التحلل الضوئي للمركبات في قفص يسمح للإنتاج زيادات سريعة ومحلية في مختلف تركيز المركبات النشطة من الناحية الفسيولوجية. هنا ، وتبين لنا كيفية الحصول على التصحيح ، المشبك التسجيلات جنبا إلى جنب مع التحليل الضوئي في مخيم في قفص أو قفص كاليفورنيا لدراسة تنبيغ الشمية في الخلايا العصبية الشمية فصل الماوس الحسية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
فلاش التحلل الضوئي للمركبات محبوس في سيليا من العصبونات الحسية الشمية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
التحلل الضوئي للمركبات في قفص يسمح للإنتاج زيادات سريعة ومحلية في مختلف تركيز المركبات النشطة فسيولوجيا 1. المركبات التي هي عبارة عن جزيئات في قفص خاملة من الناحية الفسيولوجية عن طريق قفص الكيميائية التي يمكن كسرها ومضة من الضوء فوق البنفسجي. هنا ، وتبين لنا كيفية الحصول على التصحيح ، جنبا إلى جنب مع تسجيلات المشبك التحلل الضوئي للمركبات في قفص لدراسة تنبيغ الشمية في الخلايا العصبية الشمية فصل الماوس الحسية. عملية تنبيغ الشم (الشكل 1) يحدث في الخلايا العصبية الحسية الأهداب الشمية ، حيث ملزم لمستقبلات الرائحة يؤدي إلى زيادة في مخيم الذي يفتح بوابات دوري النوكليوتيدات (CNG) قنوات 2. كاليفورنيا الدخول من خلال القنوات CNG تنشيط قنوات الكالسيوم تنشيط الكلورين. نعرض كيفية فصل الخلايا العصبية من الماوس ظهارة شمية (3) وكيفية تفعيل قنوات الغاز الطبيعي المضغوط أو تنشيط قنوات الكالسيوم الكلور بواسطة التحلل الضوئي في مخيم قفص 4 أو 5 في قفص كا </ سوب>. نستخدم مصباح فلاش 6،7 لتطبيق ومضات الأشعة فوق البنفسجية إلى المنطقة الهدبية إلى مخيم uncage أو الكالسيوم في حين تؤخذ التصحيح ، المشبك تسجيلات لقياس التيار في تكوين الجهد المشبك خلية كاملة 11/08.
البروتوكول
1. الأجهزة والمعدات
- لقياس استجابة العصبونات الحسية الشمية للتحلل الضوئي للمركبات المقيدة، نستخدم مصباحاً وميضياً مدمجاً مع نظام تسجيل تقليدي لتقنية تثبيت الرقعة (patch-clamp)، يتكون من: مضخم تثبيت الرقعة، وقطب تسجيل وقطب مرجعي متصلين بالمرحلة الرأسية (head-stage) لمضخم تثبيت الرقعة، ومحول رقمي، وجهاز كمبيوتر، وبرمجيات لتحصيل البيانات، ومتحكمات دقيقة، ومجهر فلوري فوقي، ونظام تروية، وطاولة مضادة للاهتزاز، وقفص فاراداي (الشكل 2).
- لتوليد ومضة عالية الكثافة من الأشعة فوق البنفسجية (UV)، نستخدم مصباح وميض زينون (Rapp OptoElectronic JML-C2 Flash Unit، الشكل 3A) يعمل عن طريق تفريغ مكثف عالي الجهد عبر أنبوب وميض ذي قوس قصير مملوء بغاز الزينون6-7. ويمكن تحفيز ومضة الضوء يدوياً أو بواسطة الكمبيوتر، باستخدام نفس البرمجيات التي تتحكم في التحصيل الفيزيولوجي الكهربائي.
- يتم إدخال مرشح قصير المدى للأشعة فوق البنفسجية مُحسَّن لتطبيقات إزالة التقييد (270-390 nm) في فتحة مخرجات المصباح الوميضي، ويتم توصيل دليل ضوئي من ألياف الكوارتز بالمجهر (انظر 1.5).
- يمكن تعديل كثافة ومضة الضوء، وبالتالي مدى التحلل الضوئي، عن طريق تغيير معاملات محددة:
الجهد أو السعة6. وبالفعل، ترتبط كثافة الضوء بالطاقة المخزنة في المكثف وتعتمد على قيمة السعة وعلى الجهد عبره، وفقاً للعلاقة القياسية 0.5 CV2. يمكن اختيار واحدة من ثلاث قيم للسعة من اللوحة الأمامية للمصباح الوميضي (C1=1000 μF، أو C2=2000 μF، أو C3=3000 μF)، كما يمكن تغيير الجهد بين 100 و385 فولت (الشكل 3A)، مما ينتج طاقة مخزنة تتراوح بين 5 و220 J. وتتفاوت مدة الوميض من 0.5 إلى 1 ms عند عرض نصف القيمة القصوى، وتعتمد على قيمة السعة المختارة. وقبل اختيار سعة مختلفة أو ضبط الجهد على قيمة أقل، من الضروري تفريغ المكثف عن طريق اختيار وضع التفريغ في اللوحة الأمامية للمصباح الوميضي (الشكل 3A).
ومع ذلك، فإن الطاقة الضوئية لا تتناسب طردياً ببساطة مع الطاقة المخزنة لأسباب متعددة تتعلق بفيزياء التفريغ الغازي وبالفقد غير الخطي في الدائرة مع زيادة الطاقة الكهربائية6. ولقياس الطاقة المرتبطة بومضة ضوئية، يمكن استخدام مقياس جول، مثل JM10 الذي توفره شركة RappOptoElectronics. يلاحظ أن الطاقة عند مخرج دليل الضوء الكوارتزي مع وجود مرشح الأشعة فوق البنفسجية تتراوح بين 1-15 mJ لكل ومضة، كما ورد في دليل المستخدم لوحدة Rapp OptoElectronic Flash Unit.
تتوفر مجموعة ثنائي ضوئي (الشكل 3B) مع وحدة المصباح الوميضي، ويمكن استخدامها لتقدير تغيرات كثافة الضوء كدالة في C وV. وبالفعل، فإن مخرجات الثنائي الضوئي تتناسب طردياً مع كثافة الضوء. ووفقاً لتعليمات دليل المستخدم، يتم توصيل دليل الضوء بمدخل مجموعة الثنائي الضوئي، بينما يتم توصيل المخرج بجهاز أوسيلوسكوب. يوضح الشكل 3C ذروة جهد مخرجات الثنائي الضوئي استجابةً لومضات ضوئية لقيم السعة الثلاث C1 أو C2 أو C3 المتاحة في وحدة المصباح الوميضي لدينا، مقابل الجهد المطبق. وستتغير هذه القيم مع تقادم لمبة الوميض. ومن الممارسات الجيدة استخدام الثنائي الضوئي بانتظام للتحقق من تدهور لمبة الوميض.
وبدلاً من تعديل السعة و/أو الجهد في اللوحة الأمامية، يمكن الحصول على تحكم أدق وأسرع في كثافة الضوء عن طريق وضع مرشحات الكثافة المتعادلة في فتحة المرشح الثانية للمصباح الوميضي (الشكل 3A). هذا النهج أسرع، بالإضافة إلى أن مدة الوميض، التي تعتمد على قيمة السعة المختارة، لا تتغير. وباستخدام مرشحات كثافة متعادلة تتراوح نسبة نفاذيتها من 100% إلى 0.1 %، يمكن تعديل كثافة الوميض بسرعة عبر نطاق واسع. - تُوجه ومضة الضوء نحو العصبون، المزروع في أطباق ذات قاعدة زجاجية، من خلال دليل ضوئي من ألياف الكوارتز (الشكل 2). ويتم توصيل دليل الضوء بملحق الفلورية فوقية للمجهر المقلوب باستخدام محول. ويقوم مكعب مرشح معدل بدون مرشح إثارة بتوجيه شعاع الأشعة فوق البنفسجية إلى العصبون بواسطة مرآة ثنائية اللون (dichroic mirror).
- يتم تركيز الضوء عبر عدسة شيئية غمر زيتي بقوة 100x. ويتم تصور المنطقة التي تغطيها الومضة عن طريق إدخال دليل الضوء في جهاز إنارة يوفر مصدراً مستمراً للضوء المرئي. وتُعرض الصورة (الممثلة باللون الأصفر في الفيديو) على شاشة عبر كاميرا CCD متصلة بالمجهر. ويتم رسم محيط المنطقة المضاءة على الشاشة لتحديد منطقة ومضة الأشعة فوق البنفسجية للتجارب. وقبل إرسال ومضة الأشعة فوق البنفسجية، يتم وضع المنطقة الهدبية للعصبون ضمن المنطقة المرسومة على الشاشة.
- يتم التحكم في حجم بقعة الأشعة فوق البنفسجية بواسطة تكبير العدسة الشيئية، وقطر دليل الضوء، وموضع دليل الضوء في الجزء الخلفي من المجهر. نستخدم عدسة شيئية غمر زيتي بتكبير 100x. ويتم قياس قطر البقعة الدائرية عن طريق توجيه الضوء من جهاز إنارة على شريحة ميكرومتر موضوعة على مسرح المجهر. يبلغ قطر البقعة في إعدادنا تقريباً 16 أو 33 أو 50 أو 105 μm لدليل ضوئي بقطر يبلغ على التوالي 200 أو 400 أو 600 أو 1250 μm.
2. تحضير المحاليل
التشريح
- محلول رينجر: 140 mM NaCl، و5 mM KCl، و1 mM CaCl2، و1 mM MgCl2، و10 mM HEPES، و10 mM glucose، و1 mM sodium pyruvate (تم ضبط الأس الهيدروجيني pH 7.4 باستخدام 1M NaOH).
- محلول خليط الإيقاف: محلول رينجر مع 0.1 mg/ml BSA، و0.3 mg/ml leupeptin، و0.02 mg/ml DNaseI.
- محلول رينجر الخالي من الأيونات ثنائية التكافؤ: 140 mM NaCl، و5 mM KCl، و10 mM HEPES، و1 mM EDTA، و10 mM glucose، و1 mM sodium pyruvate (pH 7.4 باستخدام 1M NaOH). يُضاف 200 μM cysteine و2 U/ml papain للتفكيك الإنزيمي.
ملاحظة: يتم ترشيح المحاليل تعقيميًا لاستخدامها في عملية التشريح.
محاليل تسجيل تثبيت الرقعة
المحاليل خارج الخلوية
- محلول رينجر خارج الخلوي: 140 mM NaCl، و5 mM KCl، و1 mM CaCl2، و1 mM MgCl2، و10 mM HEPES، و10 mM glucose، و1 mM sodium pyruvate (تم ضبط الرقم الهيدروجيني pH 7.4 باستخدام 1M NaOH).
- محلول رينجر منخفض الكالسيوم (Low-Ca): 140 mM NaCl، و5 mM KCl، و10 mM EGTA، و1 mM MgCl2، و10 mM HEPES، و10 mM glucose، و1 mM sodium pyruvate (تم ضبط الرقم الهيدروجيني pH 7.4 باستخدام 1M NaOH).
المحاليل داخل الخلوية
قم دائمًا بتحضير واستخدام محاليل المركبات المقيدة (caged compounds) في ضوء خافت لتجنب تحلل هذه المركبات بفعل الضوء المحيط. احمِ الحاويات من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
cAMP المقيّد:
- قم بتحضير محلول داخل خلوي يحتوي على 145 mM KCl و4 mM MgCl2 و0.5 mM EGTA و10 mM HEPES و1 mM MgATP و0.1 mM NaGTP (مع ضبط pH عند 7.4 باستخدام 1M KOH).
- قم بتحضير محلول مخزون عن طريق إذابة cAMP المقيد (BCMCM-cAMP4) في DMSO بتركيز 50 mM. قسم المحلول إلى حصص حجم كل منها 5 μl. يُخزن لمدة تصل إلى سنة واحدة عند -20°C.
- أذب حصة من محلول cAMP المقيد المخزون في المحلول داخل الخلوي للحصول على تركيز نهائي قدره 50 μM من cAMP المقيد. اخلط المزيج باستخدام جهاز رج vortex.
- قسم محلول cAMP المقيد داخل الخلوي إلى حصص حجم كل منها 1 ml. تُخزن لمدة تصل إلى شهرين عند -20°C حتى وقت الاستخدام.
الكالسيوم المقيد (Caged Ca):
نقوم بتحضير محاليل داخل خلوية تحتوي على 3 mM من DMNP-EDTA5 محملة بنسبة 50% بـ 1.5 mM من Ca.
- قم بتحضير محلول داخل خلوي يحتوي على 140 mM KCl (أو CsCl)، و10 mM HEPES (مع ضبط pH عند 7.4 باستخدام 1M KOH أو CsOH).
- افتح قارورة تحتوي على 5 mg من DMNP-EDTA. أضف 52.8 μl من محلول قياسي لكلوريد الكالسيوم بتركيز 0.1 M و1 ml من المحلول داخل الخلوي. اخلط المكونات باستخدام جهاز vortex.
- لتجنب تحرير Ca المقيد بواسطة الضوء المحيط، انقل المحلول إلى أنبوب محمي من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم. أضف المحلول داخل الخلوي حتى يصل الحجم النهائي إلى 3.5 ml. اخلط المكونات باستخدام جهاز vortex. قم بتقسيم محلول Ca المقيد داخل الخلوي إلى حصص قدرها 1 ml تقريبًا، وتُخزن لمدة تصل إلى شهرين عند -20°C حتى وقت الاستخدام.
ملاحظات: أثناء التجارب، يجب حماية محاليل المركبات المتقيدة (caged compound) من الضوء باستخدام ورق الألمنيوم والحفاظ عليها مبردة على الثلج. قم بترشيح المحلول داخل الخلوي (intracellular solution) باستخدام مرشح معقم.
3. تفكيك العصبونات الحسية الشمية للفئران
تم التعامل مع الحيوانات وفقاً للإرشادات الإيطالية لاستخدام حيوانات المختبر (المرسوم التشريعي 27/01/1992، رقم 116) وإرشادات الاتحاد الأوروبي بشأن البحوث الحيوانية (رقم 86/609/EEC).
- قم بتجهيز ثلاثة أطباق ذات قاعدة زجاجية مطلية بـ 10 mg/ml من concanavalin-A و 10 mg/ml من poly-L-lysine.
- للتحضير لعملية التشريح، جهز 1 ml من محلول Ringer’s الخالي من التكافؤ الثنائي. املأ طبقين بتري بقطر 50 mm مطليين بمادة Sylgard بمحلول Ringer’s وضعهما على الثلج. قم أيضاً بتبريد خليط papain-cysteine، و 0.5 ml من محلول stop mix، ومحقنة بها مرشح 0.22 μm تحتوي على حوالي 10 ml من محلول Ringer’s.
- يتم التضحية بالفأر عن طريق الاختناق بغاز CO2 متبوعاً بفصل الرأس. قم بإزالة الجلد الذي يغطي الجمجمة، واقطع على طول خطوط الفك وضع الرأس في طبق بتري مطلي بمادة Sylgard.
- ضع الطبق تحت مجهر ستيريو. وباستخدام مشرط، قم بشق الرأس سهمياً على طول الخط المتوسط. اقلب نصف الرأس بحيث يكون الجانب الإنسي للأعلى. قم بإزالة الحاجز بعناية للكشف عن القرنيات الأنفية (راجع أيضاً Cygnar et al., 201013).
- باستخدام ملقط رقم 3 ومشرط، قم بإزالة القرنيات الأنفية المبطنة بالظهارة الشمية. انقلها إلى طبق بتري مطلي بمادة Sylgard.
- باستخدام ملقط superfine رقم 55، افصل قطع الظهارة الشمية عن الأجزاء المتصلة بها من القرنيات الأنفية. انقلها إلى أنبوب يحتوي على 1 ml من محلول Ringer’s الخالي من التكافؤ الثنائي. أضف خليط papain و cysteine. وباستخدام مقصات دقيقة، قم بتقطيع الظهارة وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق. قم بالتقطيع برفق مرة أخرى بالمقصات الدقيقة وانتظر لمدة 5 دقائق إضافية.
- باستخدام ماصة باستور مصقولة باللهب، انقل المحتوى إلى أنبوب يحتوي على 0.5 ml من محلول stop mix.
- قم بالطرد المركزي عند 300 g (1500 RPM) لمدة 5 دقائق. تخلص من السائل العلوي وأضف حوالي 1 ml من محلول Ringer’s المفلتر. قم بالترحيض برفق باستخدام ماصة باستور مصقولة باللهب.
- ضع حوالي 0.3 ml من المحلول الذي يحتوي على الخلايا في مركز الأطباق الثلاثة ذات القاعدة الزجاجية. اترك الخلايا لتترسب لمدة ساعة واحدة تقريباً عند +4°C. ثم أضف محلول Ringer’s.
4. التسجيل
- قم بتجهيز ماصات الرقعة (patch pipettes) من الشعيرات البوروسيليكاتية للحصول على مقاومات تتراوح بين 3-7 MΩ عند ملئها بالمحلول داخل الخلوي.
- ضع طبقاً ذا قاع زجاجي يحتوي على العصبونات الحسية الشمية المفككة على منصة المجهر المقلوب. قم بالإرواء باستخدام محلول رينجر.
- قم بحماية سرنجة تحتوي على المحلول داخل الخلوي الذي يضم المركبات المقيدة (caged compounds) من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم واحفظها مبردة. اعمل في ضوء خافت لتجنب تحلل المركبات المقيدة بفعل الضوء المحيط.
- ابحث عن عصبون حسي شمّي معزول بأهداب سليمة عند تكبير 100x. حرك منصة المجهر لوضع المنطقة الهدبية داخل الدائرة المرسومة على الشاشة لتحديد منطقة الوميض فوق البنفسجي (UV flash) التي تم تحديدها مسبقاً.
- املأ ماصة الرقعة بالمحلول داخل الخلوي الذي يحتوي على المركب المقيد باستخدام إبرة مرنة. أزل الفقاعات من طرف الماصة. أدخل الماصة في الحامل الموجود على الرأس الميكانيكي لمضخم تثبيت الرقعة (patch-clamp amplifier). اقترب من جسم العصبون (soma) باستخدام الملاعب الدقيق (micromanipulator) وقم بتطبيق شفط خفيف للحصول على ختم جيجا أوم (gigaohm seal). اضبط الجهد عند -60 mV وقم بتطبيق شفط إضافي للوصول إلى وضع الخلية الكاملة (whole-cell mode) باستخدام تقنيات تثبيت الرقعة القياسية12.
- انتظر لمدة دقيقتين على الأقل للسماح بانتشار المركب المقيد داخل الأهداب.
- ابدأ بروتوكول التحفيز على جهاز الكمبيوتر وسجل الاستجابة. استخدم مرشح تمرير منخفض (low-pass filter) بتردد 1 kHz وقم بالرقمنة بتردد أخذ عينات لا يقل عن 2 kHz.
- يتضمن بروتوكول التحفيز النموذجي تثبيت الجهد عند قيمة ثابتة وتحفيز إطلاق وميض UV من مصباح الوميض لإجراء التحلل الضوئي للمركب المقيد في المنطقة الهدبية.
5. النتائج النموذجية:
يجب أن تكون قادراً على إحداث تحرير موضعي لـ cAMP المقيد أو لـ Ca المقيد في المنطقة الهدبية لعصبون حسي شمّي معزول، وتسجيل استجابة التيار في تكوين تثبيت الجهد للخلية بأكملها.
يوضح الشكل 4 تيارًا داخليًا نموذجيًا تم استحثاثه بواسطة ومضة فوق بنفسجية (UV) أدت إلى التحلل الضوئي لـ cAMP المقيد، وقد سُجل عند جهد قدره -60 mV في وجود محلول رينجر منخفض الكالسيوم (low Ca Ringer’s solution) خارج الخلية. في هذه الحالة، يعود التيار الداخلي إلى دخول Na عبر قنوات CNG. كانت مرحلة صعود التيار سريعة وتم تمثيلها بدالة أسية واحدة بثابت زمني قدره 3.4 ms.
يوضح الشكل 5A-B استجابات عصبون حسي شمّي آخر في تركيز Ca منخفض وفي محلول رينجر الذي يحتوي على 1mM Ca. أصبحت مرحلة الصعود للتيار عند -60 mV أبطأ بكثير ومتعددة الأطوار (الشكل 5 A-B). ويعود ذلك إلى دخول Ca إلى الأهداب عبر قنوات CNG وتنشيط تيار Cl ثانوي10. إن مكون التيار الكاتيوني المبكر، الناتج عن تنشيط CNG، يكون أصغر في محلول رينجر بتركيز 1mM Ca منه في محلول Ca المنخفض بسبب الحصر الناتج عن أيونات Ca النافذة التي تقلل من التيار الإجمالي.
وهناك طريقة أخرى للحد من زيادة Ca في الأهداب وهي تثبيت جهد العصبون عند +60 mV (الشكل 5 C-D). وقد تم وصف مرحلة الصعود في الاستجابة الناتجة عن تحرير cAMP عند +60 mV بدقة بواسطة دالة أسية واحدة بثابت زمني قدره 6.7 ms، مما يشير إلى وجود مكون تيار واحد فقط.
من خلال التحرير الضوئي لـ Ca داخل أهداب عصبون حسي شمّي، يجب أن تكون قادراً على قياس تيار متزايد بسرعة. يتم حمل هذا التيار بواسطة أيونات Cl. يوضح الشكل 6 A التيارات الداخلة عند -50 mV الناتجة عن التحرير الضوئي لـ caged Ca استجابةً لومضات UV بكثافات مختلفة. وقد تم وصف مرحلة الصعود لتيارات Cl المنشطة بـ Ca بشكل جيد بواسطة دالة أسية واحدة مع ثوابت زمنية تتراوح بين 3.8 إلى 5 ms (الشكل 6 B).
الشكل 1. نقل الإشارة الشمية في أهداب الخلايا العصبية الحسية الشمية. ترتبط جزيئات المواد الشمية بمستقبلات الشم (OR)، مما يؤدي إلى تنشيط بروتين G الذي يقوم بدوره بتنشيط إنزيم أدينيلات سيكلاز (ACIII)، مما ينتج عنه زيادة داخل خلوية في cAMP. يعمل cAMP على فتح القنوات التي يتم التحكم فيها عن طريق النوكليوتيدات الحلقية (CNG)، مما يسمح بدخول أيونات Na و Ca. تؤدي زيادة Ca داخل الخلايا إلى تنشيط قنوات Cl المنشطة بالكالسيوم. يمكن إدخال cAMP المقيد أو Ca المقيد في الأهداب عن طريق الانتشار عبر ماصة الرقعة (patch pipette). ينتج وميض من الأشعة فوق البنفسجية (UV) تحللاً ضوئياً للمركب المقيد (معدل، بإذن من Pifferi et al. 20062).
الشكل 2. نظام تسجيل تثبيت الرقعة والتحلل الضوئي الوميضي. تشمل مكونات الإعداد مضخم تثبيت الرقعة، وجهاز كمبيوتر، ومحول رقمي، ومجهراً فلورياً فوقياً، ولمبة زينون وميضية، وكاميرا CCD، وشاشة مراقبة. تشير الخطوط الزرقاء والبنفسجية على التوالي إلى مسار الضوء المرئي والأشعة فوق البنفسجية UV.
الشكل 3. مصباح زينون وميضي. (أ) مصدر الضوء المستخدم في التحلل الضوئي الومضي للمركبات المقيدة (caged compounds). (ب) وحدة الصمام الثنائي الضوئي المستخدمة لتقييم شدة الومضة الضوئية. (ج) تم توصيل الدليل الضوئي من المصباح الوميضي بمدخل الصمام الثنائي الضوئي، وتم عرض المخرجات على راسم الإشارة. تم اختيار إحدى قيم السعة الثلاث المتاحة (C1 أو C2 أو C3) عبر مفتاح اللوحة الأمامية للمصباح الوميضي، وتم تغيير الجهد عن طريق تدوير المقبض الموجود في اللوحة الأمامية. تم رسم جهد المخرجات من الصمام الثنائي الضوئي استجابةً لشدات وميض مختلفة مقابل الجهد المطبق لكل قيمة سعة: C1 = 1000 μF، أو C2 = 2000 μF، أو C3 = 3000 μF. تم استخدام دليل ضوئي بقطر 600 μm.
الشكل 4. تسجيل تثبيت الرقعة (Patch-clamp) استجابةً للتحلل الضوئي لـ cAMP المقيد في محلول يحتوي على Ca خارج خلوي منخفض. (A) استجابة تيار الخلية الكاملة التي تم تحفيزها في عصبون حسي شمّي معزول عن طريق التحلل الضوئي لـ cAMP المقيد والمتمركز في الأهداب. تم إطلاق ومضة أشعة فوق بنفسجية في الوقت المشار إليه بالسهم. كانت جهود الاحتفاظ -60 mV. (B) تم ملاءمة مرحلة صعود التيار بشكل جيد باستخدام دالة أسية واحدة (الخط المنقط) بثابت زمني قدره 3.4 ms.
الشكل 5. استجابات التيار الناتجة عن التحلل الضوئي لـ cAMP المقيد في محاليل منخفضة Ca وفي محاليل رينجر. (أ) غمر خلية عصبية حسية شمية في محلول رينجر يحتوي على 1 mM Ca أو في محلول منخفض Ca عند جهد تثبيت قدره -60 mV. تم إطلاق وميض فوق بنفسجي في الوقت المشار إليه بالسهم. (ب) أظهرت استجابات التيار المرسومة على مقياس زمني موسع مرحلة صعود متعددة الأطوار في محلول رينجر، بينما كانت مرحلة الصعود في الاستجابة المسجلة في محلول منخفض Ca متوافقة جيداً مع دالة أسية واحدة (الخط المنقط) بثابت زمني قدره 3.5 ms. (ج) استجابات التيارات من نفس الخلية العصبية الموضحة في (أ) المغمورة في محلول رينجر عند جهد تثبيت قدره -60 و +60 mV. (د) أظهرت استجابات التيار المرسومة على مقياس زمني موسع مرحلة صعود متعددة الأطوار عند -60 mV، بينما عند +60 mV كانت مرحلة الصعود متوافقة جيداً مع دالة أسية واحدة بثابت زمني قدره 6.7 ms (الخط المنقط).
الشكل 6. الاستجابات للتحلل الضوئي للكالسيوم المقيد (caged Ca). (أ) تيارات الخلية الكاملة المستحثة عن طريق التحلل الضوئي للكالسيوم المقيد عند -50 mV. تم إطلاق ومضات الأشعة فوق البنفسجية في الوقت الذي يشير إليه السهم. تم تغيير شدة الومضات باستخدام مرشحات الكثافة المحايدة. (ب) يوضح المقياس الزمني الموسع الزيادة السريعة في التيار بعد التحرر الضوئي للكالسيوم. تم تمثيل التيارات بشكل جيد بواسطة دالة أسية واحدة (الخطوط المنقطة)، مع ثوابت زمنية بلغت 5، 4.8، 3.8 ms. (أعيد إنتاجه، بإذن من Boccaccio & Menini, 200710).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
فلاش التحلل الضوئي للمركبات في قفص جنبا إلى جنب مع التصحيح ، المشبك التسجيلات هي تقنية مفيدة للحصول على القفزات السريعة والمحلية في تركيز الجزيئات النشطة من الناحية الفسيولوجية داخل وخارج الخلايا. وتم تصنيع عدة أنواع من compounds1 في قفص ، ويمكن تطبيق هذه التقنية لمختلف أنواع الخلايا ، بما في ذلك الخلايا المستزرعة معربا عن قنوات ايون التي يمكن تفعيلها عن طريق التضمين أو التحلل الضوئي لبعض المركبات المتوفرة في قفص 11.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| معدات | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| محول فلاش مصباح على حدة المجهر | راب الكتروضوئي | FlashCube 70 | |
| الجدول الهواء | TMC | MICRO - G 63-534 | |
| التحويل الرقمي | محوار الآلات | Digidata 1322A | |
| الحصول على البيانات برمجيات | محوار الآلات | pClamp 8 | |
| تحليل البيانات برمجيات | WaveMetrics | ايجور | |
| مرآة للمحول وحدة | راب الكتروضوئي | M70/100 | |
| القطب حامل | محوار الآلات | 1 - HL - U | |
| قفص فاراداي | أدلى مخصص | ||
| تصفية المكعب | اوليمبوس | U - MWU | فلتر إزالة الإثارة |
| مصباح فلاش | راب الكتروضوئي | JML - C2 | |
| ملقط دومون # 55 | العالم آلات دقيقة | 14099 | |
| الزجاج الشعيرات الدموية | العالم آلات دقيقة | PG10165 - 4 | |
| الزجاج قاع الطبق | العالم آلات دقيقة | FD35 - 100 | |
| منار | اوليمبوس | تسليط الضوء على 3100 | |
| المقلوب المجهر | اوليمبوس | IX70 | |
| Micromanipulators | وLuigs نيومان | أنا SM | |
| Micropipette بولير | Narishige | PP - 830 | |
| رصد | HesaVision | MTB - 01 | |
| مرشحات الكثافة محايدة | أوميغا البصرية | يختلف | |
| الهدف 100X | زايس | Fluar 440285 | اما زايس أو Olympuق |
| الهدف 100X | اوليمبوس | UPLFLN 100XOI2 | اما زايس أو أوليمبوس |
| الضوئية فوق البنفسجية shortpass التصفية | راب الكتروضوئي | SP400 | |
| التصحيح ، المشبك مكبر للصوت | محوار الآلات | Axopatch 200B | |
| الصورة ديود الجمعية | راب الكتروضوئي | المساعد الشخصي الرقمي | |
| الكوارتز ضوء دليل | راب الكتروضوئي | يختلف | نستخدم قطرها 600 ميكرون |
| أسلاك الفضة | العالم آلات دقيقة | AGT1025 | |
| الفضة الأرض بيليه | نذير الصكوك | 64-1309 | |
| قوس مصباح زينون | راب الكتروضوئي | JML - XBL |
| الكاشف | شركة | فهرس العدد |
|---|---|---|
| BCMCM - cAMP في قفص | BioLog | B016 |
| ألبومين المصل البقري (BSA) | سيغما | A8806 |
| CaCl2 القياسية حل 0.1 M | Fluka | 21059 |
| قفص كاليفورنيا : DMNP - EDTA | Invitrogen | D6814 |
| السيستين | سيغما | C9768 |
| كونكانافالين الخامس نوع (كونا) | سيغما | C7275 |
| CSCL | سيغما | C4036 |
| DMSO | سيغما | D8418 |
| أنا الدناز | سيغما | D4527 |
| EDTA | سيغما | E9884 |
| EGTA | سيغما | E4378 |
| جلوكوز | سيغما | G5767 |
| HEPES | سيغما | H3375 |
| بوكل | سيغما | P3911 |
| KOH | سيغما | P1767 |
| Leupeptin | سيغما | L0649 |
| MgCl2 | Fluka | 63020 |
| غراء | سيغما | P3125 |
| بولي - L - يسين | سيغما | P1274 |
| كلوريد الصوديوم | سيغما | S9888 |
| هيدروكسيد الصوديوم | سيغما | S5881 |
| NaPyruvate | سيغما | P2256 |
المراجع
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
- Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
- Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
