نحن في هذا التقرير وصفا لطريقة لعزل وثقافة السلف المتخصصة الخلية من الكلى الماوس الجنينية التي يمكن استخدامها لدراسة مسارات الإشارات التي تنظم الجذعية / السلف خلايا الكلى النامية. هذه الخلايا المستزرعة متاحة للغاية لجزيء صغير من البروتين والمؤتلف العلاج ، وأيضا الأهم لتنبيغ الفيروسي ، والذي يسمح للتلاعب كفاءة الممرات مرشح.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العزلة والثقافة في خلايا كلوية المنشأ من منطقة من الفأر الجنينية الكلى
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد تم التطور الجنيني في الكلى درس على نطاق واسع على حد سواء باعتبارها نموذجا للتفاعل الظهارية - الوسيطة في organogenesis واكتساب فهم أصول أمراض الكلى الخلقية. في الآونة الأخيرة ، وقد تم دراسة إمكانية توجيه الخلايا الجذعية الجنينية من السذاجة تجاه مصائر كلوي الناشئة في مجال الطب التجديدي. وقد حددت الدراسات الجينية في الماوس عدة مسارات اللازمة للتنمية في الكلى ، وفهرس عالمي للنسخ الجيني في الجهاز وقد تم مؤخرا إنشاء http://www.gudmap.org/ ، وتوفير العديد من المنظمين مرشح للوظائف التنموية الأساسية. يمكن دراستها Organogenesis في الكلى القوارض في الثقافة الجهاز ، والعديد من التقارير قد استخدمت هذا الأسلوب لتحليل نتائج تطبيق إما بروتينات مرشح أو اسقاط التعبير عن الجينات باستخدام مرشح أو morpholinos سيرنا. ومع ذلك ، يقتصر تطبيق ثقافة الجهاز لدراسة الإشارات التي تنظم الجذعية / تمايز الخلايا السلف مقابل التجديد في الكلى كما تحتوي على أجهزة مثقف ميثاقا نشر المصفوفة خارج الخلية التي تحد من الجزيئات والجسيمات الفيروس. لدراسة الخلية إشارات الأحداث التي تؤثر على الساق / السلف الخلية المتخصصة في الكلى وضعنا نظام الخلية الأساسية التي تحدد منطقة كلوي أو السلف المتخصصة خلية من خلايا الجسم الحي الكلى السابقين النامية بمعزل عن محفز الظهارية للتمايز. باستخدام الهضم الأنزيمي محدودة ، يمكن الخلايا الكلوية منطقة تتحرر بشكل انتقائي من البلدان النامية في الكلى E17.5. بعد الترشيح ، يمكن هذه الخلايا مثقف بوصفه أحادي الطبقة غير النظامية به الظروف الأمثل. علامة تحليل الجينات يدل على أن هذه الثقافات تحتوي على توزيع أنواع الخلايا المميزة للمنطقة كلوي في الجسم الحي ، وأنها تحافظ على التعبير الجيني علامة المناسبة خلال الفترة الثقافة. هذه الخلايا هي سهلة الوصول إلى جزيء صغير من البروتين والمؤتلف العلاج ، وأيضا الأهم لتنبيغ الفيروسية ، مما يسهل كثيرا من دراسة الجذعية / آثار السلف مرشح منظم الخلية. يمكن المعلمات الخلية الأساسية البيولوجية مثل الانتشار النووي وموت الخلية ، وكذلك التغيرات في التعبير عن علامات مميزة الجزيئية للخلايا الجذعية / السلف نفرون في الجسم الحي واستخدمت بنجاح النتائج التجريبية. العمل الجاري في مختبرنا باستخدام هذه الرواية تقنية الخلية الأولية تهدف إلى الكشف عن الآليات الأساسية التي تحكم تنظيم التجديد الذاتي مقابل التمايز في الخلايا الجذعية / نفرون السلف.
البروتوكول
1. إعداد الكواشف لهضم الكلى
- سوف 1.5 مل من كولاجيناز 0.25 ٪ ستكون هناك حاجة إلى (ث / ت) و 1 حل بنكرياتين هضم (ث / V) ٪ لاستخراج الخلايا الكلوية منطقة (NZCs) في الفترة من 8 E17.5 الكلى. بنكرياتين لأن يأخذ حوالي 2 ساعة ليحل في درجة حرارة الغرفة ، وهضم ما يكفي من حل لأكبر عدد من الكليتين الجنينية المتوقعة ينبغي أن تكون المقدمة قبل التجربة. إعداد خلاصة الحل بإضافة أول 25 ملغ من كولاجيناز ألف إلى 10 مل Dulbecco الفوسفات في التخزين المؤقت المالحة (DPBS) بشكل واضح 15 مل ، أنبوب الطرد المركزي العقيمة. فمن الأهمية بمكان أن DPBS لا تحتوي على الكالسي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا البروتوكول وصفنا أسلوبا لعزل الخلايا والثقافة من منطقة كلوي في الكلى الجنينية. هو تطوير وسيلة نشر في البداية كجزء من دراسة لآثار العلاج على خلايا BMP7 المنطقة كلوي (فارغ وآخرون ، 2009). في الدراسة الأولية ، وأجريت سلسلة من التجارب لتحديد خصائص أنواع الخلايا ممثلة في عدد السكان NZC. لفترة وجيزة ، وتنقية للصحفيين من NZCs الوراثية لسدى القشرية (Foxd1 + / lacZ) (. Hatini وآخرون ، 1996) ، وجمع قناة (Hoxb7 + / لجنة المساواة العرقية
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من R01 DK078161 NIDDK (LO) ، زمالات ما بعد الدكتوراه من جمعية القلب الاميركية (AB) ، وأسس Wenner - جرين السويد وKungliga Fysiografiska Sällskapet ، لوند ، السويد (UB). وقدم دعم إضافي من قبل مركز أبحاث مين المعدات الطبية الأساسية معهد التشريح ، وعلم تكنولوجيا المعلومات الحيوي FACS (بدعم من 06 - 2P20RR18789) ومرفق MMCRI الحيوان.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| صانع ساعات’ملقط رقم 5 | شركة Roboz للأدوات الجراحية | RS-4905 | مطلوب زوجان |
| كولاجيناز أ (Collagenase A) | مجموعة روش | 10 103 578 001 | ارتدِ القناع |
| بانكرياتين خنزيري | Sigma-Aldrich | P8096 | ارتدِ القناع |
| محلول منظم من الفوسفات المتوازن بدقة (DPBS) مع الكالسيوم والمغنيسيوم | Lonza Inc. | 17-513F | مع Mg &أدينوسين أحادي الفوسفات؛ كالسيوم |
| مصل جنين البقر (FBS) | BioWhittaker | 14-901E | |
| محلول ملحي متوازن من هانكس (HBSS) | GIBCO، من شركة Life Technologies | 14175 | |
| وسط كيرن-سيروم الخالي من المصل (KSFM) | GIBCO، من إنتاج Life Technologies | 10724-011 | بدون إضافة عوامل نمو |
| إل-جلوتامين 200 ملي مولار | Sigma-Aldrich | G7513 | استخدم بتركيز 1% حجم/حجم |
| PenStrep 10,000 وحدة بنسلين / مل و10 مجم ستريبتومايسين / مل | Sigma-Aldrich | P4333 | استخدم بنسبة 1% حجم/حجم |
| فيبرونكتين | BD Biosciences | 356008 | يُورّد على شكل مسحوق |
| طبق زراعة مكون من 24 بئراً | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 142485 | نيوكلون |
| محلول منظم الفوسفات الملحى المتوازن (DPBS) بدون مغنيسيوم & Ca | Lonza Inc. | 17-512F | |
| أنابيب بولي ستيرين سعة 5 مل | BD Biosciences | 352235 | |
| DNase (1 وحدة/μل) | Invitrogen | 18068-015 | 4 μ1 لكل 1.5 مل |
| مصفاة خلايا بمسامية 40 ميكرون | BD Biosciences | 352235 | مع الغطاء والأنبوب |
| بارافورمالدهيد | Sigma-Aldrich | P6148 | استخدم بتركيز 4% وزن/حجم |
| Triton X100 | VWR international | VW3929-2 | استخدم بتركيز 0.3% حجم/حجم |
| محلول ملحي منظم بالفوسفات | Sigma-Aldrich | P3813 | يتم توريده في شكل مسحوق |
| مصل الحمار | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | استخدم بنسبة 5 % حجماً/حجماً |
| جسم مضاد للأرنب ضد PAX2 | Invitrogen | 71-6000 | خفف بنسبة 1:100 |
| جسم مضاد للأرنب مضاد لـβ-جال | MP Biomedicals | 559762 | خفف بنسبة 1:200 |
| فالويدين Oregon Green 488 | Invitrogen | O7466 | تخفيف بنسبة 1:200 |
| جسم مضاد من الحمار ضد الأرنب Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | تخفيف بنسبة 1:200 |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | تخفيف بنسبة 1:5000 |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| جليسرول | EMD Millipore | GX0185-6 | امزج بنسبة 50% مع H2أو |
| طقم RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | استخدام "معالجة العمود بإنزيم DNase" بروتوكول |
| ماصات نقل، 3 مل | BD Biosciences | 357575 |
المراجع
- Blank, U., Brown, A., Adams, D. C., Karolak, M. J., Oxburgh, L. BMP7 promotes proliferation of nephron progenitor cells via a JNK-dependent mechanism. Development. 136, 3557-3566 (2009).
- Brunskill, E. W., Aronow, B. J., Georgas, K., Rumballe, B., Valerius, M. T., Aronow, J., Kaimal, V., Jegga, A. G., Grimmond, S., McMahon, A. P.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
