مقالة منهجية

مرحبا - C : طريقة لدراسة الهندسة المعمارية ثلاثي الأبعاد للخريطة جينوم.

415.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/1869

⸱

مايو 6, 2010

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Program in Gene Function and Expression, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, University of Massachusetts Medical School, 2Broad Institute of Harvard and Massachusetts Institute of Technology, 3Division of Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 4Program for Evolutionary Dynamics, Department of Organismic and Evolutionary Biology, Department of Mathematics, Harvard University , 5Department of Applied Mathematics, Harvard University , 6Department of Physics, Massachusetts Institute of Technology, 7Department of Systems Biology, Harvard Medical School, 8Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

الأسلوب مرحبا - C يتيح تحديد غير منحازة ، الجينوم واسعة من التفاعلات لونين (1). مرحبا - C الأزواج القرب وربط تسلسل موازية على نطاق واسع. ويمكن استخدام البيانات الناتجة لدراسة الهندسة المعمارية الجينومية على مستويات متعددة : النتائج الأولية التي تم تحديدها ميزات مثل الأراضي الصبغي ، وفصل لونين المفتوحة والمغلقة ، وهيكل لونين على نطاق megabase.

الملخص

للطي ثلاثية الأبعاد من الكروموسومات compartmentalizes والجينوم ، ويمكن تحقيق العناصر الفنية البعيدة ، مثل المروجين ومحسنات ، في القرب المكاني وثيق 2-6. سوف فك العلاقة بين المنظمة والنشاط الجينوم الكروموسوم مساعدة في فهم العمليات الجينومية ، مثل النسخ والتكرار. ومع ذلك ، لا يعرف إلا القليل حول كيفية الكروموسومات أضعاف. المجهر غير قادر على التمييز بين أعداد كبيرة من مواضع في وقت واحد أو في دقة عالية. حتى الآن ، والمطلوب الكشف عن التفاعلات الكروموسومات باستخدام كروموسوم التقاط التشكل (3C) والتعديلات اللاحقة على اختيار مجموعة من مواضع الهدف ، مما يجعل دراسات الجينوم على نطاق 70-10 مستحيلا.

قمنا بتطوير مرحبا - C ، امتدادا ل3C القادرة على تحديد التفاعلات طويلة المدى بطريقة غير منحازة الجينوم واسعة. في مرحبا - C ، يتم إصلاح الخلايا مع الفورمالديهايد ، مما تسبب في أن تكون ملزمة التفاعل المكاني لبعضهم البعض عن طريق الحمض النووي والبروتينات التساهمية عبر الوصلات. عندما تم تجزئة الحمض النووي لاحقا مع انزيم التقييد ، تبقى مرتبطة هذه المكاني. وأدرج رواسب biotinylated كما تمتلئ يتدلى 5 'فيها يتم تنفيذ التالي ، كليلة نهاية ربط في ظل الظروف المخففة التي تؤيد الربط بين الأحداث شظايا الحمض النووي عبر ربط. هذه النتائج في مكتبة الجينوم واسعة من منتجات الربط ، المقابلة لأزواج من الشظايا التي كانت أصلا على مقربة من بعضها البعض في النواة. ويتسم كل منتج مع ربط البيوتين في موقع التقاطع. غير المنفصمة المكتبة ، ويتم سحبها إلى أسفل وتقاطعات مع حبات streptavidin. ويمكن بعد ذلك يتم تحليل التقاطعات تنقية باستخدام التسلسل الإنتاجية العالية ، مما أدى إلى كتالوج من شظايا التفاعل.

التحليل المباشر لمصفوفة الاتصال يكشف العديد من الميزات الناتجة من التنظيم الجيني ، مثل وجود كروموسوم الأراضي وجمعية تفضيلية من الكروموسومات الجينات الصغيرة الغنية بالنفط. ويمكن تطبيق تحليل الارتباط إلى مصفوفة الاتصال ، مما يدل على أن يتم الفصل في الجينوم البشري إلى قسمين : مقصورة تحتوي على أقل المكتظ بالسكان لونين مفتوحة ومتاحة ، ونشط وحجرة مغلقة تحتوي على أكثر كثافة ، والمناطق التي يتعذر الوصول إليها لونين ، ونشط. أخيرا ، كشف تحليل فرقة من المصفوفة الاتصال ، إلى جانب الاشتقاقات النظرية والمحاكاة الحاسوبية ، وأنه في نطاق megabase مرحبا - C يكشف ملامح تتفق مع التشكل كرية كسورية.

البروتوكول

وقد استخدم هذا الأسلوب في البحث عنها في ليبرمان ، ايدن وآخرون ، العلوم 326 ، 289-293 (2009) .

أولا يشابك ، والهضم ، تمييز ينتهي الحمض النووي ، وربط نهاية بلانت

  1. مرحبا - C تبدأ يشابك من الخلايا ، التي هي القاسم المشترك بين جميع أساليب 3C مقرا لها. لتبدأ ، وينمو بين 2 × 10 7 و 2.5 × 7 10 خلايا الثدييات ، وإما ملتصقة أو في التعليق ، وتشعبي الخلايا. (للاطلاع على تفاصيل يشابك من الخلايا ، الرجاء راجع : 11
  2. ليز الخلايا في 550 lysisbuffer ميكرولتر (500 ميكرولتر 10 ملي تريس - 8.0 درجة الحموضة حمض الهيدروكلوريك ، و 10 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 0.2 ٪ Igepal CA - 630 و 50 مثبطات الأنزيم البروتيني ميكرولتر) باستخدام الخالط. تدور في لونين في 5000 دورة في الدقيقة ، ويغسل بيليه مرتين مع 500 ميكرولتر NEBuffer 1X 2.
  3. Resuspend على لونين في 1X NEBuffer 2 ، 5 في قسامة أنابيب مرقمة وإضافة 1X NEBuffer 2 إلى الحجم النهائي من 362 ميكرولتر. إضافة 38 ميكرولتر SDS 1 ٪ ، مزيج بعناية واحتضان عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. مكان الأنابيب مرة أخرى على الجليد على الفور بعد الحضانة.
  4. إخماد SDS بإضافة 44 تريتون ميكرولتر X - 100 وتخلط جيدا. هضم لونين من خلال إضافة 400 وحدة من واحتضان HindIII عند 37 درجة مئوية خلال الليل في حين تناوب.
  5. الخطوات التالية هي مرحبا - C محددة وتشمل علامات الحمض النووي تنتهي مع البيوتين وأداء حادة في نهاية ربط شظايا crosslinked. وسوف تسمح هذه الخطوة ليكون منقى تقاطعات ربط في وقت لاحق. 1 لا ينبغي الخضوع أنبوب الخطوة biotinylation وينبغي أن تبقى منفصلة بدلا من ذلك ، ويكون بمثابة الرقابة 3C لضمان الهضم ، وشروط الربط والأمثل.
  6. في ملء جزء يتدلى التقييد وعلامة على الحمض النووي تنتهي مع البيوتين في أنابيب 4 المتبقية ، إضافة 1.5 ميكرولتر dATP 10 مم ، 1.5 ميكرولتر dGTP 10 مم ، 1.5 ميكرولتر 10 ملي dTTP ، 37.5 ميكرولتر 0.4 ملي البيوتين - 14 - dCTP و 10 Klenow 5U/μl ميكرولتر لأنابيب 2-5. مزيج بعناية واحتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  7. وضع أنابيب على الجليد. لإبطال نشاط الإنزيمات ، وإضافة 86 ميكرولتر SDS 10 ٪ لتصل إلى 1-5 الأنابيب. احتضان الأنابيب عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة بالضبط ووضعها على الجليد بعد ذلك على الفور.
  8. يتم تنفيذ عملية ربط في ظل الظروف المخففة للغاية من أجل صالح ربط بين الأحداث شظايا crosslinked. العمل على الجليد ، إضافة 7.61 مل مزيج ربط [745 ميكرولتر 10 ٪ تريتون X - 100 ، و 745 ميكرولتر العازلة ربط 10X (500 ملي تريس - 7.5 درجة الحموضة حمض الهيدروكلوريك ، و 100 ملي MgCl 2 ، 100 ملي DTT) ، 80 ميكرولتر 10 ملغ / مل BSA والمرقمة من 80 ميكرولتر 100 ملي ATP و5.96 مل من الماء] إلى كل من خمسة أنابيب 15 مل. نقل كل خليط لونين المهضوم إلى أنبوب الموافق 15 مل.
  9. لربط 3C العادية ، وإضافة 10 ميكرولتر 1U/μl يغاز T4 DNA إلى أنبوب 1. لربط مرحبا - C - كليلة النهاية ، تضاف 50 ميكرولتر 1U/μl يغاز T4 الحمض النووي لأنابيب 2-5. مزيج بواسطة أنابيب في قلب واحتضان جميع أنابيب 5 لمدة 4 ساعات في 16 درجة مئوية.
  10. ويتم عكس Crosslinks البروتين المتدهورة بإضافة 50 ميكرولتر 10 ملغ / مل K بروتين في أنبوب واحتضان الأنابيب بين عشية وضحاها على 65 درجة مئوية. إضافة 50 ميكرولتر إضافية 10 ملغ / مل بروتين كاف في أنبوب في اليوم التالي والاستمرار في حضانة لمدة 65 ساعة 2 درجة مئوية.
  11. تبريد مخاليط رد فعل على درجة حرارة الغرفة ونقلها إلى أنابيب مخروطية five 50 مل. تنقية الحمض النووي في هذه الأنابيب عن طريق إجراء استخراج الفينول. إضافة 10 مل من الفينول 8.0 درجة الحموضة ودوامة لمدة 2 دقيقة. تدور الأنابيب لمدة 10 دقيقة في 3500 دورة في الدقيقة ونقل بعناية أكبر قدر من المرحلة المائية ممكن لأنبوب جديد 50 مل.
  12. كرر استخراج الرقم الهيدروجيني باستخدام الفينول 8.0 : كلوروفورم (1:1) وترسيب الحمض النووي باستخدام الايثانول. (للاطلاع على تفاصيل تنقية الحمض النووي ، الرجاء راجع : 11
  13. بعد الطرد المركزي من الايثانول عجلت الحمض النووي ، ويحل كل بيليه الحمض النووي في 450 TE 1X ميكرولتر (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0 ، 1 ملم EDTA). نقل الخليط الحمض النووي لأنبوب الطرد المركزي مل 1.7.
  14. يتم إجراء جولة أخرى من تنقية عن طريق القيام 2 الفينول : كلوروفورم الاستخراج. إضافة 500 درجة الحموضة الفينول ميكرولتر 8.0 : كلوروفورم (1:1) ، ودوامة لمدة 1 دقيقة. أنابيب الطرد المركزي لمدة 5 دقائق على 14000 دورة في الدقيقة ونقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد. بعد استخراج الثانية ، ترسيب الحمض النووي عن طريق إضافة كمية من NaOAc 0.1x ، وحجم 2X من الإيثانول بنسبة 100 ٪ واحتضان 30 دقيقة في -80 درجة مئوية.
  15. بعد الغزل أسفل الحمض النووي عجل ، ويغسل كل بيليه الحمض النووي مع الايثانول 70 ٪ وresuspend كل بيليه الحمض النووي في 25 TE 1X ميكرولتر. تتحلل أي الحمض النووي الريبي التي قد تكون موجودة وذلك بإضافة 1 ميكرولتر 1 ملغ / مل ريبونوكلياز أنبوب الواحد واحتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تجمع محتويات مرحبا - C من أنابيب 2-5 ، لا تزال تحتفظ أنبوب 1 منفصلة كعنصر تحكم 3C.
  16. الآن فرصة جيدة لفحص ووسم مرحبا - C وكفاءة الربط. هذه الضوابط هي مؤشرات ممتازة سواء من مكتبة مرحبا - C سوف يكون ناجحا.
    1. للتحقق من نوعية وكمية من المكتبات ، وتشغيل 2 و 6 ميكرولتر aliquots ميكرولتر من التخفيفات 1:10 من كلا 3C والمكتبات مرحبا - C على agarose هلام 0.8 ٪. (انظر الشكل 2A)
    2. يتم التحقق من العلامات مرحبا - C - C ومرحبا كفاءة الربط عن طريق فحص PCR هضم. نجاح التعبئة وربط لموقع HindIII (AAGCTT) بإنشاء موقع لتقييد NheI انزيم (GCTAGC). يتم تضخيمه منتج ربط خاص يتكون من اثنين شظايا تقييد قريب مع PCR (كما في 11 3C باستخدام 0.2 ميكرو لتر من كل مكتبة كقالب. يتم هضمها في وقت لاحق مع HindIII المنتجات PCR ، NheI أو كليهما ، وبعد تشغيل هذه العينات على جل 2 ٪ ، يمكن تقدير العدد النسبي لل3C وربط الأحداث مرحبا - C عن طريق قياس كثافة من عصابات قطع وتقطيعه (انظر الشكل 2B).
  17. ولن بعض شظايا تم ligated : لتجنب سحب عليهم في وقت لاحق ، وإزالة هذه الغايات من البيوتين unligated باستخدام النشاط نوكلياز خارجية من الحمض النووي بوليميريز T4.
    1. تتم إزالة البيوتين - 14 - dCTP على طرفي DNA غير ligated مع النشاط نوكلياز خارجية من الحمض النووي بوليميريز T4. مزيج من 5 ميكروغرام مرحبا - C مكتبة مع 1 ميكرولتر BSA ملغ / مل 10 ، 10 ميكرولتر NEBuffer 10X 2 ، 1 ميكرولتر dATP 10 ملم ، 1 ميكرولتر dGTP 10 ملم وحدات 5 T4 بوليميريز الحمض النووي في وحدة تخزين ما مجموعه 100 ميكرولتر واحتضان و الخليط في 12 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. إذا كان ذلك ممكنا ، يتم تنفيذ العديد من ردود الفعل ميكروغرام 5.
    2. تم إيقاف التفاعل بإضافة 2 ميكروليتر M EDTA 0.5 درجة الحموضة 8.0.
    3. لتنقية الحمض النووي ، ودرجة الحموضة الفينول 8.0 : يتم كلوروفورم (1:1) تليها هطول الأمطار استخراج الايثانول.
    4. يتم تجاهل طاف ومعلق الكريات الحمض النووي والمجمعة في الحجم الكلي للمياه 100 ميكرولتر.

II. القص واختيار الحجم

  1. لجعل الحمض النووي biotinylated مناسبة للتسلسل عالية الإنتاجية ، لا بد من الحمض النووي المنفصمة إلى حجم 300-500 basepairs مع صك S2 Covaris (5 دورة العمل ، وكثافة 5 ، دورة / انفجار 200 ، الوقت 60 ثانية لمدة 4 دورات) .
  2. لإصلاح الحمض النووي تنتهي المنفصمة ، إضافة 14 ميكرولتر العازلة ربط 10X ، 14 ميكرولتر 2.5 مزيج dNTP ملم ، 5 ميكرولتر بوليميريز الحمض النووي T4 ، 5 ميكرولتر كيناز عديد النوكليوتيد T4 ، 1 الحمض النووي بوليميريز Klenow ميكرولتر المياه و 1 ميكرولتر. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. التالية الحضانة ، استخدام عمود MinElute Qiagen لتنقية الحمض النووي وفقا لتوصيات الشركة الصانعة. أزل الحمض النووي مرتين مع 1X 15 ميكرولتر تريس المنخفض EDTA (TLE : 10 مم تريس الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 0.1 ملم EDTA). ثم إرفاق dATP لينتهي 3 'من الحمض النووي في نهاية اصلاحها من خلال إضافة 5 ميكرولتر NEBuffer2 10X ، 10 ميكرولتر dATP 1 ملم ، 2 و 3 الماء ميكرولتر Klenow ميكرولتر (إكسو). احتضان رد فعل لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. لتعطيل جزء Klenow ، احتضان ردود الفعل لمدة 20 دقيقة عند 65 درجة مئوية وباردة في وقت لاحق ردود الفعل على الجليد. باستخدام speedvac ، والحد من حجم رد الفعل إلى 20 ميكرولتر.
  5. المقبل ، تحميل الحمض النووي في جل agarose 1.5 ٪ مع 1X TAE وتشغيل لمدة 3.5 ساعات في 90V - 80. بعد تلطيخ الجل الأخضر مع SYBR ، تصور الحمض النووي على DarkReader. شظايا الحمض النووي الاستهلاك بين 300 و 500 و أزواج قاعدة تنقية لهم استخراج Qiagen طقم الجل باستخدام الأعمدة 2-4 اعتمادا على وزن الجل. أزل الحمض النووي مع TLE 1X 50 ميكرولتر.
  6. الجمع بين eluates من الأعمدة Qiaquick وجلب الحجم النهائي يصل إلى 300 ميكرولتر مع 1X TLE. أخيرا ، تحديد تركيز الحمض النووي مع مقايسة كوانت - IT باستخدام مقياس التألق و qubit وحساب المبلغ الإجمالي من الحمض النووي.

III. البيوتين المنسدلة وتسلسلها المقترنة نهاية

  1. في هذا الجزء من البروتوكول ، ويتم ربط تقاطعات تنقيته من تجمع الحمض النووي ، والسماح لتحديد كفاءة من التفاعل من قبل الاقتران لونين شظايا نهاية التسلسل. تنفيذ كافة الخطوات اللاحقة في أنابيب LoBind الحمض النووي.
  2. حبات لإعداد البيوتين المنسدلة بغسل 150 ميكرولتر معلق الخرز streptavidin المغناطيسي مرتين مع 400 مخزن توين ميكرولتر (السل : 5 مم تريس - حمض الهيدروكلوريك الحموضة 8.0 ، 0.5 مم EDTA ، 1 M كلوريد الصوديوم ، توين 0.05 ٪).
    وهذه في المستقبل يغسل تتألف من خمس خطوات :
    1. إضافة إلى العازلة الخرز
    2. نقل الخليط إلى أنبوب جديد
    3. تدوير العينة لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة
    4. استعادة الخرز باستخدام مكثف الجسيمات المغناطيسية
    5. إزالة طاف
  3. Resuspend الخرز في 300 2X ميكرولتر لا العازلة توين (2X حظر التجارب النووية : 10 مم ، تريس حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0 ، 1 ملم EDTA ، 2 م كلوريد الصوديوم) وتتحد مع الحمض النووي مرحبا 300 - C ميكرولتر. السماح للالبيوتين المسمى مرحبا - C الحمض النووي لربط الخرز streptavidin التي يحتضنها هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة مع التناوب.
  4. استعادة الحمض النووي ملزمة الخرز streptavidin مع concentr الجسيمات المغناطيسيةأتور ، وإزالة طاف. تغسل حبات في 400 NTB 1X ميكرولتر (5 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0 ، 0.5 مم EDTA ، 1 M كلوريد الصوديوم) ، يليه 100 ميكرولتر العازلة ربط 1X. Resuspend الخرز في 50 ميكرولتر العازلة 1X ربط ونقل الخليط إلى أنبوب جديد.
  5. لإعداد تسلسل الحمض النووي لالبورشيد نهاية الموثوقة ، يأخذ المبلغ الإجمالي من الحمض النووي تستخدم كمدخل لالبيوتين المنسدلة ، والتي تم حسابها في الخطوة السابقة 2.6 ، ونقسمه على 20 لتقدير كمية مرحبا - C الحمض النووي الذي تم هدم ويتوفر للربط. إضافة 6 picomoles البورشيد من محولات الموثوقة في نهاية ميكروغرام من الحمض النووي مرحبا - C المتاحة للربط. 1200 وحدة استخدام الحمض النووي ليغاز T4 ligate المحولات على الحمض النووي. احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. إزالة غير ligated محولات نهاية الموثوقة التي استصلاح مرحبا DNA - C الخرز ملزمة وغسل حبات مرتين مع السل 1X 400 ميكرولتر.
  7. تغسل حبات مع 200 ميكرولتر 1X حظر التجارب النووية ، تليها ميكرولتر 200 ثم 50 ميكرولتر 1X NEBuffer 2. بعد غسل الماضي ، resuspend الخرز في 50 NEBuffer 1X ميكرولتر (2) ونقل إلى أنبوب جديد.
  8. لتحديد عدد الدورات اللازمة لتوليد ما يكفي من المنتجات PCR لتسلسل ، تشكيل أربع لاختبار ردود الفعل PCR مع دورات 6 ، 9 ، 12 أو 15. (للاطلاع على تفاصيل PCR التضخيم ، الرجاء راجع : 12 تحديد عدد دورة الأمثل عن طريق تشغيل تفاعلات PCR على هلام بولي أكريلاميد 5 ٪ ، وتلطيخ مع الأخضر Sybr ، وضمان عدم وجود عصابات زائفة وجود مسحة بين 400 --. أزواج قاعدة 600 ، والذي هو طول المنتجات المنفصمة بعد ربط إلى المحولات.
  9. تضخيم بقية حبات streptavidin مرحبا - C - مكتبة محددة في PCR على نطاق واسع مع عدد من دورات PCR الأمثل. تجمع المنتجات PCR منفصلة من الآبار واستصلاح الخرز. الاحتفاظ بنسبة 1 ٪ من الناتج كبيرة الحجم PCR منفصلة لتشغيل على الجل وتطهير ما تبقى من المنتج PCR مع 1.8x الخرز Ampure حجم وفقا لتوصيات الشركة الصانعة.
  10. أزل الحمض النووي مع 50 ميكرولتر العازلة TLE 1X وقارن بين 1 ٪ من الناتج حبة Ampure PCR المنقى إلى قسامة 1 ٪ من الناتج PCR الأصلي على هلام بولي أكريلاميد 5 ٪ ، وضمان النجاح في إزالة الاشعال PCR.
    1. نوصي أيضا استنساخ 1 ميكرولتر من مكتبة مرحبا - C وتحديد المنتج من الحيوانات المستنسخة باستخدام حوالي 100 سانغر التسلسل. هذا سوف تمكنك من تقييم العدد النسبي للalignable مرحبا - C يقرأ في خليط PCR. من أجل تحقيق النتائج النموذجية ، انظر الشكل 3B.
  11. تسلسل مكتبة مرحبا - C مع نهاية التسلسل البورشيد المقترنة. كل نهاية محاذاة بشكل مستقل باستخدام MAQ (http://maq.sourceforge.net/) للتعرف على لونين شظايا التفاعل.

رابعا. ممثل مرحبا - C النتائج

  1. ومن المتوقع أن النتائج التالية عند البروتوكول مرحبا - C يتم تنفيذه بشكل جيد من الناحية الفنية ويمكن النظر فيها معايير ضبط الجودة.
  2. وينبغي مراقبة الجودة خطوات تكشف أن كلا من المكتبات ومرحبا 3C C - تشغيل نطاقات ضيقة وليس أكبر من 10 كيلو بايت. ويشير تشويه الحمض النووي الفقراء كفاءة الربط. عادة ، وكفاءة ربط أقل قليلا في مكتبة مرحبا - C مقارنة قالب 3C (انظر الشكل 2A).
  3. ويمكن تقدير مرحبا - C وسم والكفاءة من خلال ربط عملية الهضم من منتج PCR تم إنشاؤها باستخدام 3C الاشعال. يتم قطع الوصلات التي 3C HindIII وليس NheI. العكس صحيح بالنسبة لتقاطعات مرحبا - C. هذا الاختبار هضم PCR تبين أن تقطع 70 ٪ من مرحبا - C amplicons بواسطة NheI وليس HindIII ، مؤكدا بمناسبة كفاءة ربط تقاطعات (انظر الشكل 2B).
  4. تحليل التسلسل يقرأ ينبغي أن تظهر أن يقرأ كلا من التفاعلات تأشب داخل وبين الصبغيات الذي يشار إليه بواسطة خطوط زرقاء وحمراء ، محاذاة أقرب كثيرا إلى مواقع تقييد HindIII مقارنة عشوائيا يقرأ ، كما هو موضح باللون الأخضر (انظر الشكل 3A).
  5. في تجربة ناجحة ، و 55 ٪ من أزواج alignable قراءة تمثل التفاعلات بين الصبغيات. خمسة عشر في المئة تمثل التفاعلات بين تأشب داخل شظايا أقل من 20 كيلو بايت و 30 ٪ باستثناء تأشب داخل أزواج وقرأت أن أكثر من 20 كيلوبايت وبصرف النظر (انظر الشكل 3B). قد يكون هذا التوزيع عينات قبل التسلسل الإنتاجية العالية ، باعتبارها شكلا من أشكال مراقبة الجودة ؛ الاستنساخ وسانغر التسلسل من الحيوانات المستنسخة حوالي 100 وعادة ما يكفي.
  6. ويمكن للتفاعلات لونين يمكن تصور باعتبارها heatmap ، حيث x و ص محاور تمثل مواضع من أجل كل بكسل الجينومية ويمثل عدد من التفاعلات وحظ بينهما. عادة ، سوف شظايا من الحمض النووي التي هي قريبة جدا من بعضها البعض في الجينوم الخطية لديهم ميل لتتفاعل مع بعضها البعض في كثير من الأحيان. وينظر الى هذا الأمر في heatmaps تأشب داخل باعتبارها قطري بارز (انظر الشكل 4A).
  7. تظهر النتائج التالية طرق مختلفة لتحليل البيانات للكشف عن مستويات مختلفة من التنظيم الجينوم. المتهم بالتآمر في probabilit الاتصالذ المسافة الجينومية مقابل (انظر الشكل 5A) يدل على ان احتمال انخفاض الاتصال بوصفها وظيفة من المسافة الجينومية ، ووصلت في النهاية إلى الهضبة. في كل المسافة ، والتفاعلات تأشب داخل المخصب ، كما هو موضح في خط متصل ، بالنسبة للتفاعلات بين الصبغيات ، ممثلة في الخطوط المتقطعة. هذا يعني وجود مباشر للأراضي الصبغي.
  8. حساب عدد وحظ / المتوقع من الاتصالات بين الصبغيات بين كل زوج من الكروموسومات يكشف الجمعيات التفضيلية بين أزواج كروموسوم معين. الكروموسومات الجينات الغنية صغيرة تتفاعل مع بعضها البعض بشكل تفضيلي ، وأشارت حسب اللون الأحمر الساطع (انظر الشكل 5B).
  9. ويمكن أيضا أن تكون فردية الكروموسومات فحصها. يمكن تعديل heatmap الخام باستخدام heatmap المتوقع لحساب المسافة بين أزواج من الجينومية المكاني ، مما أسفر عن heatmap وحظ / المتوقع. ثم ، يمكن إنتاج مصفوفة الارتباط عن طريق الربط بين الصفوف والأعمدة لاحظ heatmaps / المتوقع. تحليل الارتباط به ، ويتضح أن تفصل الجينوم البشري إلى قسمين. ويتضح هذا من النمط منقوشة في heatmaps الارتباط (انظر الشكل 4A - D). (لمزيد من التفاصيل لتحليل البيانات مرحبا - C ، يرجى الاطلاع على : 1.
  10. مرحبا به - C البيانات ، واكتسبت رؤى جديدة قابلة للطي في لونين على نطاق megabase. النموذج الكلاسيكي للالتكثيف البوليمر تشير إلى أن حزم لونين الى كرية التوازن. احتمال التآمر الاتصال بوصفها وظيفة من المسافة يوضح أن موازين احتمال اتصال حسب قانون السلطة مع المسافة التي الجينومية المنحدر هي -1 تقريبا (أنظر الشكل 6A). هذا لا يتفق مع السلوك من كرية التوازن ، ولكن لا تطابق التوقعات لهيكل بديل يعرف كرية كسورية (انظر الشكل 6B).
  11. هنا ، تظهر هيكلين كروي. تلوين يناظر المسافة من نقطة النهاية ، بدءا من اللون الأزرق إلى السماوي والأخضر والأصفر والبرتقالي ، والأحمر (انظر الشكل العلوي 6C). خلافا كريات التوازن ، كريات كسورية عدم التشابكات. كرية في كسورية ، التي هي مواضع مجاورة على طول محيط تميل الى ان تكون قريبة في 3D ، مما أدى إلى وجود كتل أحادي اللون (انظر الشكل 6C الأوسط). لم يتم العثور على هذه القطع في كرية التوازن (انظر الشكل أسفل 6C).

figure-protocol-1
الشكل 1. مرحبا - C نظرة عامة. هي خلايا عبر ربط مع الفورمالديهايد ، مما أدى إلى الروابط التساهمية بين القطاعات المتاخمة لونين مكانيا (شظايا الحمض النووي : الأزرق والأحمر الداكن ، البروتينات ، التي يمكن أن يتوسط هذه التفاعلات ، وتظهر باللون الأزرق السماوي وضوء). غير المهضوم لونين مع انزيم التقييد (هنا ، HindIII ؛ موقع التقييد : خط متقطع ، انظر الشكل). تمتلئ ينتهي في الناتج زجة مع النيوكليوتيدات ، واحدة منها هي biotinylated (نقطة اللون الأرجواني). يتم إجراء عملية ربط للغاية في ظل الظروف المخففة لصالح ربط الأحداث ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ ؛ فقدان موقع HindIII ويتم إنشاء موقع NheI (الشكل). يتم تنقية الحمض النووي والمنفصمة ، ويتم عزل تقاطعات biotinylated باستخدام الخرز streptavidin. يتم تحديدها بواسطة شظايا التفاعل إقران نهاية التسلسل.

figure-protocol-2
الشكل 2. الجودة مكتبة مرحبا - C الضوابط. (أ) تم حل كميات متزايدة من السيطرة 3C ومكتبة مرحبا - C على agarose هلام 0.8 ٪. كلا مكتبات تشغيل ك عصابة ضيقة بدلا أكبر من 10 كيلو بايت. نموذجية الكفاءة في مكتبة ربط مرحبا - C أقل قليلا مما هو ملاحظ في قالب 3C ، ودلت عليه مسحة في الممرات مرحبا - C. (ب) مراقبة PCR الهضم. يتم تضخيمه مفترق طرق ربط شكلت من قبل اثنين من شظايا القريبة باستخدام معيار 3C ظروف PCR. ويمكن التمييز بين المنتجات ربط مرحبا - C من تلك المنتجة في 3C التقليدية من خلال هضم ربط الموقع. يتم قطع مرحبا - C التقاطعات التي NheI ، وليس HindIII ، والعكس هو الصحيح لتقاطعات 3C. وقطعت 70 ٪ من مرحبا - C amplicons بواسطة NheI ، مؤكدا كفاءة وسم ربط تقاطع. تم تنفيذ اثنين من يعيد لضمان تقدير موثوق بها.

figure-protocol-3
الشكل 3. قراءة مرحبا - C مراقبة الجودة. (أ) مرة من شظايا المقابلة لكلا تأشب داخل (الأزرق) ، وبين الصبغيات (أحمر) التفاعلات محاذاة أقرب كثيرا إلى مواقع تقييد HindIII بالمقارنة مع القراءات عشوائيا (الخضراء). كل من يقرأ وبين الصبغيات تأشب داخل يقرأ منحنيات الانخفاض بسرعة مع زيادة المسافة من موقع HindIII حتى يتم التوصل إلى الهضبة على مسافة 500 سنة مضت ~. هذا يتوافق مع الحد الأقصى لحجم القطعة المستخدمة في التسلسل. (ب) عادة ، و 55 ٪ من أزواج alignable قراءة تمثل التفاعلات بين الصبغيات. خمسة عشر في المئة تمثل التفاعلات بين تأشب داخل شظايا أقل من 20 كيلو بايتوبصرف النظر و 30 ٪ من أزواج تأشب داخل قرأت أن أكثر من 20 كيلوبايت إربا. قد يكون هذا التوزيع عينات قبل التسلسل الإنتاجية العالية ، باعتبارها شكلا من أشكال مراقبة الجودة ؛ الاستنساخ وسانغر التسلسل من الحيوانات المستنسخة حوالي 100 وعادة ما يكفي.

figure-protocol-4
الشكل 4. تحليل الارتباط يوضح أن فصل النواة إلى قسمين. (A) Heatmap الموافق تأشب داخل التفاعلات على الصبغي 14. كل بكسل يمثل جميع التفاعلات بين الموضع 1 ميغابايت ، وآخر موضع 1 ميغابايت ؛ كثافة يتوافق مع مجموع عدد القراءات (المدى : 000-200 يقرأ). علامات التجزئة تظهر كل 10 ميغابايت. يسلك heatmap طيدة في شكل مائل مكثفة وكوكبة من كتل كبيرة. (كروموسوم 14 هو طرفي القسيم المركزي ؛ لا يظهر الذراع القصير) استخدام ورقة العمل مرحبا - C لحساب احتمال اتصال المتوسط ​​لزوج من مواضع على مسافة الجينومية معين ، ويتم إنتاج مصفوفة التوقع (B) المقابلة لماذا سيكون لاحظ إذا لم تكن هناك هياكل طويلة المدى. الحاصل من هذه المصفوفات اثنين مصفوفة لاحظ / المتوقع (C) حيث تظهر باللون الأزرق واستنزاف لتخصيب اليورانيوم في الحمراء [مجموعة : 0.2 (الأزرق) إلى 5 (أحمر)]. نمط كتلة يصبح أكثر وضوحا. مصفوفة الارتباط (D) يوضح العلاقة [مجموعة : -1 (الأزرق) إلى 1 (الحمراء)] ملامح التفاعل بين تأشب داخل كل زوج من مواضع على طول الكروموسوم 14. نمط منقوشة ضرب يدل على وجود اثنين من المقصورات داخل الكروموسوم.

figure-protocol-5
الشكل 5. حضور وتنظيم الأراضي الصبغي. (أ) يقلل احتمالات الاتصال بوصفها وظيفة من المسافة الجينومية على الكروموسوم 1 ، التوصل في نهاية المطاف في هضبة ~ 90Mb (الأزرق). مستوى الاتصال بين الصبغيات (شرطات سوداء) يختلف عن أزواج مختلفة من الكروموسومات ؛ المكاني على الكروموسوم 1 هي الأكثر احتمالا للتفاعل مع مواضع على الصبغي 10 (شرطات خضراء) وأقل احتمالا للتفاعل مع مواضع على الصبغي 21 (شرطات الحمراء). ونضبت التفاعلات بين الصبغيات النسبي للتفاعلات تأشب داخل. (ب) : لاحظ / يتوقع عدد من الاتصالات بين الصبغيات بين كل زوج من الكروموسومات. أحمر يدل على التخصيب ، والأزرق يشير إلى نضوب [النطاق : 0.5 (الأزرق) إلى 2 (الحمراء)]. الصغيرة ، الغنية الكروموسومات الجينات تميل أكثر للتفاعل مع بعضها البعض.

figure-protocol-6
الرقم 6 ، والتعبئة المحلية للونين يتفق مع سلوك كرية كسورية. (أ) بلغ متوسط ​​احتمال الاتصال بوصفها وظيفة من المسافة الجينومية ، عبر الجينوم (الأزرق). وينظر الى توسيع نطاق قانون السلطة بارزة بين 500KB و7MB (المنطقة المظللة) مع ميل -1.08 (تناسب هو مبين في السماوي). (ب) نتائج المحاكاة لاحتمال الاتصال بوصفها وظيفة من المسافة للتوازن (أحمر) وكريات كسورية (الأزرق). المنحدر عن كرية كسورية جدا ما يقرب من -1 (السماوي) ، مما يؤكد توقعاتنا نظرية الرواية 1. المنحدر لكرية التوازن هو -3 / 2 ، والذي يطابق التوقعات النظرية السابقة. المنحدر للكرية كسورية يشبه المنحدر وحظ في نتائج مرحبا - C ، في حين لا ينظر المنحدر لكرية التوازن في البيانات مرحبا - C. (C) الأعلى : سلسلة البوليمر تكشفت ، 4000 مونومرات طويلة. تلوين يناظر المسافة من نقطة النهاية ، بدءا من اللون الأزرق إلى السماوي والأخضر والأصفر والبرتقالي ، والأحمر الأوسط : مثال نموذجي لكرية كسورية استخلاصها من الفرقة لدينا. كريات كسورية عدم التشابكات. مواضع التي هي في مكان قريب على طول محيط تميل الى ان تكون قريبة في 3D ، مما أدى إلى وجود كتل كبيرة أحادية اللون التي هي واضحة على السطح وعبر القسم السفلي : إن كرية التوازن. الهيكل هو متشابكا للغاية ؛ مواضع التي هي قريبة على طول محيط (لون مشابه) لا يلزم أن يكون في مكان قريب في 3D.

المناقشة

نقدم وسيلة لدراسة الهندسة المعمارية 3 الابعاد من الجينوم عن طريق تعيين لونين التفاعلات بطريقة غير منحازة الجينوم واسعة. الخطوة الأكثر أهمية التجريبية ما يميز هذه التكنولوجيا وبصرف النظر عن الأعمال السابقة -- هو إدماج biotinylated النيوكليوتيدات في تقييد نهايات crosslinked شظايا حادة قبل نهاية الربط. يمكن إجراء هذه الخطوة بنجاح تسلسل العميق لجميع التقاطعات الربط ، ويعطي مرحبا - C نطاقه وقوته.

فإن عدد القراءات تحدد في نهاية المطاف إلى حل للخرائط التفاعل. هنا ، قدم التفاعل ميغابايت 1 خريطة للجينوم البشري باستخدام ~ 30000000 يقرأ alignable. من أجل زيادة دقة "لجميع الأغراض" من قبل عامل من n ، يجب زيادة عدد القراءات بعامل ن 2.

قد يكون أسلوب مرحبا - C مجتمعة بسهولة مع تقنيات أخرى ، مثل التقاط الهجين بعد جيل مكتبة (لاستهداف أجزاء معينة من الجينوم) ، وبعد ربط مناعي لونين (لدراسة البيئة لونين من المناطق المرتبطة مع بروتينات معينة).

الإفصاحات

براءة اختراع مؤقتة على الطريقة مرحبا - C (رقم 61/100 ، 151) هو قيد الاستعراض.

شكر وتقدير

نشكر ألف Kosmrlj للمناقشات ورمز ؛ AP ايدن ، وباو XR ، برينر M. ، D. المهرجانات ، جوسبر دبليو ، جعفر A. ، ميلينكوف A. ، ميلي A. ، Giannoukos G. ، Nusbaum C. ، AJM Walhout ، L. الخشب ، وZeldovich كاف للمناقشات ، ولام جافني وونغ باء للمساعدة في التصور.

بدعم من فاني ماي وجون هيرتز زمالة الدراسات العليا ، وهي مؤسسة الدفاع الوطنية للعلوم والهندسة زمالة للدراسات العليا ، وهو خريج الزمالة جبهة الخلاص الوطني ، واللجنة الوطنية للفضاء معهد البحوث الطبية الحيوية ، ومنحة لا. T32 HG002295 من المعهد الوطني لبحوث الجينوم البشرية (NHGRI) (EL) ؛ i2b2 (معلوماتية لإدماج الأحياء وسريري) ، والمعاهد الوطنية للصحة التي يدعمها مركز الحوسبة الحيوية الطبية في مستشفى بريجهام ومستشفى النساء ق (LAM) ؛ منحة لا. HG003143 من NHGRI ، ومؤسسة جائزة التميز كيك الباحث الشاب (دينار). وقد تم إيداع البيانات الخام وتعيين تسلسل مرحبا - C في قاعدة بيانات توقعات البيئة العالمية ( www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/ ) ، أي الانضمام. GSE18199. أميبا إضافية متوفرة في http://hic.umassmed.edu .

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مثبطات البروتياز (Protease inhibitors)Sigma-AldrichP8340-5mlالخطوة 1.2
biotin-14-dCTPInvitrogen19518-018الخطوة 1.6
KlenowNew England BiolabsM0210الخطوتان 1.6 و2.2
T4 DNA ligaseInvitrogen15224الخطوة 1.9
T4 DNA polymeraseNew England BiolabsM0203الخطوتان 1.17 و2.2
منظم الربط 10x (10x ligation buffer)New England BiolabsB0202الخطوتان 2.2 و3.4
T4 PNKNew England BiolabsM0201الخطوة 2.2
Klenow (exo-)New England BiolabsM0212الخطوة 2.3
حبيبات Dynabeads MyOne Streptavin C1Invitrogen650.01الخطوة 3.2
T4 DNA ligase HCEnzymaticsL603-HC-Lالخطوة 3.5
Phusion HF mastermixNew England BiolabsF531الخطوة 3.8
حبيبات AmpureBeckman Coulter Inc.A2915الخطوة 3.9

المراجع

  1. Lieberman-Aiden, E., Van Berkum, N. L., Williams, L., Imakaev, M., Ragoczy, T., Telling, A., Amit, I., Lajoie, B. R., Sabo, P. J., Dorschner, M. O., Sandstrom, R., Bernstein, B., Bender, M. A., Groudine, M., Gnirke, A., Stamatoyannopoulos, J., Mirny, L. A., Lander, E. S., Dekker, J. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  2. Kosak, S. T., Groudine, M. Form follows function: the genomic organization of cellular differentiation. Genes and Dev. 18, 1371-1384 (2004).
  3. Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (2007).
  4. Dekker, J. Gene Regulation in the Third Dimension. Science. 319, 1793-1794 (2008).
  5. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nat Rev Genet. 2, 292-301 (2001).
  6. Sexton, T., Schober, H., Fraser, P., Gasser, S. M. Gene regulation through nuclear organization. Nat Struct and Mol Biol. 14, 1049-1055 (2007).
  7. Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. Capturing Chromosome Conformation. Science. 295, 1306-1311 (2002).
  8. Zhao, Z., Tavoosidana, G., Sjölinder, M., Göndör, A., Mariano, P., Wang, S., Kanduri, C., Lezcano, M., Sandhu, K. S., Singh, U., Pant, V., Tiwari, V., Kurukuti, S., Ohlsson, R. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nat Genet. 38, 1341-1347 (2006).
  9. Simonis, M., Klous, P., Splinter, E., Moshkin, Y., Willemsen, R., de Wit, E., van Steensel, B., de Laat, W. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra- and interchromosomal interactions. Nat Genet. 38, 1348-1354 (2006).
  10. Dostie, J., Richmond, T. A., Arnaout, R. A., Selzer, R. R., Lee, W. L., Honan, T. A., Rubio, E. D., Krumm, A., Lamb, J., Nusbaum, C., Green, R. D., Dekker, J. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): A massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Res. 16, 1299-1309 (2006).
  11. Miele, A., Dekker, J. Mapping Cis- and Trans Chromatin Interaction Networks Using Chromosome Conformation Capture (3C). Methods Mol Biol. 464, 105-121 (2009).
  12. Maccallum, I., Przybylski, D., Gnerre, S., Burton, J., Shlyakhter, I., Gnirke, A., Malek, J., McKernan, K., Ranade, S., Shea, T. P., Williams, L., Young, S., Nusbaum, C., Jaffe, D. B. ALLPATHS 2: small genomes assembled accurately and with high continuity from short paired reads. Genome Biol . 10, R103-R103 (2009).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Hi C
مرحبا - C : طريقة لدراسة الهندسة المعمارية ثلاثي الأبعاد للخريطة جينوم.
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.