مقالة منهجية

مضان في الموقع التهجين (FISH) البروتوكول في الحيوانات المنوية البشرية

30.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/1405

⸱

سبتمبر 1, 2009

 , 
1Unitat de Biologia Cel·lular (Facultat de Biociències), Universitat Autónoma de Barcelona

في هذه المقالة

ملخص

هذا الفيديو المقالة ، خطوة خطوة ، وكيفية معالجة عينة السائل المنوي لتحقيق نوعية جيدة من مضان في الموقع التهجين على الحيوانات المنوية البشرية. يمكن استخدامها للكشف عن الاستعدادات التي تم الحصول عليها عدم توازن الصبغيات في سياق التشخيص السريري.

الملخص

[أنيوبلويدي] هي شذوذ الكروموسومات الأكثر شيوعا لدى البشر. معظم هذه التشوهات الناتجة عن أخطاء أثناء عملية الانتصافي مكون للأعراس في الآباء. في الذكور الإنسان ، يمكن لهذه الأخطاء تؤدي الى انتاج الحيوانات المنوية مع شذوذ الكروموسومات العددية التي تمثل زيادة مخاطر انتقال هذه الحالات الشاذة في النسل.

لهذا السبب ، أصبح أسلوب التهجين مضان في الموضع (FISH) في نواة الحيوان المنوي بروتوكول أدرجت على نطاق واسع في سياق التشخيص السريري. هذه الممارسة توفر تقديرا للترددات شذوذ صبغي العددي في الأمشاج من المرضى التي تسعى للحصول على المشورة الإنجابية الوراثية.

حتى الآن ، فإن الكروموسومات في معظم الأحيان المدرجة في تحليل FISH الحيوانات المنوية هي الكروموسومات X ، Y ، 13 ، 18 و 21.

هذا الفيديو المقالة ، خطوة خطوة ، وكيفية معالجة وإصلاح عينة السائل المنوي البشري ، وكيفية decondense وتفسد لونين الحيوانات المنوية ، وكيفية المضي قدما للحصول على الاستعدادات السمكية الحيوانات المنوية ، وكيفية تصور النتائج في المجهر. وترد ملاحظات خاصة من الخطوات الأكثر ملاءمة لتحقيق أفضل النتائج.

البروتوكول

أولا تجهيز العينات وتثبيت الخلية

  1. ترك عينة السائل المنوي في حاويات معقمة في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقائق حتى تسييل.
  2. نقل العينة إلى أنابيب الطرد المركزي وانها تدور في 1000g لمدة 5 دقائق.
  3. إزالة بلطف وتجاهل طاف به ماصة باستور.
  4. إضافة محلول ناقص التوتر (بوكل ، 0.075M) قبل تسخينها عند 37 درجة مئوية ، قطرة قطرة ، في حين أن الاختلاط في دوامة الحصول على الحجم النهائي من 10 مل.
  5. وضع الأنبوب في حمام مائي عند 37 لمدة 30 دقائق درجة مئوية.
  6. الطرد المركزي في 1000g لمدة 5 دقائق. تجاهل بعناية من قبل طاف إبانة ، دون الإخلال بيليه.
  7. بعد إعادة التعليق على بيليه ، إضافة الطازجة Carnoy لتثبيتي (الميثانول 03:01 : حامض الخليك) قطرة قطرة في حين خلط في دوامة الحصول على الحجم النهائي من 8 ملم.
  8. كرر النقاط 6 و 7 عدة مرات حسب الضرورة للحصول على بيليه الأبيض.
  9. إضافة الميثانول الطازجة : حمض الخليك (3:1) قطرة قطرة لضبط الحجم النهائي للتركيز الخلوية المطلوبة للحصول على الخلايا الجيدة تنتشر (في تلك الحالات مع بيليه الصغيرة ، وسوف يكون كافيا قطرات قليلة بينما العينات مع كمية عالية تعافى من الحيوانات المنوية ، يمكن أن تصل إلى الحجم النهائي 1-2 مل). ويمكن إجراء اختبار الشريحة من خلال إسقاط نموذج معلق على شريحة غير مدهون وتفحص تحت المجهر مرحلة التباين. وسيتيح هذا للتحقق من التشتت الخلوية التي تم الحصول عليها ، وسيسمح تصحيح ذلك ، إذا كان ذلك ضروريا ، في شرائح أخرى.
  10. لجعل التمديد ، تسقط من على ارتفاع لا يقل عن 40 سم اثنين أو ثلاث قطرات من التعليق الخلية في وسط الشرائح unfrosted (المخزنة سابقا في الميثانول في -20 درجة مئوية إلى أزل الشحم منهم). لتمكين الموقع من العينة في جميع أنحاء البروتوكول ، بمناسبة منطقة تحتوي على الحيوانات المنوية التمديد على الجانب الآخر من الشريحة باستخدام قلم الماس.
  11. تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل.
    ملاحظة : إضافة الميثانول : حمض الخليك (3:1) قطرة قطرة بينما الاختلاط هو خطوة مهمة جدا لتجنب تشكيل الحصى الحيوانات المنوية.

II. Decondensation

  1. الشرائح المخزنة في -20 درجة مئوية ويجب أن تواصل مطلق مع بروتوكول (تركها في درجة حرارة الغرفة).
  2. ضع الشريحة في علبتين coplin متتالية مع 2X حل سيترات الصوديوم المالحة (2xSSC) لمدة 3 دقائق لكل منهما.
  3. نقل الشريحة من خلال سلسلة من يغسل الايثانول لمدة 2 دقيقة في كل جرة coplin. تبدأ الايثانول 70 ٪ ، اتبع بنسبة 90 ٪ وتنتهي مع 100 ٪. تجف الشريحة تركها في درجة حرارة الغرفة.
  4. احتضان الشريحة في حل dithiothreitol (1،4 - dithiothreitol 5mm ، و 1 ٪ تريتون X - 100 ، 2 - الأمينية - 2 - (hydroxymethyl) -1،3 - propanediol 50mM) عند 37 درجة مئوية في الحاضنة لdecondense لونين. هذا المنتج يعمل عن طريق كسر جسور ثاني كبريتيد لفائف protamines أن الحمض النووي في نواة الحيوانات المنوية. هذه خطوة مهمة جدا ليتم ضغط كبير على الحمض النووي في نواة الحيوان المنوي. ولا بد من تعديل فترة حضانة الشرائح في حل dithiothreitol (DTT) وفقا لنموذج التفاعل لهذا المنتج. عادة ، وهذا الوقت هو حوالي 8 دقائق ، على الرغم من أنه يمكن أن تختلف من 2 إلى 15 دقيقة.
  5. على الفور ، ونقل الشريحة لعلبتين coplin متتالية مع 2xSSC لمدة 3 دقائق في كل coplin.
  6. تواصل من خلال وضع الشريحة من خلال سلسلة من يغسل الايثانول لمدة 2 دقيقة في كل جرة coplin (70 ٪ ، 90 ٪ و 100 ٪ الايثانول). اسمحوا الشريحة لتجف في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة : التعرض المفرط لDTT شأنه أن يؤدي إلى تفريق إشارات السمكية في نهاية هذا الإجراء ، في حين أن التعرض قصير جدا من شأنه أن يؤدي إلى نقص في بعض الاشارات.

III. تهجين

  1. تفسد الحمض النووي الحيوانات المنوية التي يحتضنها الشريحة في جرة coplin formamide مع الحل (70 ٪ Formamide/2xSSC) عند 73 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. نقل الشريحة من خلال حلول الايثانول لمدة 1 دقيقة لكل جرة coplin (تبدأ الايثانول 70 ٪ ، 85 ٪ وتنتهي ب 100 ٪). ترك الشريحة لتجف في درجة حرارة الغرفة.
  3. مباشرة إضافة 5 لتر من المقابلة الجاهزة للاستخدام خليط تحقيق لزلة غطاء 15x15 (AneuVysion دقق الفحص لوحة متعددة الألوان : CEP 18/X/Y أو LSI 13/21).
  4. كما هو مبين في الفيديو ، بدقة مكان الشريحة على زلة لتغطي مجتمعة في المنطقة المستهدفة ، والخليط التحقيق. الختم مع الاسمنت المطاطي.
  5. مكان الانزلاق الى ما قبل 37 درجة مئوية درجة حرارة الغرفة التهجين (HYBrite ™) وذلك في احتضان 37 درجة مئوية لمدة 6-24 ساعات.
    ملاحظة : لما كان تمسخ من عينة الحيوانات المنوية غير إلزامية ، ويتحدد على ضرورة تغيير طبيعة تحقيقات من قبل الشركة المصنعة. ومخاليط التحقيق المستخدمة في هذا البروتوكول تكون جاهزة للاستخدام ، وفي هذه الحالة ، ليس مطلوبا تمسخ التحقيق.
    فإن حجم الخليط التحقيق تختلف وفقا لحجم المساحة المهجنة.

رابعا. يغسلبعد التهجين

  1. اخراج الشريحة من غرفة التهجين.
  2. إزالة المطاط والأسمنت سحب بعناية زلة تغطية الانزلاق برفق إلى الجانب.
  3. للقضاء على إشارات التهجين غير محدد مكان الشريحة لمدة 2 دقيقة في وعاء مع coplin 0.4xSSC/0.3 NP - 40 ٪ قبل حرارة بلغت 73 درجة مئوية في حمام مائي.
  4. نقل الشريحة إلى حل 2xSSC/0.1 ٪ NP - 40 يغسل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. اسمحوا الشريحة لتجف في درجة حرارة الغرفة.
  5. إضافة منتج counterstaining الى المنطقة المستهدفة (8 لتر لتغطية زلة 18x18). المنتج الأكثر شيوعا هو 4 "،6 - diamidino - 2 - phenylindole (دابي ، Vysis شركة).
  6. كما هو مبين في الفيديو ، وتغطي المنطقة المهجنة مع انزلاق الغطاء (للحفاظ على تهجين يمكن اغلاق الغطاء زلة مع طلاء الأظافر).
  7. تخزين الشرائح المهجنة في -20 درجة مئوية في الظلام حتى تحليل احتمال الخاصة بهم. ويمكن في ظل هذه الظروف يمكن تخزين الشرائح لمدة تصل إلى 12 شهرا دون فقدان كبير في شدة إشارة مضان.
    ملاحظة : ارتفاع درجة الحرارة أو وقت غسل المفرطة يمكن أن تؤدي إلى القضاء على بعض الإشارات ، في حين أن العكس لن تغسل التهجين المسبار غير محددة.
    فإن حجم الناتج counterstaining أضاف تختلف وفقا لحجم المنطقة لتغطية التهجين.

خامسا التصور

ويمكن تقييم التحضيرات تحت المجهر epifluorescence مجهزة تصفية ثلاثي الموجات للدابي / تكساس الأحمر / FITC والفرقة واحد المرشحات لأكوا ، FITC الأحمر وتكساس. يجب أن يتبع المعايير القياسية لتقييم التقييم الصحيح للنواة الحيوان المنوي 1.

وينبغي إعداد المهجنة مع تحقيقات للكروموسومات X ، Y ، و 18 إشارة لعرض هذه الكروموسومات الثلاثة. يجب على كل الحيوانات المنوية طبيعية تظهر إشارة واحدة زرقاء (المقابلة لكروموسوم 18) ، وإشارة خضراء (X - تحمل الحيوانات المنوية) أو إشارة حمراء (Y - تحمل الحيوانات المنوية).

وينبغي في إعداد تحقيقات عن تهجين مع الكروموسومات 13 و 21 ، اشارة خضراء لكروموسوم 13 و إشارة حمراء لكروموسوم 21 تكون متميزة في كل الحيوانات المنوية طبيعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هذا البروتوكول توضح كيفية معالجة عينات السائل المنوي البشرية للحصول على الاستعدادات السمكية الحيوانات المنوية. باستخدام هذا البروتوكول أنه من الممكن لتحليل شذوذ الكروموسومات في الأمشاج الذكور. فحص الحيوانات المنوية وعدم توازن الصبغيات التطبيقات سواء في سياق البحوث الأساسية وتقديم المشورة في الصحة الإنجابية تعطى للذكور بالعقم. على الرغم من أن التشخيص السريري في الكروموسومات الأكثر دراسة على نطاق واسع هي X ، Y ، 13 ، 18 و 21 ، تحقيقات تجارية أخرى لمجموعة واسعة من الكروموسومات ومواضع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل قطالونيا كتالونيا (2005 SGR00437). المؤلفان بالشكر إلى بلانكو وفيدال J. F. عن الإشراف والتشجيع ، وجيه لوكاس لمساعدته التقنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1,4-ديثيوتريتول (DTT)الموادمجموعة روش10197777001
2-أمينو-2-(هيدروكسي ميثيل)-1،3-بروبان ديولالموادمجموعة روش (Roche Group)10708976001
حمض الأسيتيكالموادMerck & Co., Inc.100.063
AneuVysion® طقم مسابير الحمض النووي متعددة الألوان
  • محلول ملحي-سترات الصوديوم تركيز 20x
  • 4,6-دياميدينو-2-فينيل إندول (DAPI II)
  • مسبار الحمض النووي CEP 18/X/Y
  • NP-40
  • مسبار DNA LSI 13/21
الموادVysis Inc.32-161075
  • 30-805850
  • 30-804941
  • 30-171077
  • 30-804820
  • 30-171078
جهاز طرد مركزي 5804RأداةEppendorf
أنبوب طرد مركزيالموادNalge Nunc international347856
وعاء كوبلن (زجاجي)الموادBarloworld Scientificهيلينداهل (ZCT278)
وعاء كوبلين (بلاستيكي)الموادDeltalab191087
شرائح تغطية (15×15)الموادكنتل جليزر (Knittel Glaser)4600115
شرائح غطائية (18x18)الموادKnittel Glaser4600118
قلم ماسيالموادهاماشير335117010
إيثانولالموادMerck &شركة .amp; Co., Inc100.983
فورماميدالموادمجموعة Roche11814320001
مجمّدأداةزانوسي
قُفازاتالموادSanyo101/3300
HYBrite™الأداةVysis Inc.
زيت غمرالموادشركة Olympus Corporation35505
حاضنةالأداةHeraeus Instruments
ميثانولالموادMerck &شركة .amp; Co, Inc106.009
ماصة دقيقةالموادأنظمة المختبراتماصة Finnpipette (4500000)
رأس الماصة الدقيقة القابل للاستبدالالموادداسلاب16-2001
طلاء الأظافرالموادكيو-كوزمتكس (Quo-cosmetics)
مجهر الفلورة فوق البؤرية Olympus BX60أداةشركة Olympusمُزوّد بمرشح ثلاثي النطاق لـ DAPI/Texas Red/FITC ومرشحات أحادية النطاق لـ Aqua وFITC وTexas Red.
ماصة باستيرالموادRubilabor211.0230
مجهر تباين الأطوارالأداةأجهزة Nikon
ماصة بلاستيكية (3 مل)الموادDeltalab200007
كلوريد البوتاسيوم (KCl)الموادFluka60128
غراء المطاطالموادأفضل اختبار
الشرائحالموادKnittel Glaser4520022
صناديق حفظ الشرائحالموادDeltalab19276.1
وعاء معقمالموادDeltalab409726
حقنةالموادPentaFerte002022300
ميزان حرارةالموادComark Instruments, IncKM12
ماء مقطر ثلاث مراتالمواد
Triton X-100الموادSigma-Aldrich9002-93-1
ملقطالموادبي براون ميديكال (B. Braun Medical)Aesculap (BD224R)
تدفق صفائحي رأسي كابينة التدفق الصفائحيالأداةبوردينولاOR-ST 1500
جهاز خلط دوامي (Vortex mixer)أداةFisher ScientificFB15012
حمام مائيأداةرايبا®

المراجع

  1. Blanco, J., Egozcue, J., Vidal, F. Incidence of chromosome 21 disomy in human spermatozoa as determined by fluorescent in-situ hybridization. Hum. Reprod. 11, 722-726 (1996).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة