مقالة منهجية

iCLIP -- Transcriptome على صعيد رسم الخرائط من البروتين RNA التفاعلات مع القرار الفردي النكليوتيد

DOI:

10.3791/2638

⸱

أبريل 30, 2011

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council - MRC, 2European Bioinformatics Institute, EMBL Heidelberg, 3Computer and Information Science, University of Ljubljana, 4Wellcome Trust Genome Campus, Wellcome Trust Sanger Institute

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الترتيب المكاني للRNA البروتينات ملزم على نص هو أحد المحددات الرئيسية لمرحلة ما بعد النسخي التنظيم. ولذلك ، قمنا بتطوير الفرد والأشعة فوق البنفسجية النوكليوتيدات يشابك القرار ومناعي (iCLIP) الذي يسمح دقيقة الجينوم على نطاق ورسم خرائط للمواقع الملزم للبروتين النووي الريبي ملزمة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تركيبة فريدة والترتيب المكاني للRNA ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) على نسخة دليل الجوانب المتنوعة في مرحلة ما بعد النسخي البند 1. لذلك ، خطوة أساسية نحو تنظيم محضر التفاهم على المستوى الجزيئي هي لاكتساب المعلومات الموضعية على مواقع الربط من الممارسات التجارية التقييدية 2.

ويمكن دراسة البروتينات والحمض النووي الريبي التفاعلات الكيميائية الحيوية باستخدام الأساليب ، ولكن هذه الطرق لا تتناول الحمض النووي الريبي ملزمة في سياقها الأصلي الخلوية. المحاولات الأولية لدراسة البروتينات والحمض النووي الريبي المجمعات في بيئتها الخلوية المستخدمة لتنقية تقارب أو مناعي جنبا إلى جنب مع الفرق عرض أو تحليل ميكروأري (RIP - CHIP) 3-5. وكانت هذه الأساليب عرضة لتحديد التفاعلات غير المباشرة أو غير الفسيولوجية - 6. يشار استراتيجية من أجل زيادة نوعية والقرار الموضعية ، على أنه قدم CLIP (الأشعة فوق البنفسجية عبر ربط ومناعي) 7،8. CLIP يجمع عبر ربط الأشعة فوق البنفسجية من البروتينات وجزيئات الحمض النووي الريبي مع مخططات تنقية صارمة بما في ذلك تغيير طبيعة بولي أكريلاميد هلام إستشراد. بالاشتراك مع تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية ، وقد ثبت CLIP كأداة قوية لدراسة البروتينات والحمض النووي الريبي التفاعل على نطاق والجينوم واسعة (ويشار إلى CLIP - HITS CLIP أو بعدها) 9،10. مؤخرا ، تم إدخال PAR - CLIP يستخدم النظير لريبونوكليوزيد photoreactive عبر ربط 11،12.

على الرغم من نوعية عالية من البيانات التي تم الحصول عليها ، والتجارب CLIP كثيرا ما تولد من التعقيد مكتبات [كدنا] تسلسل محدودة. هذا يرجع جزئيا إلى كمية محدودة من شارك في المنقى واثنين من الحمض النووي الريبي RNA ربط الكفاءة ردود الفعل المطلوبة لإعداد المكتبة. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت المقايسات تمديد التمهيدي cDNAs أن العديد من اقتطاع قبل الأوان بنسبة 13 في النوكليوتيدات crosslinked. يتم فقدان هذه cDNAs اقتطاع خلال بروتوكول CLIP معيار إعداد المكتبة. نحن وضعت مؤخرا iCLIP (فردية النوكليوتيدات CLIP القرار) ، والذي يجسد cDNAs اقتطاعها من خلال استبدال واحدة من الخطوات غير فعالة الربط بين الجزيئات RNA مع التعميم أكثر كفاءة ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ [كدنا] (الشكل 1) 14. الأهم من ذلك ، تسلسل cDNAs اقتطاع يقدم أفكارا في موقف للموقع عبر وصلة في القرار النوكليوتيدات. طبقنا بنجاح iCLIP لدراسة الجسيمات C hnRNP منظمة على نطاق واسع الجينوم وتقييم دورها في تنظيم الربط 14.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الأشعة فوق البنفسجية عبر الربط بين خلايا الأنسجة

  1. إزالة وسائل الاعلام وإضافة 6 مل الجليد الباردة PBS إلى الخلايا المزروعة في صحن 10 سم (ما يكفي لمدة ثلاث تجارب).
  2. إزالة غطاء ووضعت على الجليد. أشرق مرة واحدة مع 150 ميغا جول / سم 2 في 254 نانومتر.
  3. حصاد الخلايا عن طريق كشط مع رافع الخلية.
  4. 2 تعليق نقل خلية لكل مل من ثلاثة microtubes. تدور بسرعة أعلى لمدة 10 ثانية عند 4 درجة مئوية إلى الخلايا بيليه ، ثم إزالة طاف.
  5. الإضافية تجميد الخلية في كريات الثلج الجاف وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2. حبة إعداد

  1. إضافة 100 ميكرولتر من البروتين Dynabeads (Dynal ، 100،02) في تجربة جديدة لmicrotube (استخدام البروتين Dynabeads G للماوس أو أجسام الماعز).
  2. تغسل حبات 2X مع تحلل العازلة (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 و 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ؛ 1 ٪ NP - 40 ؛ 0.1 ٪ SDS ؛ 0.5 ٪ deoxycholate الصوديوم ؛ 1 / 100 مثبط البروتياز كوكتيل الثالث ، Calbiochem).
  3. Resuspend الخرز في 100 العازلة تحلل ميكرولتر مع الضد 20-10 ميكروغرام.
  4. تدوير أنابيب في درجة حرارة الغرفة ل30-60 دقيقة.
  5. غسل 3X مع 900 ميكرولتر العازلة تحلل وترك في الماضي حتى يغسل استعداد للشروع في الخطوة 4.1.

3. تحلل الخلايا والحمض النووي الريبي الهضم الجزئي

  1. Resuspend الكرية خلية في 1 مل العازلة تحلل ونقل إلى microtubes مل 1.5.
  2. يعد التخفيف 1 / 500 من أنا ريبونوكلياز (Ambion ، AM2295). أضف 10 ميكرولتر التخفيف أنا ريبونوكلياز فضلا عن 2 الدناز توربو ميكرولتر إلى lysate الخلية (1 / 500 ريبونوكلياز التخفيفات الأول [منخفضة ريبونوكلياز] تستخدم لإعداد المكتبة ، 1 / ​​50 التخفيفات [عالية ريبونوكلياز] ضرورية للسيطرة على خصوصية الضد) .
  3. احتضان العينات المطلوبة لل3 دقائق بالضبط عند 37 درجة مئوية ، والهز في 1100 دورة في الدقيقة. نقل على الفور إلى جليد.
  4. تدور عند 4 درجة مئوية و 22000 لمدة 20 دقيقة ز لمسح lysate. جمع بعناية طاف (اترك حوالي 50 lysate ميكرولتر مع بيليه).

4. مناعي

  1. إزالة غسل العازلة من الخرز (من الخطوة 2.5) ، ثم إضافة lysate الخلية (من الخطوة 3.4).
  2. تدوير عينات لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  3. تجاهل طاف وتغسل حبات 2X مع 900 العازلة عالية من الملح ميكرولتر (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 ، 1 M كلوريد الصوديوم ، EDTA 1 ملم و 1 ٪ NP - 40 ؛ 0.1 ٪ SDS ؛ deoxycholate الصوديوم 0.5 ٪).
  4. غسل 2X مع 900 العازلة غسل ميكرولتر (20 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 7.4 و 10 ملي MgCl 2 ؛ 0.2 ٪ توين - 20).

5. نزع الفسفات من الحمض النووي الريبي 3'ends

  1. تجاهل وطاف resuspend الخرز في 20 مزيج PNK ميكرولتر (15 ميكرولتر المياه ؛ 4 ميكرولتر الحموضة PNK 5X 6.5 العازلة [350mMTris ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 6.5 ؛ 50mMMgCl 25mMdithiothreitol 2] ؛ 0.5 انزيم PNK ميكرولتر ؛ 0.5 ميكرولتر RNasin [Promega]).
  2. احتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. إضافة 500 ميكرولتر العازلة يغسل ويغسل 1X عالية مع الملح العازلة.
  4. غسل 2X مع العازلة يغسل.

6. رابط لربط الحمض النووي الريبي ينتهي 3 '

  1. إزالة بعناية وطاف resuspend الخرز في 20 ميكرولتر مزيج ربط (9 ميكرولتر المياه ؛ 4 ميكرولتر العازلة ربط 4X [200 mMTris - حمض الهيدروكلوريك ؛ MM 40m GCL 2 و 40 ملي dithiothreitol] ؛ 1 ميكرولتر RNA يغاز [NEB] ؛ 0.5 ميكرولتر RNasin [Promega] ؛ 1.5 ميكرولتر قبل adenylated رابط L3 [20 ميكرومتر] ؛ 4 ميكرولتر PEG400 [81170 ، سيغما]).
  2. يحضن بين عشية وضحاها في 16 درجة مئوية.
  3. إضافة 500 ميكرولتر العازلة يغسل ويغسل ثم 2X مع 1 العازلة عالية من الملح مل.
  4. غسل 2X مع 1 مل العازلة يغسل ويترك في 1 مل من غسل الثانية.

7. وسم نهاية RNA 5 '

  1. إزالة وطاف resuspend حبات في 8 ميكرولتر من مزيج PNK الساخنة (0.4 ميكرولتر PNK [NEB] ؛ 0.8 ميكرولتر 32 - P - γ ATP ؛ 0.8 ميكرولتر العازلة PNK 10X [NEB] (6) ؛ المياه ميكرولتر).
  2. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  3. إزالة مزيج PNK الساخنة وresuspend حبات العازلة في 20 ميكرولتر 1X تحميل Nupage (Invitrogen).
  4. على احتضان thermomixer عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  5. المكان فورا على مغناطيس لترسيب حبات فارغة وتحميل طاف على هلام (راجع الخطوة 8).

8. SDS - PAGE ونقل الغشاء

  1. تحميل عينات على NuPAGE 4-12 ٪ مكرر تريس هلام (Invitrogen) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام 0.5 لتر من اجتماعات الأطراف 1X تشغيل العازلة (Invitrogen). أيضا تحميل 5 ميكرولتر من علامة حجم البروتين قبل الملون (على سبيل المثال PAGE حاكم زائد ، Fermentas ، SM1811).
  2. تشغيل لمدة 50 دقيقة هلام في 180 V.
  3. إزالة الجبهة جل والتخلص من النفايات الصلبة و(يحتوي على الخطوط المشعة ATP).
  4. نقل البروتينات والحمض النووي الريبي المجمعات من الجل لغشاء النيتروسليلوز باستخدام جهاز نقل Novex الرطب وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (Invitrogen ، ونقل في 30 ح 1 V).
  5. بعد نقل ، وشطف الغشاء العازلة في برنامج تلفزيوني ، ثم لف في التفاف ساران وتعريضها لفوجي فيلم في -80 درجة مئوية (مكان ملصقا الفلورسنت بجوار الغشاء لمحاذاة في وقت لاحق رانه فيلم وغشاء ؛ أداء التعرض لمدة 30 دقيقة ، وأكثر من ليلة 1H).

9. RNA العزلة

  1. عزل بروتين المجمعات الحمض النووي الريبي من التجربة المنخفضة ريبونوكلياز باستخدام صورة الإشعاع الذاتي من الخطوة 8.5 كقناع. قص قطعة من هذا الغشاء إلى شرائح صغيرة عدة ووضعها في microtube مل 1.5.
  2. إضافة 200 PK ميكرولتر العازلة (100 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.4 و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي EDTA) و 10 ميكرولتر بروتيناز K (روش ، 03115828001) إلى قطع الغشاء. احتضان تهتز في 1100 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من PKurea العازلة (100 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.4 و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 10 ملي EDTA ؛ 7 M اليوريا) ، واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. جمع الحل وإضافتها معا مع 400 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الفينول / الكلوروفورم (Ambion ، 9722) إلى المرحلة 2 مل أنبوب جل قفل الثقيلة (713-2536 ، VWR).
  5. احتضان لمدة 5 دقائق عند 30 درجة مئوية ، والهز في 1100 دورة في الدقيقة. فصل المراحل عن طريق الدوران لمدة 5 دقائق في الدقيقة 13000 في درجة حرارة الغرفة.
  6. نقل الطبقة المائية في أنبوب جديد (يجب الحرص على عدم لمس هلام مع ماصة). إضافة 0.5 glycoblue ميكرولتر (Ambion ، 9510) و 40 م 3 ميكرولتر الصوديوم الهيدروجيني 5.5 وخلات المزيج. ثم إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، ومزيج من جديد ويعجل في أكثر من ليلة -20 درجة مئوية.

10. عكس النسخ

  1. تدور لمدة 20 دقيقة في 15000 دورة في الدقيقة و 4 درجات مئوية. إزالة طاف بيليه ويغسل مع 0.5 مل من الايثانول 80 ٪.
  2. Resuspend الكرية 7.25 في الحمض النووي الريبي ميكرولتر / مزيج التمهيدي (6.25 ميكرولتر المياه ؛ 0.5 التمهيدي Rclip ميكرولتر [0.5pmol/μl] ؛ 0.5 ميكرولتر dNTP مزيج [10MM]). لكل تجربة أو تكرار ، واستخدام التمهيدي Rclip مختلفة تحتوي على تسلسل الباركود الفرد (انظر 14).
  3. احتضان لمدة 5 دقائق عند 70 درجة مئوية قبل التبريد إلى 25 درجة مئوية.
  4. إضافة 2.75 ميكرولتر RT مزيج (2 ميكرولتر العازلة RT 5X ؛ 0.5 ميكرولتر 0.1M DTT ؛ 0.25 ميكرولتر مرتفع الثالث عكس المنتسخة [Invitrogen]).
  5. احتضان 5 دقائق عند 25 درجة مئوية و 20 دقيقة في درجة حرارة 42 درجة مئوية ، 40 دقيقة عند 50 درجة مئوية و 5 دقائق عند 80 درجة مئوية قبل التبريد إلى 4 درجات مئوية.
  6. إضافة 90 ميكرولتر TE العازلة ، 0.5 و 10 ميكرولتر glycoblue خلات الصوديوم ميكرولتر الرقم الهيدروجيني 5.5 والمزيج. ثم يضاف 250 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، ومزيج من جديد ويعجل في أكثر من ليلة -20 درجة مئوية.

11. تنقية هلام من [كدنا]

  1. تدور باستمرار وغسل العينات (انظر 10.1) ، ثم resuspend الكريات في 6 ميكرولتر من المياه.
  2. إضافة 6 ميكرولتر 2X العازلة تحميل TBE - اليوريا (Invitrogen). عينات الحرارة إلى 80 درجة مئوية لمدة 3 دقائق مباشرة قبل التحميل.
  3. تحميل العينات في جل الجاهزة TBE - اليوريا 6 ٪ (Invitrogen) وتشغيل لمدة 40 دقيقة عند 180 V كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. تحميل أيضا علامة منخفضة الوزن الجزيئي لقطع اللاحقة (أنظر أدناه).
  4. قطع ثلاثة نطاقات 120-200 في الإقليم الشمالي (عالية) ، 85-120 الإقليم الشمالي (وسط) والإقليم الشمالي 70-85 (منخفضة). استخدام صبغة theupper وعلامات على دعم هلام البلاستيك لتوجيه الختان (انظر الشكل 3). علما بأن التمهيدي Rclip وتسلسل حساب L3 معا لمدة 52 NT تسلسل CLIP.
  5. إضافة 400 TE ميكرولتر وسحق شريحة هلام الى قطع صغيرة باستخدام حقنة 1 مل المكبس. احتضان تهتز في 1100 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  6. مكان اثنين من الزجاج 1 سم قبل المرشحات (Whatman ، 1823010) في عمود SpinX Costar (كورننغ إنكوربوريتد ، 8161). نقل الجزء السائل من العينة إلى العمود. تدور ل1 دقيقة في 13000 دورة في الدقيقة في أنبوب مل 1.5.
  7. إضافة 0.5 glycoblue ميكرولتر و 40 ميكرولتر خلات الصوديوم الهيدروجيني 5.5 ، ثم مزج العينة. إضافة 1 مل من الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، ومزيج من جديد ويعجل في أكثر من ليلة -20 درجة مئوية.

12. ربط من التمهيدي إلى 5'end من [كدنا]

  1. تدور باستمرار وغسل العينات (انظر 10.1) ، ثم resuspend الكريات في 8 مزيج ربط ميكرولتر (6.5 ميكرولتر المياه ؛ 0.8 ميكرولتر 10X CircLigase الاحتياطي الثاني ؛ 0.4 ​​ميكرولتر 50 ملي MnCl 2 ؛ 0.3 ميكرولتر ؛ Circligase الثاني [Epicentre]) ، واحتضان ل 1 ح عند 60 درجة مئوية.
  2. إضافة 30 ميكرولتر مزيج الصلب بنسبة ضئيلة (26 ميكرولتر المياه ؛ 3 الاحتياطي FastDigest ميكرولتر [Fermentas] ؛ 1 ميكرولتر cut_oligo [10 ميكرومتر]). احتضان لمدة 1 دقيقة في 95 درجة مئوية. انخفاض درجة الحرارة ثم كل 20 ثانية في موعد أقصاه 1 درجة مئوية حتى 25 درجة مئوية وصلت.
  3. إضافة 2 BamHI ميكرولتر (Fermentas السريع) ويحضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. إضافة TE 50 ميكرولتر glycoblue و 0.5 ميكرولتر والمزيج. أضف 10 ميكرولتر خلات الصوديوم الهيدروجيني 5.5 والمزيج ، ثم يضاف 250 ميكرولتر الإيثانول بنسبة 100 ٪. مزيج مرة أخرى ، ويعجل في أكثر من ليلة -20 درجة مئوية.

13. PCR التضخيم

  1. تدور باستمرار وغسل العينات (انظر 10.1) ، ثم resuspend بيليه في 19 ميكرولتر المياه.
  2. تحضير مزيج PCR (19 ميكرولتر [كدنا] (1) ؛ مزيج التمهيدي ميكرولتر P5/P3 solexa ، 10 ميكرومتر لكل منهما ؛ Accuprime 20 ميكرولتر Supermix 1 انزيم [Invitrogen]).
  3. تشغيل البرنامج PCR التالية : 94 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ، [94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 68 درجة مئوية لمدة 30 ثانية] دورات 25-35 ، و 68 درجة مئوية لمدة 3 دقائق و 4 درجات مئوية عن أي وقت مضى.
  4. مزيج المنتج 8 PCR ميكرولتر مع 2 ميكرولتر من 5X TBE العازلة التحميل وتحميل على هلام الجاهزة TBE 6 ٪ (Invitروجين). وصمة عار الجل مع أنني Sybrgreen (Invitrogen) وتحليلها مع تصوير هلام.
  5. الباركود في الاشعال Rclip السماح لعينات مختلفة متعددة قبل تقديم لتسلسل إنتاجية عالية. تقدم 15 ميكرولتر للمكتبة لترتيب وتخزين بقية.

14. رابط والتمهيدي متواليات

قبل adenylated 3 'الحمض النووي رابط :

[نحن أجل المحول من الحمض النووي من IDT ثم جعل من aliquots 20μM.]

figure-protocol-1

15. ممثل النتائج :

قبل أن تتابع مكتبة iCLIP ، يمكن رصد نجاح التجربة في خطوتين : صورة الإشعاع الذاتي للمجمع البروتين RNA بعد نقل غشاء (الخطوة 8.5) وصورة هلام المنتجات PCR (الخطوة 13.4). في صورة الإشعاع الذاتي من العينات منخفضة ريبونوكلياز ، ينبغي أن ينظر إلى النشاط الإشعاعي المنتشر فوق الوزن الجزيئي للبروتين (الشكل 2 ، نموذج 4). لالرفيع ريبونوكلياز العينات ، ويتركز هذا النشاط الإشعاعي أقرب إلى الوزن الجزيئي للبروتين (الشكل 2 ، نموذج 3). عندما يتم استخدام أي جسم في مناعي ، ينبغي الكشف عن أية إشارة (الشكل 2 ، وعينات 1 و 2). ضوابط هامة أخرى لخصوصية مناعي إما بحذف اشعة فوق البنفسجية أو استخدام الخلايا التي لا تعبر عن البروتين من الفائدة 14.

ينبغي صورة هلام المنتجات PCR (الخطوة 13.4) تظهر مجموعة الحجم الذي يتوافق مع جزء [كدنا] (عالية أو متوسطة أو منخفضة) المنقى في الخطوة 11.4 (الشكل 4 ، الممرات 4-6). علما بأن الاشعال PCR P3Solexa وP5Solexa إدخال إضافي 76 NT لحجم [كدنا]. إذا لم يتم استخدام الأجسام المضادة خلال مناعي ، ينبغي الكشف عن أية منتجات PCR المقابلة (الشكل 4 ، والممرات 1-3). يمكن التمهيدي المنتج ديمر تظهر في حوالي 140 NT.

من أجل تحقيق النتائج ممثل عالية الإنتاجية التسلسل والتحليلات بيوينفورمتيك اللاحقة انظر 14.

figure-protocol-2
الشكل 1. تمثيل تخطيطي لبروتوكول iCLIP. والبروتينات والحمض النووي الريبي تساهميا المجمعات عبر ربط المجراة باستخدام اشعة فوق البنفسجية (الخطوة 1). يتم تنقية هذا البروتين في المصالح مع الحمض النووي الريبي ملزمة (الخطوات 2-5). للسماح لفتيلة محددة تسلسل النسخ العكسي ، وligated محول RNA إلى 3 'نهاية الحمض النووي الريبي ، في حين أن 5' يسمى بالإشعاع نهاية (الخطوات 6 و 7). وتنقيته عبر ربط البروتين النووي الريبي RNA من المجمعات مجانا باستخدام SDS - PAGE ونقل غشاء (الخطوة 8). واستعاد الجيش الملكي النيبالي من الغشاء بواسطة هضم البروتين مع بروتين K ترك ببتيد المتبقية في الارتباط عبر النوكليوتيدات (الخطوة 9). النسخ العكسي (RT) باقتطاع في ببتيد المتبقية ويقدم منطقتين محول شطورة ومتواليات الباركود (الخطوة 10). اختيار حجم يزيل مجانا RT التمهيدي قبل التعميم. والخطية التالية يولد قوالب مناسبة لتضخيم PCR (الخطوات 11-15). أخيرا ، وارتفاع إنتاجية تولد يقرأ في التسلسل التي تليها مباشرة في تسلسل النوكليوتيدات الباركود من قبل الأخير من [كدنا] (الخطوة 16). منذ هذا الموقف النوكليوتيدات one يقع المنبع من النوكليوتيدات عبر ربط ، يمكن استخلاصه الموقع ملزم مع دقة عالية.

figure-protocol-3
الشكل 2. صورة الإشعاع الذاتي عبر ربط مجمعات C - RNA hnRNP تغيير طبيعة استخدام هلام إستشراد ونقل الغشاء. hnRNP C - RNA والمجمعات المناعة تنقيته من مقتطفات الخلية باستخدام جسم مضاد ضد C hnRNP (α hnRNP C ، وعينات 3 و 4). وكان يهضم جزئيا باستخدام الحمض النووي الريبي منخفضة (+) أو عالية (+ +) تركيز ريبونوكلياز. ويمكن ملاحظة تحول المجمعات صعودا من حجم البروتين (40 كيلو دالتون) (نموذج 4). وهذا التحول هو أقل وضوحا عندما استخدمت تركيزات عالية من ريبونوكلياز (نموذج 3). إشارة المشعة يختفي عندما تم استخدام أي جسم في مناعي (عينات 1 و 2).

figure-protocol-4
الشكل 3. تخطيطي 6 ٪ TBE - اليوريا هلام (Invitrogen) للاسترشاد بها في استئصال المنتجات iCLIP [كدنا]. يتم تشغيل الجل لمدة 40 دقيقة عند 180 V مما أدى إلى وجود نمط الهجرة استنساخه من cDNAs والأصباغ (الضوء والظلام الأزرق) في هلام. استخدام شفرة حلاقة لقطع (خط أحمر) وارتفاع (H) ، متوسطة (M) ومنخفضة (L) الكسور [كدنا]. تبدأ بقطع في منتصف صبغ اللون الأزرق الفاتح وعلى الفور فوق علامة على الكاسيت هلام البلاستيك. تقسيم كسور متوسطة ومنخفضة وتقليم الكسر العالية حوالي 1 سم فوق صبغ اللون الأزرق الفاتح. استخدام تخفيضات العمودي تسترشد الجيوب وصبغ لفصل المسارات المختلفة (في هذا المثال 1-4). يمكن أن تكون ملطخة الممر علامة (م) وتصوير لمراقبةبعد أحجام القطع. يشار إلى أحجام جزء على اليمين.

figure-protocol-5
الشكل 4. تحليل PCR - مكتبات iCLIP [كدنا] تضخيم استخدام هلام إستشراد. استعاد الجيش الملكي النيبالي من غشاء (الشكل 1) وكتب وعكس حجم المنقى التي تستخدم تغيير طبيعة الكهربائي للهلام (الشكل 2). كسور حجم ثلاثة من [كدنا] (عالية [H] : 120-200 الإقليم الشمالي والمتوسطة [M] : 85-120 NT ومنخفضة [L] : 70-85 NT) تم استردادها ، circularized ، وإعادة خطي وتضخيم PCR. ويمكن ملاحظة توزيع المنتجات PCR مختلفة الحجم نتيجة لأحجام مختلفة من كسور الإدخال. منذ التمهيدي PCR يقدم 76 NT إلى [كدنا] ، وينبغي أن أحجام تتراوح ما بين 196-276 NT عالية ، 161-196 الإقليم الشمالي للمتوسط ​​و146-161 الإقليم الشمالي للكسور حجم صغير. منتجات PCR غائبة عندما تم استخدام أي جسم لمناعي (الممرات 1-3).

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ بروتوكول iCLIP يحتوي على مجموعة متنوعة من التفاعلات الإنزيمية والخطوات لتنقية ، فإنه ليس من السهل دائما تحديد المشكلة عند تجربة فشل. من أجل السيطرة على لخصوصية تحديد المواقع عبر الارتباط RNA ، ينبغي الحفاظ على واحد أو أكثر من عناصر التحكم في كافة مراحل التجربة السلبية الكاملة والتحليلات الحسابية لاحقا. يمكن أن تكون هذه الضوابط العينة عدم الأضداد ، والخلايا غير عبر ربط ، أو مناعي من الخلايا أو الأنسجة خروج المغلوب. من الناحية المثالية ، ينبغي أن تحكم هذه التجارب لا تنقي أي مجمعات البروتين RNA ، وبالتالي ينبغي أن تعطي أي إشارة على جل SDS - PAGE ، وليس بعد اكتشاف منتجات التضخيم PCR. ينبغي عالية الإنتاجية تسلسل هذه المكتبات التحكم عودة تسلسل فريد قليلة جدا. لا ينصح الخلايا ضربة قاضية كعنصر تحكم التسلسل ، لأن تسلسل الناتجة تقابل ما زال عبر ربط مواقع من البروتين نفسه الذي تتم تنقيته من الخلايا ضربة قاضية بكميات أصغر.

وينبغي أيضا الاحتياطات الواجب اتخاذها لتجنب تلوث المنتجات مع PCR من التجارب السابقة. أفضل وسيلة للحد من هذه المشكلة هو لفصل مكانيا الخطوات السابقة واللاحقة PCR. من الناحية المثالية ، ينبغي إجراء تحليل PCR المنتجات وجميع الخطوات اللاحقة في غرفة منفصلة. وعلاوة على ذلك ، يجب على كل عضو في المختبر استخدام الخاصة بها مجموعة من المخازن والكواشف الأخرى. في هذه الطريقة ، يمكن تحديد مصادر التلوث أسهل.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب أشكر جميع أعضاء المختبرات الندبة ، وLuscombe Zupan للمناقشة والمساعدة التجريبية. نشكر جيمس هادفيلد ونيك ماثيوز عن التسلسل الإنتاجية العالية. نود أن نشير إلى أن الأسلوب الموصوفة هنا iCLIP أسهم عدة خطوات مع بروتوكول CLIP الأصلي الذي وضعه جنسن كيرك وJU في مختبر روبرت دارنيل. وأيد هذا العمل عن طريق منح المجلس الأوروبي للبحوث 206726 - CLIP لJU والطويلة الأجل للعلوم الإنسان حدود الزمالة لبرنامج JK

المواد

للنقل الكهربائي للهلام وغشاء نوصي انه ر استخدام SureLock XCell ® مصغرة الخلية والثاني XCell ™ CE كيت وحدة لطخة مارك (Invitrogen ، EI0002) ، وهو متوافق مع استخدام minigels الجاهزة المختلفة التي تم تحديدها في جميع أنحاء بروتوكول . يذكر أن عدد العلامات التجارية والنظام لجميع المواد التي استخدمت خلال البروتوكول. يتم عرض قائمة من الإنزيمات المستخدمة في البروتوكول في الجدول أدناه.

اسم كاشف شركة كتالوج # تعليقات
البروتين Dynabeads Invitrogen 10001D استخدام الأجسام المضادة لبروتين G الماوس أو الماعز
أنا ريبونوكلياز Ambion AM2295 يمكن أن تتغير من النشاط على دفعات
T4 RNA يغاز أنا NEB M0204S
PNK NEB M0201S
بروتين K روش 03115828001
ثالثا مرتفع عكس المنتسخة Invitrogen 18080044
Circligase الثاني Epicentre CL9021K
FastDigest ® BamHI Fermentas FD0054
AccuPrime ™ SuperMix أنا Invitrogen 12342010 هذا المزيج PCR يعطي أفضل النتائج في أيدينا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).
  2. Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. RNA. 14, 802-813 (2008).
  3. Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5, 1071-1082 (1999).
  4. Brooks, S. A., Rigby, W. F. Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique. Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).
  5. Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).
  6. Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
  7. Ule, J. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302, 1212-1215 (2003).
  8. Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37, 376-386 (2005).
  9. Licatalosi, D. D. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456, 464-469 (2008).
  10. Yeo, G. W. An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells. Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).
  11. Urlaub, H., Hartmuth, K., Lührmann, R. A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles. Methods. 26, 170-181 (2002).
  12. König, J. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تصحيح

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution
Posted by JoVE Editors on 7/14/2011. Citeable Link.

A correction was made to iCLIP - Transcriptome-wide Mapping of Protein-RNA Interactions with Individual Nucleotide Resolution. There was an error in part 2 of step 3. One of the characters had the incorrect symbol and was corrected to:

"...as well as 2 μl Turbo DNase..."

instead of:

"...as well as 2 ml Turbo DNase..."

الوسوم

مقالات ذات صلة