في هذا الفيديو نظهر إعداد E18 العصبونات القشرية الجرذ.
مقالة منهجية
إعداد E18 العصبونات القشرية للتجزئة الجرذ في جهاز ميكروفلويديك
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في هذا الفيديو ، ونبدي استعدادا للE18 الخلايا العصبية الفئران القشرية. ويتم الحصول على الخلايا العصبية الفئران E18 E18 القشرية من القشرة تشريح الفئران الجنينية وأعدت مسبقا. القشرة E18 هو ، على تشريح ، فصلها فورا في الخلايا العصبية الفردية. فمن الممكن لتخزين E18 في القشرة العازلة E إسبات B27 تحتوي على 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع قبل تنفيذ الانفصال. ومع ذلك ، سيكون هناك انخفاض في بقاء الخلية. عادة نحن لدينا الحصول على E18 جديدة اللحاء. ينقل إلى المختبر في البرد الثلج الكالسيوم المغنيسيوم العازلة تشريح حرة حرة (CMFM). لدى وصوله ، يضاف إلى التربسين القشرة إلى التركيز النهائي 0.125 ٪. ومن ثم حضنت القشرة عند 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق. يضاف DMEM FBS تحتوي على 10 ٪ في القشرة لوقف التفاعل. ثم يتم طرد القشرة عند 2500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. تتم إزالة طاف و 2 مل من وسائل الإعلام بصل العصبية (NBM) التي تحتوي على 2 ٪ B27 (المجلد / المجلد) و 0.25 ٪ يضاف Glutamax (المجلد / المجلد) إلى القشرة التي هي ثم إعادة علقتها pipetting صعودا وهبوطا. المقبل ، هو مسحوق القشرة مع ماصات النار سابقا الزجاج المصقول ، مع كل افتتاح المتعاقبة أصغر. بعد الطحن ، يتم طرد مرة أخرى القشرة في 2500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. تتم إزالة ثم طاف بيليه والقشرة إعادة العالقة مع 2 مل من NBM تحتوي B27 وGlutamax. ثم يتم تمرير تعليق الخلية من خلال 40 مصفاة أم النايلون الخلية. المقبل يتم الاعتماد على الخلايا. الخلايا العصبية هي الآن جاهزة للتحميل في الجهاز ميكروفلويديك الخلايا العصبية.
البروتوكول
إعداد E18 الخلايا العصبية الجنينية الجرذ القشرية للتجزئة
قبل البدء ، من المهم أن جميع وسائل الإعلام الدافئة والكواشف اللازمة إلى 37 درجة مئوية.
من المهم أيضا لتعقيم كل شيء يستخدم لتحضير الخلايا (على سبيل المثال ، والمصابيح والمطاط ، ورفوف أنبوب ، زجاجات وسائل الاعلام ، الخ) ، وأنه هو الذي وضعها في غطاء المحرك ، بواسطة المسح أسفل مع الايثانول 70 ٪.
- مكان قطعتين من اللحاء E18 الفأر الجنينية (واحد من الدماغ ، وتشريح سابقا) في أنبوب 15 مل تحتوي على 1 مل من الجليد الباردة الخالية من الكالسيوم المغنيسيوم العازلة خالية تشريح.
- إضافة 1 مل من 0.25 ٪ التربسين - EDTA إلى القشرة العازلة في التشريح ، ليصل إلى 2 الحجم النهائي والنهائي مل تركيز التربسين إلى 0.125 ٪.
- وضع أنبوب 15 مل في 37 ° C حمام الماء لمدة 8 دقائق.
- خلال هذا الوقت ، والحرائق تلميع الزجاج 3 pipets باستور ، وتشكيل فتحات صغيرة على التوالي ، في خزانة السلامة الأحيائية للمساعدة في الحفاظ العقم.
- بعد 8 دقائق من الحضانة القشرة ، إضافة 10 مل من DMEM FBS تحتوي على 10 ٪ من القشرة للمساعدة على وقف تفاعل التربسين.
- أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 15 مل تحتوي على القشرة وDMEM/10 FBS ٪ في 2500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
- في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية ، وإزالة القشرة من طاف باستخدام الماصة باستور الزجاج مع شفط فراغ المرفقة. يجب الحرص على عدم إزعاج أو طرد بيليه.
- إضافة 1 مل من NMB لبيليه والماصة القشرة بلطف صعودا وهبوطا. من المهم جدا لتجنب خلق فقاعات الهواء بينما pipeting صعودا وهبوطا ، وفقاعات الهواء يمكن أن تتلف الخلايا عن طريق الأكسدة.
- استخدام النار مصقول الماصة باستور مع الانفتاح على أوسع نطاق متمزج القشرة عن طريق إرفاق لمبة المطاط عقيمة حتى النهاية وpipeting صعودا وهبوطا 5 مرات ، ومرة أخرى والحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء. تستمر هذه العملية مع غيره من أنواع الزجاج pipets 2 ، مع كل انخفاض حجم فتح.
- بعد سحن ، الطرد المركزي باستمرار خلايا مرة أخرى في 2500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
- بعد الطرد المركزي ، ومرة أخرى وإزالة طاف resuspend الكرية خلية في 2 مل من مصرف مولدوفا الوطني.
- تصفية خلية حل معلق من خلال مصفاة أم 45 خلية.
- وصمة عار الخلايا مع التريبان الأزرق ، عدها ، وتحميلها إلى الأجهزة. نحن عادة تحميل 20 ماي من الخلايا في الجهاز.
ملاحظة : تركيز النهائي من الخلايا عادة ما بين 2.5 مليون خلية / مل والخلايا 8000000 / مل
تحميل الخلايا
بعد أن تم فرز الخلايا ، فقد حان الوقت لتحميل الخلايا في الجهاز :
- جلب أجهزة معدة مسبقا تتضمن NBM الى مجلس الوزراء للحفاظ على سلامة الأحيائية العقم.
- إزالة الزائدة وسائل الاعلام من الآبار عن طريق الشفط فراغ. ومع ذلك ، كن حذرا لتجنب إزالة كافة وسائل الإعلام -- يجب أن يكون هناك بعض وسائل الاعلام في القناة الرئيسية.
- 20 تطبيق المجاهدين من الخلايا إلى خزان اليد اليسرى العلوي من الجهاز (انظر الرسم التخطيطي إذا لزم الأمر). تدفق الخلايا في الجهاز ، ونعلق على سطح PLL علاجها.
- بعد التحميل ، ووضع الأجهزة التي تحتوي على خلايا مرة أخرى في حاضنة لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا لنعلق.
- بعد 10 دقيقة ، وملء الخزانات مع وسائل الإعلام والأجهزة المكان مرة أخرى في الحاضنة.
المناقشة
يمكن أن تختلف تبعا لكثافة خلية التطبيق. ومع ذلك ، زرع الخلايا العصبية الأولية في منخفض جدا من كثافة يؤدي عادة إلى موت الخلية. اعتمادا على الحاضنة ومستوى الرطوبة ، وسائل الإعلام قد تحتاج إلى تغيير في الأجهزة كل يوم 2 إلى 3. عند تغيير وسائل الإعلام ، فمن المهم بعد إزالة وسائل الإعلام من الخزانات ، وأبدا لإزالة وسائل الاعلام من القنوات الرئيسية. علاوة على ذلك ، هو ممارسة جيدة لوضع وسائل الإعلام الجديدة في الآبار أعلى والسماح لبعض وسائل الإعلام الجديدة في التدفق من خلال الجهاز والى القنوات الرئيسية قبل ملء جميع الخزانات.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| NBM | وسط استنبات | Invitrogen | 21103-049 | يتم الحصول على الوسط القاعدي العصبي (Neural Basal Media) من شركة Invitrogen ضمن خط إنتاج Gibco لكواشف زراعة الخلايا. |
| أجنة جرذان في اليوم 18 من الحمل (E18) | حيوان | تُستخلص من إناث جرذان Sprague Dawley الحوامل؛ حيث يتم تضحية الجرذ الحامل وتشريح أجنينه في اليوم الجنيني الثامن عشر (E18) للحصول على قشرة الدماغ الجنينية للجرذ في اليوم E18. | ||
| محلول التشريح HBSS لـ CMFM | محلول منظم | محلول تشريح قاعدته HBSS، مبرد بالثلج، وخالٍ من الكالسيوم والمغنيسيوم. | ||
| أنبوبة سعة 15 مل | أداة | BD Biosciences | فالكون رقم 352097 | متوفر عبر كتالوج Fisher Scientific رقم 14-959-70C |
| تريبسين-إيديتات (Trypsin-EDTA) بنسبة 0.25% | كاشف | Invitrogen | ||
| 37˚حمام مائي مبرد | ||||
| ماصات باستير | Fisher Scientific | زجاج | ||
| وسط ديلكوينسج - إيغل المعدل (DMEM) | وسط | Invitrogen | ||
| مصل جنين البقر | كاشف | Invitrogen | مصل، يُستخدم بتركيز 10% في وسط DMEM | |
| جهاز طرد مركزي | ضبط على 2500 دورة في الدقيقة | |||
| صبغة تريبان الزرقاء (Trypan Blue) | Invitrogen | لعدّ الخلايا الحية والميتة | ||
| مصفاة خلايا BD Falcon بمسامية 40 ميكرومتر | أداة | BD Biosciences | Falcon رقم الكتالوج 352340 | متوفر عبر Fisher Scientific. رقم الكتالوج في Fisher هو 08-771-1 |
| B27 | كاشف | Invitrogen | 17504-044 | تعتبر B27 مكملاً مملوكاً متاحاً من خلال شركة Invitrogen ضمن خط منتجات Gibco لكواشف زراعة الخلايا. |
| جلوتامكس (Glutamax) | كاشف | Invitrogen | 35050-061 | يتوفر Glutamax من خلال شركة Invitrogen ضمن خط منتجات Gibco لكواشف الزراعة الخلوية. |
المراجع
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
