ويمكن استخدام الخلايا بوساطة lymphocytotoxicity (CML) المقايسات لاختبار ردود الفعل وآليات autoreactive دراسة موت الخلايا في المختبر. ومع ذلك ، يمكن استخدام الخلايا الحية المجهرية مبائر تقنيات التصوير مع الأصباغ الفلورية ، اكتب وحركية من موت الخلايا وكذلك الممرات المستخدمة في دراستها بمزيد من التفصيل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طرق لتقييم موت الخلايا بيتا وساطة من قبل الخلايا اللمفاوية التائية السامة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
داء السكري نوع 1 (T1D) هي الخلية بوساطة أمراض المناعة الذاتية تي. خلال المرضية ، والمرضى تصبح تدريجيا أكثر ناقص الأنسولين كما هو فقدان إنتاج الأنسولين ، ويفترض أن هذه النتائج من تدمير خلايا بيتا في البنكرياس من قبل خلايا تي. وفهم آليات موت الخلايا بيتا خلال تطوير T1D تقديم رؤى لإنشاء علاج فعال لهذا المرض. وقد استخدمت الخلية بوساطة lymphocytotoxicity (CML) المقايسات تاريخيا النويدات المشعة الكروم 51 (51 ريال برازيلي) إلى تسمية الخلايا المستهدفة. ثم تتعرض هذه الأهداف إلى الخلايا المستجيب وقراءة الافراج عن 51 ساعة معتمدة من الخلايا المستهدفة كدليل على موت الخلايا اللمفاوية التي تتوسط فيها. مثبطات نتيجة موت الخلايا في الافراج انخفضت من 51 ساعة معتمدة.
كما الخلايا المستجيب ، استخدمنا تنشيط السكان نسيلي autoreactive من CD8 + T السامة للخلايا الليمفاوية (CTL) معزولة عن ماوس وراثيا الأسهم للألفا على حد سواء وسلاسل بيتا من مستقبلات الخلايا التائية AI4 (TCR). وتم تنشيط خلايا تي AI4 التعاون مع مثقف 51 ساعة معتمدة المسمى الخلايا المستهدفة NIT لمدة 16 ساعة ، والإفراج عن 51 ساعة معتمدة تم تسجيلها لحساب تحلل محددة
الميتوكوندريا المشاركة في العديد من الأحداث الفيزيولوجية الهامة ، مثل إنتاج الطاقة ، وتنظيم الإشارات تنبيغ ، وموت الخلايا المبرمج. دراسة التغييرات الوظيفية الميتوكوندريا خلية بيتا خلال تطوير T1D هي منطقة جديدة من الأبحاث. باستخدام غشاء الميتوكوندريا المحتملة صبغة رباعي ميثيل استر الميثيل رودامين (TMRM) ، والتصوير المجهري مبائر الخلية الحية ، رصدنا غشاء الميتوكوندريا المحتملة على مر الزمن في خط خلايا بيتا NIT - 1. للدراسات والتصوير ، وكانت تسمى الخلايا التائية المستجيب AI4 مع صبغة الفلورسنت النووية تلطيخ Picogreen. NIT - 1 الخلايا والخلايا التائية وشارك في تربيتها في غرف ساترة والتي شنت على المسرح المجهر مجهزة غرفة الخلية الحية ، التي تسيطر على 37 درجة مئوية ، مع 5 ٪ CO 2 ، ومرطب. خلال هذه التجارب تم التقاط صور من كل مجموعة كل 3 دقائق لمدة 400 دقيقة.
أكثر من 400 دورة دقائق ، لاحظنا تبديد إمكانات غشاء الميتوكوندريا في NIT - 1 كتل الخلية حيث كانت تعلق AI4 خلايا تي. في التجربة التحكم في وقت واحد حيث تم NIT - 1 الخلايا المستزرعة التعاون مع MHC سوء المتطابقة ظلت الميتوكوندريا المحتملة غشاء خلايا لمفاوية Jurkat ، سليمة. ويمكن استخدام هذه التقنية لمراقبة التغييرات في الوقت الحقيقي في غشاء الميتوكوندريا المحتملة في الخلايا الليمفاوية تحت هجوم السامة للخلايا ، السيتوكينات ، أو الكواشف السامة للخلايا أخرى.
البروتوكول
1. إعداد الخلايا
- هدف الخلية الثقافة : الثقافة وكان من خطوط الماوس خلايا بيتا ، وNIT 1 - 4 - NIT ، وهو 1،2 الموصوفة سابقا في DMEM تستكمل مع FBS 10 ٪ ، 0.02 ٪ BSA ، غير الأحماض الأمينية الأساسية ، 15mM HEPES ، 16.5mM Glocose والبنسلين / الستبرتوميسين. لمدة 51 ساعة معتمدة العلامات ، وخلايا البذور في شقة القاع 96 - جيدا لوحة الثقافة في الخلايا 5X10 4 / 200 جيدا في مستنبت ميكرولتر. المجهري للتجارب ، وخلايا البذور في 8 كذلك مختبر تاك ساترة الثاني في غرف 5x10 4 في غرفة في 500 مستنبت ميكرولتر ، والسماح ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
السامة للخلايا T في خلايا بيتا بوساطة الموت هو الفيزيولوجيا المرضية الرئيسية للT1D 5. المقايسات CML باستخدام الكروم اطلاق سراح 51 تسمح لنا دراسة درجة المستجيب المستهدفة استجابة 6. ومع ذلك ، لا تزال عملية مفصلة والممرات من الخلايا T التي تتوسط بيتا موت الخلايا غير مفهومة تماما. منذ الميتوكوندريا حاسمة من أجل وظيفة خلايا بيتا وفاة 7 ، ركزنا على التغيرات الميتوكوندريا خلال CML البصرية. غشاء الميتوكوندريا تبديد محتمل هو خطوة لا رجعة فيها في .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها جامعة فلوريدا رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة وDK074656 AI56374 (CEM) ، وكذلك مؤسسة أبحاث السكري الأحداث.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات (اختياري) |
| CR - 51 | بيركن إلمر | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| ميثيل استر الميثيل رودامين (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | تسلسل الأحماض الأمينية : YFIENYLEL | |
| IL - 2 | R & D | 485 - MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | HyClone | SH30071.03 | |
| الأبقار مصل الزلال | سيغما | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060 - CL | |
| MEM غير الأحماض الأمينية الأساسية | GIBCO | 11140 | |
| البنسلين / الستربتوميسين | الجوزاء | 400-109 | |
| الفينول الحمراء الخالية DMEM | سيغما | D5303 | |
| CO2 حاضنة | الحرارية فيشر | HeraCell 150i | أبقى العقيمة للثقافة الخلية |
| السلامة البيولوجية لمجلس الوزراء | الحرارية فيشر | تقديرية 1440 | |
| ثقافة أنابيب القابل للتصرف ، 6x50 زجاج الجير ملم | الصياد | 14-958 - A | |
| مكافحة غاما | بيركن إلمر | المعالج 1470 عداد غاما التلقائية | |
| مبائر المجهر | زايس | LSM 510 ميتا متحد البؤر | مع مرحلة بمحركات والعيش غرفة الخلية |
| ماصة (1ml ، 200μl ، 20μl ، 10μl ، 2μl) | إيبندورف | ||
| أنابيب (العنبر) | الصياد | 50819772 | |
| الطرد المركزي | Sorvall الأيقونات RT + | 75004377 | |
| عدادة الكريات | فيشر العلمية | 267110 | |
| تستقيم مجهر | زايس | Axioskop40 | |
| NOD.Cg - Rag1 tm1Mom تيراغرام (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ الفئران | مختبر جاكسون | 004347 | |
| NOD.Cg - Rag1 tm1Mom تيراغرام (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ الفئران | مختبر جاكسون | 004348 | |
| NOD - AI4α / الفئران F1 β | N / A | N / A | الحيوانات المرباة في منشأة UF |
المراجع
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
