Method Article

إعداد E18 العصبونات القشرية للتجزئة الجرذ في جهاز ميكروفلويديك

DOI:

10.3791/305

⸱

October 1st, 2007

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of California, Irvine (UCI), 2Stem Cell Research Center, University of California, Irvine (UCI), 3Institute for Brain Aging and Dementia, University of California, Irvine (UCI)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا الفيديو نظهر إعداد E18 العصبونات القشرية الجرذ.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا الفيديو ، ونبدي استعدادا للE18 الخلايا العصبية الفئران القشرية. ويتم الحصول على الخلايا العصبية الفئران E18 E18 القشرية من القشرة تشريح الفئران الجنينية وأعدت مسبقا. القشرة E18 هو ، على تشريح ، فصلها فورا في الخلايا العصبية الفردية. فمن الممكن لتخزين E18 في القشرة العازلة E إسبات B27 تحتوي على 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع قبل تنفيذ الانفصال. ومع ذلك ، سيكون هناك انخفاض في بقاء الخلية. عادة نحن لدينا الحصول على E18 جديدة اللحاء. ينقل إلى المختبر في البرد الثلج الكالسيوم المغنيسيوم العازلة تشريح حرة حرة (CMFM). لدى وصوله ، يضاف إلى التربسين القشرة إلى التركيز النهائي 0.125 ٪. ومن ثم حضنت القشرة عند 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق. يضاف DMEM FBS تحتوي على 10 ٪ في القشرة لوقف التفاعل. ثم يتم طرد القشرة عند 2500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. تتم إزالة طاف و 2 مل من وسائل الإعلام بصل العصبية (NBM) التي تحتوي على 2 ٪ B27 (المجلد / المجلد) و 0.25 ٪ يضاف Glutamax (المجلد / المجلد) إلى القشرة التي هي ثم إعادة علقتها pipetting صعودا وهبوطا. المقبل ، هو مسحوق القشرة مع ماصات النار سابقا الزجاج المصقول ، مع كل افتتاح المتعاقبة أصغر. بعد الطحن ، يتم طرد مرة أخرى القشرة في 2500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة. تتم إزالة ثم طاف بيليه والقشرة إعادة العالقة مع 2 مل من NBM تحتوي B27 وGlutamax. ثم يتم تمرير تعليق الخلية من خلال 40 مصفاة أم النايلون الخلية. المقبل يتم الاعتماد على الخلايا. الخلايا العصبية هي الآن جاهزة للتحميل في الجهاز ميكروفلويديك الخلايا العصبية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعداد E18 الخلايا العصبية الجنينية الجرذ القشرية للتجزئة

قبل البدء ، من المهم أن جميع وسائل الإعلام الدافئة والكواشف اللازمة إلى 37 درجة مئوية.

من المهم أيضا لتعقيم كل شيء يستخدم لتحضير الخلايا (على سبيل المثال ، والمصابيح والمطاط ، ورفوف أنبوب ، زجاجات وسائل الاعلام ، الخ) ، وأنه هو الذي وضعها في غطاء المحرك ، بواسطة المسح أسفل مع الايثانول 70 ٪.

  1. مكان قطعتين من اللحاء E18 الفأر الجنينية (واحد من الدماغ ، وتشريح سابقا) في أنبوب 15 مل تحتوي على 1 مل من الجليد الباردة الخالية من الكالسيوم المغنيسيوم العازلة خالية تشريح.
  2. إضافة 1 مل من 0.25 ٪ التربسين - EDTA إلى القشرة العازلة في التشريح ، ليصل إلى 2 الحجم النهائي والنهائي مل تركيز التربسين إلى 0.125 ٪.
  3. وضع أنبوب 15 مل في 37 ° C حمام الماء لمدة 8 دقائق.
  4. خلال هذا الوقت ، والحرائق تلميع الزجاج 3 pipets باستور ، وتشكيل فتحات صغيرة على التوالي ، في خزانة السلامة الأحيائية للمساعدة في الحفاظ العقم.
  5. بعد 8 دقائق من الحضانة القشرة ، إضافة 10 مل من DMEM FBS تحتوي على 10 ٪ من القشرة للمساعدة على وقف تفاعل التربسين.
  6. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب 15 مل تحتوي على القشرة وDMEM/10 FBS ٪ في 2500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
  7. في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية ، وإزالة القشرة من طاف باستخدام الماصة باستور الزجاج مع شفط فراغ المرفقة. يجب الحرص على عدم إزعاج أو طرد بيليه.
  8. إضافة 1 مل من NMB لبيليه والماصة القشرة بلطف صعودا وهبوطا. من المهم جدا لتجنب خلق فقاعات الهواء بينما pipeting صعودا وهبوطا ، وفقاعات الهواء يمكن أن تتلف الخلايا عن طريق الأكسدة.
  9. استخدام النار مصقول الماصة باستور مع الانفتاح على أوسع نطاق متمزج القشرة عن طريق إرفاق لمبة المطاط عقيمة حتى النهاية وpipeting صعودا وهبوطا 5 مرات ، ومرة ​​أخرى والحرص على عدم إدخال فقاعات الهواء. تستمر هذه العملية مع غيره من أنواع الزجاج pipets 2 ، مع كل انخفاض حجم فتح.
  10. بعد سحن ، الطرد المركزي باستمرار خلايا مرة أخرى في 2500 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
  11. بعد الطرد المركزي ، ومرة ​​أخرى وإزالة طاف resuspend الكرية خلية في 2 مل من مصرف مولدوفا الوطني.
  12. تصفية خلية حل معلق من خلال مصفاة أم 45 خلية.
  13. وصمة عار الخلايا مع التريبان الأزرق ، عدها ، وتحميلها إلى الأجهزة. نحن عادة تحميل 20 ماي من الخلايا في الجهاز.

ملاحظة : تركيز النهائي من الخلايا عادة ما بين 2.5 مليون خلية / مل والخلايا 8000000 / مل

تحميل الخلايا

بعد أن تم فرز الخلايا ، فقد حان الوقت لتحميل الخلايا في الجهاز :

  1. جلب أجهزة معدة مسبقا تتضمن NBM الى مجلس الوزراء للحفاظ على سلامة الأحيائية العقم.
  2. إزالة الزائدة وسائل الاعلام من الآبار عن طريق الشفط فراغ. ومع ذلك ، كن حذرا لتجنب إزالة كافة وسائل الإعلام -- يجب أن يكون هناك بعض وسائل الاعلام في القناة الرئيسية.
  3. 20 تطبيق المجاهدين من الخلايا إلى خزان اليد اليسرى العلوي من الجهاز (انظر الرسم التخطيطي إذا لزم الأمر). تدفق الخلايا في الجهاز ، ونعلق على سطح PLL علاجها.
  4. بعد التحميل ، ووضع الأجهزة التي تحتوي على خلايا مرة أخرى في حاضنة لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا لنعلق.
  5. بعد 10 دقيقة ، وملء الخزانات مع وسائل الإعلام والأجهزة المكان مرة أخرى في الحاضنة.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تختلف تبعا لكثافة خلية التطبيق. ومع ذلك ، زرع الخلايا العصبية الأولية في منخفض جدا من كثافة يؤدي عادة إلى موت الخلية. اعتمادا على الحاضنة ومستوى الرطوبة ، وسائل الإعلام قد تحتاج إلى تغيير في الأجهزة كل يوم 2 إلى 3. عند تغيير وسائل الإعلام ، فمن المهم بعد إزالة وسائل الإعلام من الخزانات ، وأبدا لإزالة وسائل الاعلام من القنوات الرئيسية. علاوة على ذلك ، هو ممارسة جيدة لوضع وسائل الإعلام الجديدة في الآبار أعلى والسماح لبعض وسائل الإعلام الجديدة في التدفق من خلال الجهاز والى القنوات الرئيسية قبل ملء جميع الخزانات.

Materials

يتم الحصول على المؤقت مائي الطرد المركزي DMEM كاشف

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الوسائط القاعدية العصبيةالمتوسطةNBM21103-049بواسطة Invitrogen تحت خط Gibco من كواشف زراعة الخلايا.
أجنة الفئران E18تم الحصول عليه من فئران Sprague Dawley الحامل. يتم التضحية بالجرذ الحامل وتشريح صغار الفئران الجنينية E18 للحصول على قشرة الفئران الجنينية E18.
CMFM المخزن المؤقت للتشريح HBSSالمخزنالمثلج الخالي من الكالسيوم خال من المغنيسيوم المخزن المؤقت للتشريح HBSS.
15 مل أداة الأنبوبBD BiosciencesFalcon رقم 352097متوفر من خلال رقم كتالوج فيشر العلمي 14-959-70C
0.25٪ كاشف التربسين-EDTAInvitrogen
37 & # 730 ؛ C حمام
باستور ماصاتفيشر ساينتيكزجاج
DMEMمتوسطInvitrogen
FBSكاشفInvitrogen مصل Invitrogen، يستخدم بنسبة 10٪ في
جهازعند 2500 دورة في الدقيقة
Trypan BlueInvitrogenلعد الخلايا الحية / الميتة
مصفاة خلايا الصقر BD 40 umأداةBD BiosciencesFalcon cat # 352340متوفرة من خلال Fisher Scientific. كتالوج فيشر # 08-771-1
كاشف B27Invitrogen17504-044B27 هو مكمل خاص متاح من خلال Invitrogen تحت خط Gibco من كواشف زراعة الخلايا.
GlutamaxInvitrogen35050-061Glutamax متاح من خلال Invitrogen تحت خط Gibco من كواشف ثقافة celll.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1, 2128-2136 (2006).
  2. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2, 599-605 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cortical Rat NeuronsMicrofluidic DeviceNeuron CompartmentalizationTissue DissociationTrypsin TreatmentCell TriturationNeural Basal MediaCell StrainerHemocytometer CountingAxonal Fraction

Related Articles