التحول البكتيري

1. التحول البكتيري قم بتوسيع
   • هام: بالإضافة إلى ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة ، تأكد من الحرص على إبقاء وجهك بعيدا عن مزارع التعليق ، وتجنب استنشاق الكواشف. لا تلمس وجهك أثناء إجراء التجربة. اغسل يديك دائما قبل وبعد كل تجربة.
   • عندما تكون مستعدا للبدء بأمان ، تحقق للتأكد من أن لديك أنبوبا أو أنابيب من الخلايا الإشريكية القولونية المختصة في دلو الثلج الخاص بك.
   • بعد ذلك ، قم بنقل 50 ميكرولتر من أحد هذه الأنابيب إلى كل من أنبوبين جديدين للطرد المركزي الدقيق ، أحدهما يسمى "-" ، والآخر يسمى "+".
   • بعد ذلك ، قم بسحب 2 ميكرولتر من بلازميد p-GREEN في الأنبوب الزائد ونفض الغبار عن الأنبوب برفق لدمج البلازميد في جميع أنحاء المحلول البكتيري. الفرضيات: الفرضية التجريبية هي أنه على الصفائح التي لا تحتوي على مضاد حيوي ، يمكن للبكتيريا التي تحتوي على البلازميد أو بدونه البقاء على قيد الحياة ، وبالتالي فإن كلاهما سينمو مروج من البكتيريا. على العكس من ذلك ، على الصفائح التي تحتوي على مضاد حيوي الأمبيسلين ، ستنمو فقط البكتيريا التي تحولت بنجاح مع بلازميد المقاومة ، في حين أن صفائح البلازميد ناقص لن تحتوي على بكتيريا. الفرضية الصفرية لهذه التجربة هي أنه لن يكون هناك فرق في نمو البكتيريا بين الصفائح.
   • احتضان كلا الأنبوبين على الجليد.
   • بعد 30 دقيقة ، اغمر كلا الأنبوبين 3/4 من الطريق في ماء حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية.
   • في نهاية حضانة الحمام المائي ، ضع الأنابيب مرة أخرى على الجليد لمدة 5 دقائق ، ثم أضف 950 ميكرولتر من وسائط SOC بدرجة حرارة الغرفة إلى كل أنبوب.
   • احتضان الأنابيب في شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة عند 250 دورة في الدقيقة.
   • أثناء احتضان الأنابيب ، قم بتسمية قيعان LB واحد وواحد LB / ampicillin ، أو لوحة AMP ، "+ بلازميد" ، وقيعان لوحة LB واحدة ولوحة LB / AMP واحدة "- البلازميد".
   • في نهاية الحضانة ، قم بسحب 50 ميكرولتر من أنبوب الخلية "+ البلازميد" على كل من لوحة LB / AMP plus ولوحة LB plus.
   • ثم ، بطرف جديد ، أضف 50 ميكرولتر من البكتيريا التي لم تتعرض للبلازميد إلى كل لوحة من ألواح الناقص.
   • بعد ذلك ، انشر كل طبق باستخدام طرف ماصة جديد.
   • قم بتغطية الألواح بأغطيتها ، ثم أغلقها بغشاء مختبر.
   • ثم قم بتخزين الأطباق رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
2. النتائج قم بتوسيع
   • في اليوم التالي للتحول، لاحظ الصفائح التي تحتوي على بكتيريا، وكيف تتوزع البكتيريا على كل لوحة.
   • سجل عدد المستعمرات ولون المستعمرات لظروف مختلفة. انقر هنا لتنزيل الجدول 1
   • لتحديد الكتلة الأولية ، IM ، من البلازميد ، اضرب أولا تركيز البلازميد من أنبوب مخزون p-GREEN في الحجم المنقوع إلى الأنبوب التجريبي.
   • لحساب مقدار الحمض النووي المنتشر على كل صفيحة ، اقسم حجم المعلق البكتيري المنتشر على كل لوحة على حجم التعليق في الأنبوب ، واضرب هذا الكسر في الكتلة الأولية للبلازميد المستخدم.
   • لتحديد كفاءة التحويل ، قم بحساب جميع المستعمرات المميزة بشكل واضح على لوحة البلازميد الزائد LB / AMP ، واقسم هذا الرقم على كتلة انتشار البلازميد. ملاحظة: وحدة كفاءات التحويل هي cfu / μg من الحمض النووي البلازميد.
   • سجل جميع النتائج لكل لوحة في الجدول وقم بتحليلها.
   • لاحظ أي اختلافات بين المستعمرات وقم بعمل فرضيات لشرح هذه الملاحظة. ضع في اعتبارك العوامل التي قد تؤثر على كفاءة تحويل البكتيريا المختصة.
   • ملاحظة: ستلاحظ أيضا أن كل لوحة كان لها نتيجة مختلفة. يجب أن تكون صفائح البلازميد ناقص والبلازميد LB قد نمت الكثير من البكتيريا عبر صفائحها. يجب ألا تحتوي لوحة البلازميد ناقص LB / AMP على نمو بكتيري. ويجب أن تكون لوحة البلازميد الزائد LB / AMP قد نمت مستعمرات بكتيرية تتألق باللون الأخضر.

في هذه التجربة ، ستقوم بتحويل البكتيريا باستخدام بلازميد يحتوي على مضاد حيوي وعلامة فلورية خضراء. ستقوم بعد ذلك بزراعتها بالإضافة إلى التحكم غير المتحول على ألواح المثقاب مع وبدون المضاد الحيوي الانتقائي. بالإضافة إلى ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة ، تأكد من الحرص على إبقاء وجهك بعيدا عن ثقافات التعليق ، وتجنب استنشاق الكواشف.

لا تلمس وجهك أثناء إجراء التجربة. واغسل يديك دائما قبل وبعد كل تجربة. عندما تكون مستعدا للبدء بأمان ، تحقق للتأكد من وجود أنبوب أو أنابيب من خلايا الإشريكية القولونية المختصة في دلو الثلج.

ثم انقل 50 ميكرولترا من أحد هذه الأنابيب إلى كل من أنبوبين جديدين للطرد المركزي الصغير ، أحدهما يحمل علامة ناقص ، والآخر يحمل علامة زائد. بعد ذلك ، قم بسحب لترين ميكرولترين من البلازميد p-GREEN في أنبوب الجمع ونفض الغبار عن الأنبوب برفق لدمج البلازميد في جميع أنحاء المحلول البكتيري. الفرضية التجريبية هي أنه على الصفائح التي لا تحتوي على مضاد حيوي ، يمكن للبكتيريا التي تحتوي على البلازميد أو بدونه البقاء على قيد الحياة ، وبالتالي فإن كلاهما سينمو مروج من البكتيريا.

على العكس من ذلك ، على الصفائح التي تحتوي على مضاد حيوي الأمبيسلين ، ستنمو فقط البكتيريا التي تحولت بنجاح مع بلازميد المقاومة ، في حين أن صفائح البلازميد ناقص لن تحتوي على بكتيريا. الفرضية الصفرية لهذه التجربة هي أنه لن يكون هناك فرق في نمو البكتيريا بين الصفائح. احتضان كلا الأنبوبين على الجليد.

بعد 30 دقيقة ، اغمر كلا الأنبوبين 3/4 من الطريق في ماء حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. في نهاية حضانة الحمام المائي ، ضع الأنابيب مرة أخرى على الجليد لمدة خمس دقائق ، ثم أضف 950 ميكرولتر من وسائط SOC بدرجة حرارة الغرفة إلى كل أنبوب ؛ قبل احتضان الأنابيب في شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة عند 250 دورة في الدقيقة. أثناء احتضان الأنابيب ، قم بتسمية قيعان LB واحد ولوحة LB / ampicillin ، أو لوحة AMP ، بالإضافة إلى البلازميد ، وقيعان لوحة LB واحدة ولوحة LB / AMP واحدة مطروحا منها البلازميد.

في نهاية الحضانة ، قم بسحب 50 ميكرولتر من أنبوب خلية البلازميد الزائد على كل من لوحة LB / AMP plus ولوحة LB plus. ثم بطرف جديد ، أضف 50 ميكرولترا من البكتيريا التي لم تتعرض للبلازميد إلى كل من ألواح الطرح. ثم انشر كل طبق باستخدام طرف ماصة جديد.

قم بتغطية الألواح بأغطيتها ، ثم أغلقها بغشاء مختبر. ثم قم بتخزين الأطباق رأسا على عقب في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي للتحول ، لاحظ الصفائح التي تحتوي على بكتيريا ، وكيف يتم توزيع البكتيريا على كل لوحة.

سجل عدد المستعمرات ولون المستعمرات لظروف مختلفة ، في هذا الجدول. لتحديد الكتلة الأولية ، IM ، من البلازميد ، اضرب أولا تركيز البلازميد من أنبوب مخزون p-GREEN في الحجم المنقوع إلى الأنبوب التجريبي. لحساب مقدار الحمض النووي المنتشر على كل صفيحة ، اقسم حجم المعلق البكتيري المنتشر على كل لوحة على حجم التعليق في الأنبوب ، واضرب هذا الكسر في الكتلة الأولية للبلازميد المستخدم.

لتحديد كفاءة التحويل ، قم بحساب جميع المستعمرات المميزة بشكل واضح على لوحة البلازميد الزائد LB / AMP ، واقسم هذا الرقم على كتلة انتشار البلازميد. لذلك ، فإن وحدة كفاءات التحويل هي cfu لكل ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد. سجل جميع النتائج لكل لوحة في الجدول وقم بتحليلها.

لماذا تعتقد أن المستعمرات تبدو مختلفة؟ هل يمكنك شرح الاختلافات في لونها؟ هل يمكنك حساب كفاءة التحويل لجميع الألواح؟

ما نوع العوامل التي قد تؤثر على كفاءة تحويل البكتيريا المختصة؟ ستلاحظ أيضا أن كل لوحة كان لها نتيجة مختلفة. يجب أن تكون صفائح البلازميد ناقص والبلازميد LB قد نمت الكثير من البكتيريا عبر صفائحها.

يجب ألا تحتوي لوحة البلازميد ناقص LB / AMP على نمو بكتيري. ويجب أن تكون لوحة البلازميد الزائد LB / AMP قد نمت مستعمرات بكتيرية تتألق باللون الأخضر.