Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Um die durchschnittliche Lebensdauer einer Nematodenpopulation zu messen, beginnen Sie mit entwicklungssynchronisierten L1-Larven im M9-Puffer. Bestimmen Sie die Dichte der Larven, und fügen Sie dann 50 zu jeder Platte hinzu. Bereiten Sie mindestens drei Replikplatten pro Zustand sowie Sicherungsplatten vor.
Lassen Sie diese Würmer normal entwickeln, bis sie die L4-Stufe erreichen. Jetzt können Sie FUdR zu den Platten hinzufügen, was verhindert, dass die Würmer Nachkommen produzieren. Alternativ müssen Sie die Würmer jeden Tag nach dem Zählen auf neue Platten verschieben, um sicherzustellen, dass Sie nur die Lebensdauer einer einzelnen Generation messen.
Als nächstes entfernen Sie alle Männchen. Dies wird die Variablen von Geschlecht und Paarung aus dem Experiment zu entfernen. Am nächsten Tag, zählen Sie die Anzahl der lebenden Würmer auf dem Teller durch die Suche nach spontaner Bewegung oder Reaktion auf sanfte Berührung. Entfernen Sie alle toten Würmer und erfassen Sie die Zahlen. Zählen Überlebende Würmer täglich, bis keine bleiben. Im Beispielprotokoll werden wir eine Demonstration einer Lebensdauer Assay sehen.
- Laden Sie die vorbereiteten bakteriensamen Platten mit jeweils 50 L1 Tieren. Richten Sie die Platten in einem 20 Grad Celsius Inkubator ein, bis sich die Embryonen zum L4-Stadium entwickeln. Normale Entwicklung von L1 bis L4 dauert etwa 40 Stunden.
Dann, um die Nachkommenproduktion zu verhindern, fügen Sie 160 Mikroliter 50x FUdR zu jeder Platte hinzu. Entfernen Sie dann die Männchen, da die Lebensdauer in der Regel nur mit Hermaphroditen gemessen wird. Nach Fertigstellung packen Sie die Platten in den 20 Grad Celsius Inkubator um.
Bis alle Würmer tot sind, punkten Sie ihre Lebensfähigkeit auf einer täglichen Basis. Um dies zu tun, berühren Sie vorsichtig jede nicht bewegende Nematode auf dem Kopf mit einem Platindraht oder Wimpern. Nicht-reaktive Tiere sind tot und müssen von der Platte entfernt werden. Beachten Sie alle Anomalien während dieser Routine.
