نحن تصف عملية عزل الحمض النووي عالية النقاء هربس nucleocapsid من الخلايا المصابة. القبض على الحمض النووي النهائي من الحل هو تركيز عالية ونقاء ، مما يجعله مثاليا للالتسلسل عالية الإنتاجية ، وارتفاع الإخلاص تفاعلات PCR ، وtransfections لإنتاج recombinants الفيروسية الجديدة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الفيروسات هي طفيليات تلزم الخلوية ، وبالتالي فإن دراسة عينات من الحمض النووي الفيروسي يتطلب عزل المواد بعيدا عن الملوثات الخلية المضيفة والحمض النووي. تطبيقات المصب عدة تتطلب كميات كبيرة من الحمض النووي الفيروسي النقي ، والتي يتم توفيرها من قبل هذا البروتوكول. وتشمل هذه التطبيقات تسلسل الجينوم الفيروسي ، حيث إزالة الحمض النووي المضيف أمر حاسم لتحسين بيانات الناتج عن تسلسل الفيروسي ، وإنتاج سلالات جديدة المؤتلف الفيروسية ، حيث شارك في 1،2 ترنسفكأيشن تنقيته من الحمض النووي الفيروسي البلازميد ويسهل إعادة التركيب الخطي. ، 3
هذا الإجراء يستخدم مزيجا من عمليات الاستخراج وكثافة المستندة الطرد المركزي لعزل الحمض النووي المنقى خطية هربس nucleocapsid من الخلايا المصابة. 4،5 الخطوات الأولية تهدف إلى تنقية عزل الفيروسية capsids المنقى ، والتي تحتوي على الحمض النووي الفيروسي حماية خلال عمليات الاستخراج والخطوات الطرد المركزي التي تعمل على إزالة البروتينات والحمض النووي الخلوي. تحلل من النشرات nucleocapsids ثم الحمض النووي الفيروسي ، واثنين النهائي الفينول كلوروفورم خطوات إزالة البروتينات المتبقية. القبض على الحمض النووي النهائي من الحل يتركز عالية ونقية ، مع 260/280 OD 1.90 متوسط. اعتمادا على كمية من الخلايا المصابة المستخدمة ، غلة مجموعة الحمض النووي الفيروسي 150-800 ميكروغرام أو أكثر. نقاء من هذا الحمض النووي يجعلها مستقرة خلال التخزين الطويل الأجل في 4C. وبالتالي هذا الحمض النووي مناسبة بشكل مثالي لسرعة عالية التسلسل عالية الدقة تفاعلات PCR ، وtransfections.
قبل بداية البروتوكول ، فمن المهم أن نعرف أن متوسط عدد الخلايا في الطبق (على سبيل المثال ما معدله 8 × 10 خلايا PK - 15 6 متكدسة في صحن 15 سم) لاستخدامها ، وعيار من المخزون الفيروسي ( مثال 1 × 10 8 البلاك تشكيل وحدات لكل مل). هذه ضرورية لحساب تعدد المناسب للعدوى (وزارة الداخلية) للبروتوكول. 6 وعلى سبيل المثال ، لتصيب طبق واحد من 15 سم PK - 15 مع الخلايا الفيروسية الأسهم في أعلاه ، في وزارة الداخلية من 5 ، يمكنك استخدام ميكرولتر من 400 الأسهم الفيروسية وتمييع مع 3.6 مل من المتوسط (إجمالي حجم تلقيح لمدة 4 مل صفيحة 15 سم).
يمكن إعداد التحضيرات متعددة الحمض النووي الفيروسي في نفس الوقت. ويقتصر عدد التحضيرات في وقت واحد فقط من قبل عدد من الأنابيب التي عقدها الدوار نابذة فائقة السرعة (واحدة لكل فيروس ، انظر الخطوة 3.9 أدناه). نحن هنا وصف الإجراء كما لو يجري لأحد الفيروسات.
البروتوكول
1. اليوم الأول : العدوى الفيروسية وإعداد المخازن
- إعداد أطباق 10/05 (15 سم القطر) من خلايا الأنسجة للعدوى ، مثل خلايا PK - 15 لفيروس داء الكلب الكاذب (PRV) أو خلايا فيرو لفيروس الهربس البسيط (HSV).
- عندما الخلايا هي 95 -- 100 ٪ متموجة ، تصيب منهم في (وزارة الداخلية) من 5-10. للقيام بذلك ، تطعيم كل لوحة باستخدام مخزون الفيروس في الحجم الكلي لل4 مل لكل لوحة ، ثم احتضان لوحات لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. لوحات الروك بلطف كل 15 دقيقة للتأكد من أن الخلية لا يزال أحادي الطبقة المغلفة بالكامل لقيحة الفيروس. وفي الوقت نفسه ، على المديين المتوسط الدافئة للخطوة التالية.
- بعد ساعة واحدة من العدوى ، ونضح من اللقاح الفيروسي لوحات ، إضافة 15 مل من المتوسط الدافئ ، واحتضان ل20/12 في 37 ساعة في حاضنة ترطيب درجة مئوية.
- إعداد مخازن LCM (انظر الجدول رقم 1) والصخور بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لخلط دقيق. تحضير لإعادة تعليق TNE من الحمض النووي الفيروسي (انظر الجدول 2).
2. اليوم الثاني ، المرحلة 1 : تحلل الخلايا وتنبيذ فائق
- تأكيد بصريا أن العدوى من الخلايا تسبب تأثير الاعتلال الخلوي موحدة (CPE). سماح العدوى إلى التقدم حتى جميع الخلايا واعتقلت ، ولكن لم ترفع قبالة لوحة.
- كشط الخلايا المصابة في المتوسط ، والجمع بين الخلايا والمتوسطة في أنابيب مخروطية 50 مل. عدد من الأنابيب المخروطية اللازمة لهذه الخطوة ستعتمد على عدد من الأطباق المستخدمة للعدوى في الخطوة 1.2 أعلاه ، يمكن استخدام مثل أنبوب واحد مل 50 المخروطية لتكوير كحد أقصى من 3 أطباق من المتوسط 15 مل كل الاختياري : شطف لوحات مع 10 مل من برنامج تلفزيوني وتتحد مع الخلايا والمتوسطة.
- خلايا جهاز الطرد المركزي والمتوسطة لمدة 10 دقيقة في 2000 قوة centifugal النسبية (RCF) في درجة حرارة الغرفة ، ثم طاف ونضح resuspend كل بيليه في 10 مل من برنامج تلفزيوني. إذا كان نشر بيليه من عدوى فيروسية في أنابيب مخروطية متعددة في الخطوة 2.2 ، يمكن معاد في أنبوب واحد هذه المخروطية في هذه الخطوة. كرر الطرد المركزي والتطلع الاختياري : قد تكون مخزنة في هذا بيليه -20 درجة مئوية وبروتوكول تابع في وقت لاحق.
3. اليوم الثاني ، المرحلة 2 : تنبيذ فائق
الحفاظ على بيليه الخلية ومخازن LCM على الجليد كلما كان ذلك ممكنا خلال الخطوات التالية.
- إضافة إلى β - المركابتويثانول الجلسرين ٪ 0 -- LCM العازلة. تبدأ تبريد نابذة فائقة السرعة (على الخطوة 3.9 أدناه) عن طريق تحديد أن تصل إلى 4 درجة مئوية ، وتحول على فراغ.
- Resuspend الكرية خلية في 5 مل من الجلسرين ٪ 0 -- LCM العازلة حتى أنه لم يعد clumpy. إذا لزم الأمر ، دوامة أنبوب لتفريق أي خلية غير منحل بيليه.
- استخراج بإضافة 1.5 مل فريون (1،1،2 ثلاثي كلورو - 1 - ،2،2 trifluoroethane) وvortexing بقوة. أجهزة الطرد المركزي على الفور لمدة 10 دقيقة على 2000 إطار التعاون الإقليمي في درجة حرارة 4 درجة مئوية جمع الطبقة العليا مع طرف ماصة واسعة تحمل (تجنب واجهة) ونقل إلى أنبوب الاختياري الجديد : إذا كان بيليه هو الصلبة هلامي ، يمكنك بسرعة صب الطبقة العليا في أنبوب جديد.
- كرر استخراج غاز الفريون وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
- جمع الطبقة العليا (~ 5 مل) ونقل إلى أنبوب polyallomer نابذة فائقة السرعة الجديدة. إضافة β - المركابتويثانول إلى الجلسرين المتبقيين -- مخازن LCM.
- إعداد التدرج في أنبوب الطرد المركزي التي polyallomer تحتها استخراج غاز الفريون (الطبقة العليا) مع 3 مل من الجلسرين 5 ٪ -- LCM (وسط طبقة) ، وتحتها ثم مرة أخرى مع 2.5 مل من الجلسرين 45 ٪ -- LCM (الطبقة السفلي). استخدام ماصة رقيقة لتجنب تجاوز محتويات الأنبوب.
- إذا لزم الأمر ، يعد أنبوب يعادل رصيد باستخدام نفس النسب من مخازن LCM.
- أنابيب نقل في دلاء نابذة فائقة السرعة. التوازن داخل الدلاء ل0.1 غرام من بعضها البعض ، عن طريق إضافة المزيد من الجلسرين بلطف 0 ٪ -- LCM العازلة إلى الطبقة العليا (~ 5-10 ميكروليتر في وقت واحد).
- نابذة فائقة السرعة باستخدام الباردة مع الدوار دلو أفقي أو يتأرجح ، وتدور في عينات متوازنة لمدة 1 ساعة في إطار التعاون الإقليمي 77000 (25000 دورة في الدقيقة على سبيل المثال عن الدوار SW41Ti) عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
- خلال تنبيذ فائق ، وجعل على ربط الحمض النووي لالتقاط الزجاج العائم على الايثانول خطوة هطول الأمطار (4.6 أدناه). كلا طرفي عقد من الماصة باستور الزجاج وتعليق القسم الأوسط أكثر من اللهب. عند قسم من الزجاج المصهور تقريبا ، وبرفق لتمتد على الزجاج ، وثنيه برفق لإنشاء ربط بإحكام الزاوية (<90 درجة) ، وسحب بحدة ليغلق نهاية المطاف. إذا غيض من ربط الزجاج مفتوح ، عقد أكثر من طرف اللهب بحيث يذوب الزجاج بما فيه الكفاية لإغلاقه.
- بعد تنبيذ فائق ، سترى رقيقة شفافة مع بيليه بقعة داكنة في الوسط. نضح بعناية السائل من أنبوب ، بما في ذلك المرق على طول الجانبين ، ولكن تجنب بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب.
- إضافة 0.5 مل TNE في درجة حرارة الغرفة.
- بيليه ترك الجلوس لمدة لا تقل عن 10 دقيقة للسماح للترطيب بيليه. Optional : بيليه وربما أيضا في resuspend TNE بين عشية وضحاها ، إذا كان يحتفظ بها في 4 درجات مئوية.
4. اليوم الثالث : الأمطار "الشبح" DNA
- تفريق بيليه بواسطة pipetting مع طرف ماصة العيار الصغير (على سبيل المثال تلميح ماصة P200). لا تقلق بشأن القص في هذه الخطوة ، لأنه لا تزال تحتوي على الحمض النووي الفيروسي في capsids في هذه النقطة. إضافة الكواشف التالية إلى الأنبوب الذي يحتوي على بيليه الفيروسية في درجة حرارة الغرفة ، لتدمير capsids :
- 4.25 مل TNE
- 0.25 مل SDS 10 ٪
- 2 ملغ بروتين K
حذار من القص من هنا فصاعدا ، مثل استخدام واسع يحمل ماصات ولا دوامة المواد الفيروسية
- استخراج البروتينات الفيروسية وذلك بإضافة 5 مل من الفينول كلوروفورم ، والبدء فورا في قلب vortexing أو للحفاظ على مستحلب. المزيج لمدة 10 ثانية ، ثم الطرد المركزي المستحلب لمدة 5 دقائق على 2000 إطار التعاون الإقليمي في درجة حرارة الغرفة. جمع الطبقة العليا مع طرف ماصة واسعة تتحمل ، وتجنب واجهة ، ونقل إلى أنبوب جديد الاختياري : استخدام قفل المرحلة هلام (PLG) الأنابيب في هذه الخطوة لتجنب التلوث من واجهة.
- كرر استخراج الفينول كلوروفورم ، وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
- بعد استخراج الفينول كلوروفورم الثانية ، جمع الطبقة العليا في أنبوب 30 مل Corex الزجاج والبرد في الأنبوب -20 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة ، مع الحرص على أن لا تجميد.
- إضافة 10 مل من الايثانول الجليد الباردة ، وغطاء للأنبوب (على سبيل المثال عن طريق تمتد قطعة من M Parafilm فوق الجزء العلوي) ، وعكس لخلط فورا. يراقب عن الحمض النووي "شبح" لتظهر ، والتي تتكون من ترسيب لزج رقيقة. عكس الأنبوب بلطف لمزج وتسبب المزيد من الحمض النووي لزجة تترسب إلى المجموعة معا.
- استخدام الزجاج هوك لالتقاط شبح الحمض النووي (ق). لطخة بعناية الحمض النووي لإزالة السائل الزائد ، ثم ضع هوك (نصيحة لأسفل) في أنبوب 1.5 مل ، والسماح ليجف. إضافة ،25-،5 مل من TE بحل شبح الحمض النووي. تسمح إعادة تعليق من الحمض النووي والمضي قدما على الأقل ساعة واحدة. الحمض النووي مخزن في 4 درجات مئوية. اختياري : لتعظيم العائد الحمض النووي ، وكسر الزجاج ورطتها في أنبوب مل 1.5 ، بحيث يمكن إعادة تعليق قبالة شظايا الزجاج يستمر مع مرور الوقت.
5. ممثل النتائج
مع وزارة الداخلية عالية بما فيه الكفاية ، وينبغي أن الخلايا CPE تحقيق كامل في غضون 18 ساعة بعد الإصابة ~ (HPI) لسلالات PRV من النوع البري ، و~ 24 HPI للسلالات البرية HSV - 1 - نوع (الشكل 1). بمجرد أن يتم حصاد الخلايا المصابة بيليه ، لا يمكن للبروتوكول الخطوات المتبقية تكون كاملة في يوم واحد أو طويلة امتدت على مدى يومين (الشكل 2).
عند إعداد السنانير الزجاج لالتقاط شبح الحمض النووي ، فمن المهم لجعل زاوية ربط يكون أقل من 90 درجة ، بحيث انه في وقت لاحق يمكن أن تندرج في قاعدة أنبوب مل 1.5 (الشكل 3). ختم هذا غيض من الخطاف يمنع فقدان الحمض النووي داخل الماصة.
الحمض النووي شكل أشباح خلال هطول الأمطار والخطوة سوف تظهر المواضيع ، أبيض لزج (الشكل 4). هذه الكلية والعصا مع بعضها البعض و / أو ربط الزجاجية المستخدمة لالتقاط الحمض النووي. بالتالي يمكن استخدام الزجاج ربط نفسه لجمع ما يصل مواضيع متعددة من الحمض النووي من ضمن الحل هطول الأمطار.
| اختيار العمود على أساس حجم المطلوب : | 10 مل | 15 مل | 20 مل | 40 مل |
| 1M بوكل | 1.3 مل | 1.9 مل | 2.5 مل | 5 مل |
| 1M تريس (الرقم الهيدروجيني 7.4) | 300 ميكرولتر | 450 ميكرولتر | 600 ميكرولتر | 1.2 مل |
| 1M MgCl 2 | 50 ميكرولتر | 75 ميكرولتر | 100 ميكرولتر | 200 ميكرولتر |
| 0.5 EDTA | 10 ميكرولتر | 15 ميكرولتر | 20 ميكرولتر | 40 ميكرولتر |
| NP40/IGEPAL | 50 ميكرولتر | 75 ميكرولتر | 100 ميكرولتر | 200 ميكرولتر |
| β - المركابتويثانول (إضافة مباشرة قبل الاستعمال) | 4.3 ميكرولتر | 6.5 ميكرولتر | 8.6 ميكرولتر | 17.2 ميكرولتر |
| نسب استخدام الجلسرين في المئة عن المطلوب (0 ، 5 ، أو 45 ٪) | ||||
| 0 ٪ الجلسرين | لا شيء | لا شيء | لا شيء | لا شيء |
| ماء | 8.3 مل | 12.5 مل | 16.7 مل | 33.4 مل |
| 5 ٪ الجلسرين | 0.5 مل | 0.8 مل | 1.0 مل | 2.0 مل |
| ماء | 7.8 مل | 11.7 مل | 15.7 مل | 31.4 مل |
| 45 ٪ زlycerol | 4.5 مل | 6.8 مل | 9.0 مل | 18.0 مل |
| ماء | 3.8 مل | 5.7 مل | 7.7 مل | 15.4 مل |
الجدول 1. وصفات لإعداد مخازن LCM
| لحجم 50 ملم |
| 5 مل كلوريد الصوديوم 1M |
| 2.5 مل 1M تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 |
| 1 مل 0،5 EDTA |
| 41.5 مل H 2 O |
الجدول 2. إعداد TNE (كلوريد الصوديوم 0.1 م و 50 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 7.5 و 10 ملي EDTA)
| لحجم 1 لتر |
| 0،2 ز بوكل |
| 0،2 ز KH 2 PO 4 |
| 8 ز كلوريد الصوديوم |
| 1.15g نا 2 4 هبو |
| H 2 O ل1L |
الجدول 3. إعداد برنامج تلفزيوني (2.7 ملي بوكل ؛ 1.5 ملم KH 2 ص 4 ؛ 137 مم كلوريد الصوديوم ؛ 8.1 ملي نا 2 هبو (4) ؛ الرقم الهيدروجيني 7.0)
الشكل 1. PK15 الخلايا (A) قبل الإصابة ، (B) في منتصف الطريق من خلال العدوى ، و (C) في تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) ، وبعد تعدد عالية من العدوى.
الشكل 2. نظرة عامة للبروتوكول.
الشكل 3. خطاطيف تستخدم نماذج تمثيلية ثلاثة من الزجاج لجمع أشباح الحمض النووي الفيروسي.
الشكل 4. سبيل المثال الممثل عن "الأشباح" بشكل جيد وفيرة الحمض النووي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد وضعت أصلا أجزاء من هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الفيروسي في BSL4 الظروف ، لكنه يتكيف بشكل جيد على قدم المساواة لغير BSL شروطه. 4 ونحن عادة ما تستخدم هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي من PRV ألفا herpesviruses وHSV - 1 ، التي الجينوم الحمض النووي المغلقة في قفيصة البروتينية ومحاطة المغلف الدهون. 7،8 ومع ذلك فمن المرجح للتكيف مباشرة إلى غيره من فيروسات الحمض النووي كبيرة ، بما في ذلك بيتا وغاما وherpesviruses الفيروسات الغدية. ويشيع استخدام قلع مماثلة لل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
الكتاب نقدر مساهمات سميث جريج ، بوميرانز ليزا ، ليمان مات ، إلدريدج مارليس ، Halina Goraczniak Staniszewska ، وأعضاء في مختبر Enquist هذا البروتوكول صقل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| الفريون (1،1،2 ثلاثي كلورو - 1 - ،2،2 trifluoroethane) | الصياد | T178 - 4 | تحقق مع المؤسسة للحصول على المبادئ التوجيهية بشأن التخلص المناسب من النفايات المحتوية على غاز الفريون أو راجع منديز وآخرون. عن بدائل محتملة الفريون 9 |
| أنابيب المرحلة هلام قفل ، والقدرات 15ml الثقيلة | 5 PRIME | 2302850 | اختياري |
| أنابيب Polyallomer نابذة فائقة السرعة | بيكمان * | 331372 * | * حدد أنابيب ملائمة لنابذة فائقة السرعة الخاصة بك ، ويتم تضمين هذه كمثال فقط |
| NP - 40 / IGEPAL | سيغما | I - 3021 | |
| PK - 15 الخلايا | ATCC | CCL - 33 | |
| خلايا فيرو | ATCC | CCL - 81 | |
| PBS | HyClone | SH30028.03 |
المراجع
- Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations. J Virol. 84, 5303-5313 (2010).
- Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications. J Virol. 77, 10106-10112 (2003).
- Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes. Nat Commun. 1, 146-146 (2010).
- Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector. Science. 203, 541-544 (1979).
- Smith, G. A., Enquist, L. W. Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J Virol. 73, 6405-6414 (1999).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).
- Roizman, B., Pellett, P. E. Fields Virology. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).
- Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus. J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).
- Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus. J Med Virol. 31, 129-134 (1990).
- Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus. PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
