostras a cada 150ms.
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Discussion
Este protocolo foi desenvolvido como uma modificação do trabalho seminal de Gary Banker e Goslin Kim 1. Este livro é um recurso essencial para qualquer pessoa interessada em células de cultura - não apenas as culturas de neurônios enriquecido descritos no protocolo atual.
Os três fatores mais críticos em cultura de células são: velocidade de esterilidade, a escolha do meio utilizado.
Esterilidade - fluxo laminar um / capa estéril, condições assépticas, e uma incubadora de estéreis são obrigatórios. Contaminação em qualquer etapa é prejudicial não só para o experimento atual que você está trabalhando, mas também o trabalho posterior que possa ter sido planejado. Depois de uma incubadora torna-se contaminado, pode demorar semanas (ou um mês) para obtê-lo limpo e estéril. Contaminação, embora não imediatamente evidente em um nível visível, vai sem dúvida afectar a viabilidade celular e fisiologia celular. Esterilidade é um imperativo.
Speed - a saúde das células em cultura está fortemente ligada à quantidade de tempo que as células não estão em uma atmosfera e um ambiente controlado médio. Portanto, é essencial que a quantidade de tempo necessária para remover as células do animal até que as células estão no meio de revestimento é, no mínimo. Porque numerosas etapas não podem ser alterados (tempo em incubação no tripsina ou ser lavados), o que pode ser alterada é a quantidade de tempo necessária para remover as células do cérebro. Praticar a dissecação freqüência. A quantidade de tempo necessário para essa etapa precisa ser reprodutível.
Escolha do meio - há inúmeros médiuns proprietário, um dos quais é Neurobasal. Antes do dia de usar Neurobasal, médio glial condicionado (que precisavam ser feitos separadamente - isto é discutido no livro de Banker e Goslin 1) foi necessário. Independentemente disso, é importante que você saiba o que está no meio que está sendo usado. Junto com Neurobasal, um suplemento, como B-27 é frequentemente utilizado. Certifique-se que os constituintes destes médio e suplementos são conhecidos, pois eles podem afetar as propriedades das células. É prática normal no meu laboratório o uso de soro de carvão vegetal / free despojado / meio vermelho de fenol livre para evitar hormônios esteróides (dado que uma grande parte do trabalho realizado em meu laboratório investiga a ação dos hormônios esteróides). Este conceito - saber o que está nas soluções que você está usando - é fundamental para todas as etapas de cultivo celular.
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Acknowledgments
JLN foi apoiada por 68.347 MH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibiotic antimitotic | Invitrogen | 15240062 | |
| B-27 Supplement | Invitrogen | 17504044 | Serum free |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Dnase I | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Fura-2, AM cell permeant | Molecular Probes, Life Technologies | F1221 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HBSS (10X) | Invitrogen | 14185052 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| MEM | Invitrogen | 51200038 | |
| Neurobasal | Invitrogen | 12348017 | Without phenol red |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Sodium Tetraborate | Sigma-Aldrich | ||
| Trypsin, 2.5% (10X) | Invitrogen | 15090046 |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells, 2nd Edition. , The MIT Press. (1998).
