مقالة منهجية

المشعة في الموقع التهجين، لتحديد متنوعة أنماط التعبير الجيني في الأنسجة

DOI:

10.3791/3764

⸱

أبريل 27, 2012

 ,  , 
1Howard Hughes Medical Institute, Department of Neurobiology, Duke University , 2Department of Biological Sciences, Hokkaido University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويستخدم بنجاح هذا البروتوكول للكشف عن كميا المستويات والأنماط المكانية التعبير مرنا في أنواع الأنسجة متعددة عبر أنواع الفقاريات. يمكن للطريقة الكشف عن النصوص وفرة منخفضة، وتتيح معالجة مئات من الشرائح في وقت واحد. نقدم هذا البروتوكول باستخدام التنميط التعبير عن الطيور تشكيل المخ الجنينية كمثال على ذلك.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

معرفة توقيت، مستوى، توطين الخلوية، ونوع من الخلايا التي يتم التعبير عن الجينات في يساهم في فهمنا للعمل الجين. ويمكن تحقيق كل هذه الميزات مع التهجين في الموقع لmRNAs داخل الخلايا. هنا نقدم مشعة في طريقة التهجين في الموقع معدلة من كلايتون وآخرون (1988) (1) التي كانت تعمل بنجاح في المختبر لسنوات عديدة، وخاصة بالنسبة للأدمغة الفقاريات الكبار 2-5. منذ فترة طويلة تكميلية الحمض النووي الريبي (كرنا) تحقيقات للتسلسل الذي يسمح للكشف عن الهدف من وفرة النصوص منخفض 6،7. إدماج النيوكليوتيدات المشعة في تحقيقات كرنا يسمح لحساسية الكشف عن مزيد من المحاضر وفرة منخفضة، والتحليل الكمي، إما عن طريق ضوء فيلم الأشعة السينية الحساسة أو مستحلب المغلفة على الأنسجة. هذه طرق الكشف توفير سجل طويل الأمد من التعبير الجيني الهدف. مقارنة مع المنهجيات مسبار غير المشعةالمواد المستنفدة للأوزون، مثل مجموعة دبي للاستثمار ووضع العلامات، وتهجين مسبار المشعة الأسلوب لا يتطلب خطوات التضخيم متعددة باستخدام HRP-الأجسام المضادة و / أو عدة TSA للكشف عن النصوص وفرة منخفضة. لذلك، وهذه الطريقة توفر وجود علاقة خطية بين كثافة إشارة والمبالغ المستهدفة مرنا للتحليل الكمي. لأنها تتيح معالجة 100-200 الشرائح في وقت واحد. كان يعمل بشكل جيد لمراحل النمو المختلفة للأجنة. معظم الدراسات التنموية في التعبير الجيني استخدام الأجنة كلها والنهج غير المشعة 8،9، وذلك جزئيا بسبب الأنسجة الجنينية هي أكثر هشاشة من أنسجة البالغين، مع أقل التماسك بين الخلايا، مما يجعل من الصعب معرفة الحدود الفاصلة بين سكان الخلية مع المقاطع النسيجية. في المقابل، نهجنا المشعة، ونظرا لنطاق أكبر من الحساسية، غير قادرة على الحصول على أعلى تباين في القرار في التعبير الجيني بين المناطق الأنسجة، مما يجعل من الاسهل لمعرفة الحدود الفاصلة بين السكان. باستخدام هذه الطريقة، يمكن للباحثين الكشف عنأهمية ممكن من الجينات التي تم تشخيصها حديثا، وتوقع مزيد من وظائف الجينات في المصالح.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير الأنسجة

  1. حصاد أنسجة جديدة. للأجنة الطيور، وفتح بعناية البيض وتنظيف الجنين في صحن مع 1xPBS، مرتين. لأدمغة البالغين، وإزالة بسرعة الدماغ وغسل بلطف مع PBS × 1.
  2. تضمين الأجنة أو البالغين الى الدماغ العفن جزءا لا يتجزأ من نسيج كامل من أكتوبر تك، ويوجه النسيج حسب الحاجة لباجتزاء، وتجميد بسرعة الكتلة عن طريق وضعها في الإيثانول وجاف خليط الجليد، والحرص على عدم الحصول على خليط من داخل كتلة .
  3. شريحة العينة المجمدة في ناظم البرد إلى أقسام 10-12 ميكرون سميكة. لأنسجة المخ والجنينية، أفضل القطع المعتدلة هو ضمن مجموعة من -18 درجة مئوية إلى -20 درجة مئوية.
  4. تحميل المقاطع المجمدة على شرائح سوبر بلس الزجاج.
  5. تخزين المقاطع في مربع الشرائح على -80 درجة مئوية.

2. جيل من Riboprobes المشعة (استخدم إجراءات السلامة من الإشعاع من مؤسستكم)

  1. إنشاء DN تنقية خطيقالب من [كدنا] اهتمامك إما عن طريق أنزيم هضم محدود من جزء المستنسخة التي تحيط بها مواقع المروج RNA بوليميريز من البلازميد أو بواسطة PCR لإدراج تعلق على مروج مواقع بوليميريز الحمض النووي الريبي ملزمة. ومن الممكن أيضا لتوليد شظايا PCR مع المروجين بوليميريز الحمض النووي الريبي كجزء من (3)، 'و 5' بادئات PCR. تنقية المواد الهلامية الخاصة بك مقيدة أو PCR الشظايا الناتجة مع عدة هلام تنقية GENECLEAN.
  2. إلى أنبوب 0،5 مل إيبندورف، إضافة 0،5-1 ميكروغرام من تنقية خطي قالب الحمض النووي، وعازلة النسخ، DTT، RNasin، AGC حل مزيج النوكليوتيدات، وريبونوكلياز المياه مجانا لتقديم ما يصل الى حجم المبلغ المطلوب. ثم يضاف S 35-UTP وبوليميريز الحمض النووي الريبي المناسبة لجعل إما بواسطة العقاقير أو إحساس riboprobes.
  3. احتضان الخليط لمدة 1 ساعة في حمام ماء C ° 37. إضافة آخر قسامة من بوليميريز الحمض النووي الريبي واحتضان لمدة ساعة 1.
  4. إضافة 3M حل خلات الصوديوم (0.1 أضعاف من الحجم الكلي) و 100 EtOH٪ (2.5 FOدينار من اجمالي حجم) في أنبوب إيبندورف لترسيب الحمض النووي الريبي riboprobe توليفها.
  5. احتضان في الثلج الجاف أو -80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة أو أكثر من 3 ساعات لمساعدة هطول الأمطار.
  6. بيليه RNA بواسطة الطرد المركزي عند 4 درجة مئوية و 15،000 دورة في الدقيقة في جهاز للطرد المركزي إيبندورف فوق المنضدة لمدة 30 دقيقة.
  7. إزالة طاف ويغسل بيليه مع EtOH 70٪، مع الاستفادة من إصبع لخلط بيليه أيضا.
  8. بيليه RNA مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي في 4 درجات مئوية و 15000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
  9. إزالة طاف تماما من قبل pipeting ثم إضافة 40 حل التهجين ميكرولتر. مزيج جيد من قبل pipeting داخل وخارج.
  10. وضع 1 ميكرولتر من الحل إلى 3 حل السلامة، حل مل في مزيج التلألؤ، قارورة جيدا، وقياس التهم في عداد التلألؤ.
  11. وضع إيبندورف مع riboprobe في -20 درجة مئوية للاستخدام في غضون أسبوع واحد.

3. معالجة الأنسجة

  1. في غطاء محرك السيارة، وإعداد برنامج تلفزيوني جديد مخزنة paraformaldehy 4٪دي حل لحوالي 3-5 درجة مئوية فوق درجة حرارة الغرفة. الشرائح في الفترة من -80 درجة مئوية تخزين في رفوف معدنية على الثلج الجاف، والقيام بالعمل الفضاء تحت غطاء محرك السيارة، ثم وضع رف في حل بارافورمالدهيد 4٪، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. تغسل 3 مرات في برنامج تلفزيوني × 1 نحو 15 الانخفاضات كل (حوالي 1 ثانية لكل DIP).
  3. في غطاء محرك السيارة، وجعل العازلة أستلة والتخلص منه بقوة في غضون 10 ثانية. صب مباشرة في علبة تحتوي على رف من الشرائح واحتضان لمدة 10 دقيقة، للحد من خلفية ملزم من riboprobe.
  4. شطف 3 مرات في SSPE × 2 لمدة 15 الانخفاضات.
  5. يذوى في 70٪، 95٪ و 100٪ مسلسل EtOH لمدة 2 دقيقة في كل خطوة (ليس من الضروري أن يكون في غطاء محرك السيارة).
  6. تجف الشرائح تحت غطاء محرك السيارة ما لا يقل عن 10-15 دقيقة.

4. تهجين

  1. حساب كمية من riboprobe (0.5-1 × 10 6 حرف في الدقيقة لكل شريحة) وحل التهجين (100 ميكرو لتر لكل شريحة) اللازمة لكافة الشرائح. قبلتسخين مزيج riboprobe-تهجين إلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتفسد riboprobe.
  2. الماصة 100 ميكرولتر من riboprobe-تهجين حل في خط عبر الشريحة، واستخدام الزجاج ساترة لنشره وتعميمه بالتساوي على الأنسجة وساترة. مكان الشرائح أفقيا، التي تواجه تستقيم في رف معدني ورف مكان تستقيم ببطء إلى 65 درجة مئوية لمدة حمام الزيت ما لا يقل عن 4 ساعات وبحد أقصى 16 ساعة. النفط يخلق ختم محكم حول coverslips.
  3. إزالة رفوف معدنية من حمام الزيت والقضاء على فائض من النفط في جميع أنحاء رف مع المناديل الورقية.
  4. يغسل النفط من الشرائح المشمولة ورف معدني في صواني الزجاج أو المعادن التي تحتوي على الكلوروفورم، مرتين. ويمكن استخدام ال 2 الثانية والكلوروفورم غسيل كأول للتجربة القادمة.
  5. نقل رف مع الشرائح المشمولة في صينية مع 0.1٪ في β-المركابتويثانول + 2 حل SSPE x وتتحرك صعودا وهبوطا لبعض الانخفاضات لتخفيف وإزالة coverslips حل التهجين الزائدة حتىشفويا.
  6. نقل رف مع الشرائح المشمولة في حل الطازجة بنسبة 0.1٪ β-المركابتويثانول + 2 × SSPE، ومن ثم إزالة coverslips مع ملقط ريبونوكلياز الحرة في الحل لمنع الخدش المقاطع النسيجية. نقل الشرائح المكشوف إلى رف جديدة في علبة أفقي الشريحة حامل رف، في حل من 0.1٪ β-المركابتويثانول في SSPE × 2.
  7. احتضان رف مع الشرائح في الطازجة بنسبة 0.1٪ المركابتويثانول-β + 2 × SSPE حل في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة لازالة الزائدة غير منضم RNA التحقيق. تجاهل هذه السابقة وحلول غسيل مائي، وكذلك coverslips، والنفايات المشعة.
  8. نقل رف مع الشرائح في التوصل إلى حل prewarmed SSPE 2X على 65 درجة مئوية، إضافة β-المركابتويثانول إلى النهائي للتركيز 0.1٪، واحتضان في 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. تجاهل مثل النفايات المشعة.
  9. نقل واحتضان رف مع الشرائح مرتين في prewarmed SPPE X 0.1 عند 65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لكل منهما. كمية النشاط الإشعاعي إزالةفي هذه الخطوة صغيرة جدا وأنه لم يعد يعتبر النفايات المشعة المفرطة بعد هذه الخطوة.
  10. يذوى رف والشرائح في 70٪، 95٪ و 100٪ للEtOH 2 دقيقة لكل منهما.
  11. تجفيف الشرائح في غطاء محرك السيارة ما لا يقل عن 30 دقيقة.

5. تصور من الإشارة المشعة

  1. وضع الشرائح الجافة في شريط الفيلم وفي غرفة مظلمة، ووضع فيلم الأشعة السينية (كوداك BioMax MR فيلم) على الشرائح، وأغلق الكاسيت. تأكد من أن الشرائح التي تواجه الجانب مستحلب للفيلم الأشعة السينية. كشف الشرائح للأيام 1-7 ~ اعتمادا على وفرة من المتوقع للمحاضر.
  2. وضع فيلم الأشعة السينية في تطوير مستوى والمثبت. إشارة التهجين كما يظهر أسود (تتعرض الحبوب الفضية في مستحلب) عن فيلم (الشكل 1).
    1. (اختياري) لتحديد قرار الخلوية ويرى إشارة على الأنسجة، والشرائح تحتاج إلى تراجع في مستحلب التصوير الفوتوغرافي وcounterstaineد. إذا كنت تسير على ملون مباين في نهاية المطاف مع البنفسجي cresyl، delipidize ثم المقاطع التي تفرخ في الزيلين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مرتين، ترطيب 1 دقيقة في كل 100٪، 100٪، 95٪، 95٪، 70٪، و 50٪ EtOH وبعد ذلك في ماء منزوع الأيونات. إذا كنت لا ترغب في الذهاب الى وصمة عار مع صبغة التي لا تتطلب delipidization، ثم delipidization ليست ضرورية. الشرائح الجافة بشكل جيد تحت غطاء محرك السيارة ما لا يقل عن 2-3 ساعات.
    2. في غرفة مظلمة باستخدام ضوء آمنة ويستخرج ما يكفي من كوداك مستحلب حظر التجارب النووية لتغطية نصف الشريحة بالطول (أي نسيج) في وعاء زجاجي غمس، ثم تذوب في حمام مائي 42 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة. تمييع ثم بالماء المقطر إلى نسبة 1:1. وينبغي على مستوى مستحلب تغطي الآن جميع المقاطع على شريحة عند تراجع الشريحة في ذلك. إذا كان لديك الكثير من الشرائح، قد تحتاج إلى تحضير مستحلب اضافية.
  4. تراجع الشرائح في مستحلب المخفف في 42 ° C حمام المياه والشرائح انخفض الجافة في ضوء حاوية مغلقة overn ضيقight في غرفة مظلمة، أو في فرن عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعات، مع الأنوار.
  5. نقل الشرائح في فتحات الرفوف في الصناديق السوداء التي تحتوي على desiccators، والحرص على عدم لمس الشرائح بعضها البعض وبالتالي خلق الأعمال الفنية. ختم حواف المربعات مع شريط أسود الكهربائية ببطء لمنع الشرر ضوء ثابت بفعل ثم التفاف مربعات في رقائق الألومنيوم. تخزين صناديق في 4 درجات مئوية من عدة أيام إلى أسابيع (إشارة من 1 يوم في فيلم الأشعة السينية مشابهة لمدة 5 أيام تحت مستحلب).
  6. تسخين صناديق الشرائح إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  7. في غرفة مظلمة، وإزالة رف مع الشرائح (أو الشرائح مكان في رفوف معدنية في حالة استخدام مربعات مع فتحات الشريحة) من مربعات وتطويرها في المطور كوداك D-19 في 16 درجة مئوية لمدة 3.5 دقيقة.
  8. غسل الشرائح المتقدمة في مياه الحنفية في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
  9. احتضان الشرائح مرتين في يتدخل في 19 درجة مئوية لمدة 6 دقائق لكل منهما. ويمكن تشغيل الأضواء عليها خلال حضانة يتدخل ثانية. لى>
  10. غسل الشرائح في المياه الجارية في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة، وتتخلص من مستحلب من الجانب الخلفي من شريحة في حين أن 'الرطب' بشفرة حلاقة لمنع خدش الزجاج.
  11. وصمة عار الأنسجة مع البنفسجي cresyl 0.3٪ في ماء الصنبور لمدة 5 دقائق.
  12. غسل اضافية حل البنفسجي cresyl في ماء الصنبور جديدة لالانخفاضات 15 ~.
  13. يذوى الشرائح عن الانخفاضات 15 ~ في كل حل الكحول: 50٪، 70٪، 95٪، 95٪، 100٪ و 100٪ EtOH.
  14. احتضان الشرائح في الزيلين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة مرتين.
  15. ساترة مع متوسط ​​Permount على الشريحة وتجفيف الشريحة المشمولة في غطاء محرك السيارة بين عشية وضحاها (> 16 ساعة)، وسوف يستغرق عدة أيام قبل الغراء هو قوي بما فيه الكفاية لتنظيف شرائح أخرى.

6. توليد الصور الملونة بمجهر ذي ساحة مظلمة

  1. إذا، من الضروري مواصلة نظيفة مستحلب الزائد على الجزء الخلفي من الشرائح (غير coversliped جانب دون الأنسجة) عن طريق تبليل مع الماء وتجريف بشفرة حلاقة.
  2. شطف شرائح مع حل EtOH 80٪ والقضاء 1-2 مرات بلطف للتخلص من الحطام والغبار.
  3. التقاط الصور تحت الساحة المظلمة أو إضاءة brightfield. قد الخطوات 6.2 و 6.3 يجب أن تتكرر 2-3 مرات من أجل الحصول على صور جيدة من دون جزيئات الغبار، التي ينظر اليها بسهولة في الساحة المظلمة تحت المجهر تشريح.

7. ممثل النتائج

وطريقتان رئيسيتان لمشاهدته في نتائج التهجين في الموقع على أقسام الأنسجة تهجين مع تحقيقات 35 S المشعة: 1) فيلم الأشعة السينية التي تم وضعها فوق الشرائح أو 2) مستحلب التي تم المغلفة على الشرائح. وثمة نهج ثالث هو استخدام شاشة phosphorimager وضعت على الشرائح، ولكن لم يتم ونحن راضون عن قرار من هذا النهج. أفلام الأشعة السينية تقديم نتيجة سريعة وتحليلات للحالة العامة للتهجين. الأشعة السينية بيانات الفيلم يكشف أيضا قرار تشريحية واسعة ويمكن أن تستخدم في الشرج كميysis 10. أمثلة من الصور فيلم الأشعة السينية في وقت متأخر من رؤساء جنين الطيور المهجنة مع تحقيقات العقاقير عن التعبير الجيني FoxP1 وCoupTF2 في 1A أرقام وباء. كل الجينات وفيرة للغاية في تقسيمات محددة في الدماغ. وينبغي أن يكون نتيجة جيدة جودة فيلم الأشعة السينية تكون حادة (لا ضبابية) وتحتوى على نسبة عالية إشارة إلى نسبة خلفية. ويمكن لعدم وضوح الصورة يكون راجعا إلى جهة الاتصال غير المتكافئ بين فيلم الأشعة السينية، وشريحة زجاجية مع النسيج المهجنة.

للشرائح مستحلب انخفض، ومستحلب يحتوي على ضوء أملاح الفضة الحساسة المغلفة على النسيج كما apposed إلى كونه على البلاستيك من فيلم الأشعة السينية. خلال النامية، ويتم تحويل 35-S أملاح الفضة تتعرض لمعدنية من الفضة والحبوب، مثل الكثير في فيلم الأشعة السينية. ومع ذلك، فإن ودائع الفضة مرئية مباشرة على الخلايا التي تمثل التعبير الجيني التي يمكن ملاحظتها وقياسها نوعيا تحت المجهر. الحبوب فضي لامع منع مباشرة مارا ضوءساعة وتظهر النقاط السوداء تحت رأي brightfield. وملون مباين البنفسجي cresyl يظهر اللون الأرجواني في (الشكل 3A، 3C، و 4 الشكل). في الساحة المظلمة، وحبيبات الفضة تعكس الضوء القادمة من جانب، وتبدو كأنها بقع بيضاء (الشكل 1C، 1D، 3B و 3D). في هذه الحالة، البنفسجي cresyl صمة عار يظهر أحمر اللون. في brightfield، في إشارة التهجين هو أسهل لعرض تحت التكبير العالية في قرار الخلوية، في حين أنه في الساحة المظلمة، وبالإضافة إلى ذلك، يمكن النظر إلى إشارة تهجين تحت أدنى التكبير على النسيج كله. وجهة النظر الساحة المظلمة هو النهج الذي عادة ما تستخدم لإظهار نمط التعبير الجيني عموما. ومع ذلك، بالنسبة الى نتيجة سريعة تم الحصول عليها من صور الأشعة السينية، الشرائح مستحلب انخفض يستغرق وقتا أطول وقت (واحد إلى عدة أسابيع)، وأكثر حساسية إلى الحصول على معلومات أساسية.

هناك أربعة مصادر مشتركة من خلفية قوية: 1) الخلفية في جميع أنحاء فيلم الأشعة السينية وعادة ما تفعل تيس مشاكل مع المطور أو يتدخل، أو يتعرض الفيلم جزئيا، 2) الخلفية على الشرائح الزجاجية عادة ما يكون بسبب مشاكل مع إعداد الشريحة أو غسل الزجاج، مثل silination غير لائق من الشرائح من مصدر تجاري أو النفس المعدة؛ 3) تعرض مستحلب والخلفية التنمية؛ و 4) على خلفية مقطع إما بسبب عدم وجود دقيق خطوات الغسيل بعد التهجين، منخفضة للغاية لدرجة الحرارة التهجين، وسوء نوعية الحل تهجين، تلوث بارافورمالدهيد في غسل الصحون تسبب تحقيقات بشكل دائم إلى استجواب تصل إلى الأنسجة، مما يؤدي إلى تدهور riboprobe جزيئات صغيرة وصفها الأنسجة غير محدد، DTT الخاملة أو β-المركابتويثانول مما أدى عبر ربط S 35-RNA تحقيقات في ثنائي كبريتيد السندات إلى الأنسجة، والانتظار وقتا طويلا لأستلة. فمن الأهمية بمكان أن يكون الشرائح في حل أستلة في غضون ثوان من خلط انهيدريد الخل وترايثولامين. إذا تمر عدة دقائق معإضافة إلى حل لهذه الشرائح، وبعد ذلك ستقوم مجموعات الاسيتيل لا يمكن إزالتها بشكل فعال ومن ثم ربط الجيش الملكي النيبالي غير محدد. عوامل أخرى تشمل أكثر من 20 ساعة التهجين، والتي قد تولد قوية جدا من إشارة، وقطرات الزيت الزائد على الشرائح، والتي عزل حل التهجين على الشرائح أثناء غسيل مائي، مما أدى إلى البقع المشعة على الأنسجة والشرائح إشارات خلفية داكنة. إذا العمل مع الشرائح كثيرة (أكثر من 100 شريحة)، إضافة إلى 3 الثالثة كلوروفورم غسل أو تغيير يغسل كلوروفورم، لمنع فائض المعروض النفطي من جزيئات المتبقية على الشرائح. الإهمال علاج الأنسجة، أي ليست تجميد بسرعة كافية (في غضون 5-10 دقيقة بعد تشريح) أو الذوبان وإعادة تجميد يزيد أيضا خلفية بسبب تدهور مرنا. يجب الحرص على عدم الخلط خلفية للتعرض أكثر.

لخلفية مستحلب على الشرائح انخفض من الممكن لأنها خفيفة جدا وحساس ويتطلب طويلة تعرض في الظلام. C مشاكل خلفية ommon تشمل أيضا ارتفاع في درجة الحرارة في المطور والمثبت. عندما تكون درجة الحرارة أعلى من 19 درجة مئوية، قريبة أو أكثر دفئا من درجة حرارة الغرفة، يتم الحصول على مزيد من الحبوب خلفية الفضة. وسوف تعرض لمستويات منخفضة من الضوء يتسرب إلى غرفة مظلمة تسبب خلفية مستحلب. عدم غسل خارج يتدخل لفترة كافية (على الأقل 30 دقيقة في الماء الجاري)، سوف تترك المثبت أن يتفاعل مع اللون البنفسجي ثم cresyl لإنشاء بنية اللون راسب في جميع أنحاء مستحلب. ومع ذلك، إذا تم غسلها الشرائح في الماء أطول من 90 دقيقة بعد تثبيت قبل تلطيخ البنفسجي cresyl، يمكن أن يسبب هذا مستحلب لتصبح فضفاضة والمقاطع إلى وصمة سيئة. إذا لم يكن هناك ما يكفي من الوقت لصبغ الشرائح ضمن إطار 30-90 دقيقة بعد التثبيت والغسيل، وبعد 30 دقيقة غسيل، تجفيف الشرائح بين عشية وضحاها، والمضي قدما مع البنفسجي cresyl تلطيخ في اليوم التالي. عموما، فإن معظم mRNAs محددة لديها أنماط التعبير الجيني، في حين أن إشارة الخلفية هو أكثر اتساقا.

ove_content "> الأنسجة المطوية يمكن أن تكون مضللة من أجل تحقيق النتائج التعبير الجيني في فيلم الأشعة السينية، مما أدى إلى المنطقة مع إشارة أكثر قتامة. لتحديد ما إذا كان يتم طي النسيج، دراسة غير الملطخة أقسام تحت الساحة المظلمة أو أقسام البنفسجي cresyl الملون تحت brightfield. Cresyl counterstaining البنفسجي يوفر طريقة أفضل للنظر في حالة الأنسجة.

للحصول على أفضل تفسير خصوصية التحقيق، ينبغي تطبيق تحقيقات بمعنى السيطرة على أجزاء مجاورة عدة. تحقيقات اكثر احساسا لا تظهر إشارة، ولكن القيام ببعض، وعندما تفعل ذلك، نجد أنه غالبا ما تكون مختلفة عن إشارة العقاقير. ونحن نعتقد أن هذا يمكن أن يعزى إلى تركيب العقاقير أو جين آخر على حبلا بواسطة العقاقير من الجينوم. نقدم مثالا Pax6 معنى وتحقيقات العقاقير (الشكل 2A وباء). حبلا بواسطة العقاقير يكشف عن وصفها على طول منطقة البطين من المخيخ، الدماغ الأمامي والعين كما هو متوقع (الشكل 2A)، ولكن يكشف عن إحساسوصفها في الطبقة الصبغية من الشبكية (الشكل 2B).

لأحجام التحقيق، ونحن نستخدم تحقيقات [كدنا] في أي مكان في مجموعة من 300-5000 نقطة أساس. تحقيقات أقل من 300 نقطة أساس العمل، ولكن إشارات وعادة ما تكون أضعف. أننا لم نحاول تحقيقات أكبر من 5000 بت في الثانية. فمن الأفضل لاستخدام المجسات على أنسجة من نفس النوع إذا كان ذلك ممكنا. إن لم يكن، ونحن العابرة للهجن تحقيقات في أجزاء من الأنواع الأخرى والتقليل من التهجين، وأغسلها في درجات حرارة 3-5 درجة مئوية الزيادات على أساس الهوية تسلسل، إذا كان معروفا. إذا لم يعرف، ثم نقوم التجربة والخطأ التهجين وغسل درجات الحرارة. إذا تم خفض درجة الحرارة كثيرا، ويمكن لجنة التحقيق [كدنا] مع mRNAs غيرها من سلاسل مماثلة في أنحاء الأنواع أو في نفس النوع 11 عبر هجن. في الواقع، نجد أن cDNAs التي هي ~ 95٪ مطابقة أو أكبر من الهدف مرنا في الأنسجة، وتهجين الصارمة ودرجة الحرارة غسيل (65 درجة مئوية) الظروف يعمل بشكل جيد. لمتواليات التي هي في التهاب المفاصل الروماتويديقد nges من ~ 85 إلى 94٪ متطابقة، والتهجين ودرجة الحرارة غسيل يحتاج إلى تخفيض في حدود ~ 50 إلى 60 درجة مئوية

سبب استخدام رف معدني في معظم الخطوات هو استخدام غسول الكلوروفورم والزايلين. على حد سواء العضوية تذوب العديد من أنواع البلاستيك. الزجاج وبعض أنواع البلاستيك المقاومة لهذه العضوية. لكن الزجاج أسهل للكسر، وبعض المواد البلاستيكية التي في البداية مقاومة سوف تذوب خلال فترات طويلة من التعرض للمواد العضوية.

figure-protocol-1
الشكل 1. تصوير الإشعاع الذاتي من الصور التهجين في الموقع من أفلام الأشعة السينية والشرائح مستحلب انخفض. (أ ب) الأشعة السينية الفيلم صورا لسهمي المقاطع رئيس الجامعة للمطربة فينش حمار وحشي في يوم الجنينية 10، تهجين مع riboprobes العقاقير إلى (A) أو FoxP1 CoupTF2 (B)، التي اتخذت مع إضاءة brightfield تحت المجهر تشريح. أسود، والحبوب التي تتعرض لها من فيلم يبين expre مرناssion. شريط مقياس = 500 ميكرون. (CD) انخفض مستحلب الصور الشريحة من سهمي المقاطع رئيس الجامعة للفينش حمار وحشي في يوم آخر يفقس 6، تهجين مع riboprobes العقاقير إلى (C) FoxP1 و (D). CoupTF2، التي اتخذت مع إضاءة الساحة المظلمة تحت المجهر تشريح أبيض، تتعرض حبيبات الفضة في مستحلب فوق الأنسجة يظهر التعبير مرنا. الأحمر والبنفسجي cresyl صمة عار. شريط مقياس = 200 ميكرون. لجميع صور، والمنقار منقاري إلى اليسار. وتعرض هذه الصور فيلم الأشعة السينية ليوم واحد، والشرائح انخفض لمدة 3 أيام. لجنة التحقيق هو 178 نقطة أساس FoxP1 إلى جزء من شركة بريتيش بتروليوم 1544-1711 مرنا؛ CoupTF2 هو 545 نقطة أساس إلى جانب بي بي 1-545 من مرنا. كما يمكن أن يرى، وضمن أثرى مرنا FoxP1 الدماغ المقدم في mesopallium (M)، المخطط (القديس)، والمهاد الظهري (DT)، في حين يتم تخصيب CoupTF2 في nidopallium (N)، arcopallium (A)، والمهاد أكثر بطني . هناك اتساق في التعبير بين أنواع التعرض (والأعمار). مع الشرائح انخفض، ومع ذلك، ينظر إلى وضع العلامات دقة أعلى،ويتم تحديد حدود مباشرة الأنسجة والتقسيمات الفرعية. وجميع هذه الصور الأخرى هو موضح في الورقة هي من المقاطع باستخدام معيار 65 درجة مئوية تهجين صرامة عالية.

figure-protocol-2
الشكل 2. مقارنة بين العقاقير ووضع العلامات بمعنى أنه يبين أنماط مختلفة. (A) وأعرب عن حبلا بواسطة العقاقير من Pax6 في الدماغ، وخصوصا في منطقة البطين (أبيض السهم). أظهرت هو تصوير الإشعاع الذاتي على أفلام الأشعة السينية من سهمي شرائح الرأس كله مأخوذ من فينش حمار وحشي في يوم الجنينية 12. (ب) قسم مجاور تهجين مع حبلا الشعور Pax6 يكشف عن أي خلفية التعبير في جميع أنحاء رأس الجنين، ولكن التعبير واضح في الطبقة الصبغية من الشبكية (الأسهم السوداء) كما حبلا بواسطة العقاقير. على خط متقطع يدل على كفاف من الدماغ كله. C: المخيخ.

figure-protocol-3
< قوي> الشكل 3. في إشارات الموقع في التعبير الجيني في الشرائح مستحلب انخفض المأخوذة من الدماغ فينش حمار وحشي أثناء المراحل الجنينية المتأخرة تحت وجهات النظر وbrightfield الساحة المظلمة. (A) Brightfield صورة التعبير D1B في يوم 10 من الجنينية التعرض العادي للمستحلب. ويمكن تسمية (أسود) بالكاد أن ينظر في هذا التكبير. التحقيق هو 625 نقطة أساس إلى جانب بي بي 1-625 من مرنا. (ب) تحول قسم متطابقة والتكبير كما هو الحال في (A) ولكن وجهة النظر الساحة المظلمة تظهر العلامة (أبيض) في المخطط (القديس)، والمهاد (TH). (C) Brightfield صورة Slit3 التعبير في 12 يوم الجنينية من التعرض لأكثر من مستحلب. ويمكن تسمية (أسود) بسهولة أن ينظر إليها. التحقيق هو 779 نقطة أساس إلى جانب 1243-2021 من مرنا. (ب) تحول قسم متطابقة والتكبير كما في (أ) إلى تسمية الساحة المظلمة رأي يظهر (أبيض) في النخاع الشوكي (SC) الذي يتطابق مع صورة brightfield. منقاري موجه الى اليسار. سي بي: المخيخ.

ad/3764/3764fig4.jpg "ALT =" الشكل 4 "/>
الشكل 4. فضة قرار الحبوب على المستوى الخلوي. أظهرت هو FoxP1 التسمية مرنا في الدماغ المقدم فينش حمار وحشي مع حبيبات الفضة (البقع السوداء) أعلاه الخلايا (اللون البنفسجي cresyl) في مناطق الدماغ المختلفة، والذين تتراوح أعمارهم مقارنة مع صور طاقة أقل من 1A الشكل و1C. (أ) التعبير عن وفرة عالية أكثر من الخلايا الفردية (الأسهم السوداء) في mesopallium الكبار فينش حمار وحشي. (ب) التعبير وفرة على ارتفاع منخفض فوق الخلايا الفردية (النصال أسود) في nidopallium المجاورة من نفس القسم. (ج) ارتفاع التعبير مرنا FoxP1 على الخلايا (الأسهم السوداء) في mesopallium الجنينية 12 يوم. (د) التعبير وفرة على ارتفاع منخفض فوق الخلايا (النصال أسود) في nidopallium المجاورة من نفس القسم. وحلقت الخلايا سبيل المثال مع خط أصفر. الخلايا الجنينية (C و D) هي أصغر حجما وأكثر إحكاما معبأة مقارنة مع الخلايا البالغة (A و B). وحيث أن هناك بعض المساحة بين الخلايا ومستحلب، منطقة معرضةحبيبات الفضة من تحقيق 35 S كبيرة قليلا من منطقة لهيئات الخلية. شريط النطاق = 10 ميكرون.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويستخدم على نطاق واسع المشعة في التهجين الموضعي التعبير مرنا لأغراض متعددة، بما في ذلك لدراسة منظمة إقليمية للنسيج، أنواع الخلايا، ونشاط المخ وظيفية 2-5،10،12-14. لاستخدامها لاحقا على الجينات التي مرنا التعبير في الدماغ تعتمد على زيادة النشاط العصبي، وغالبا ما تسمى الجينات التي تعتمد على نشاط أو الجينات في وقت مبكر على الفور. مع هذه الاستخدامات، وقد تم تطبيق أسلوب لدينا عبر أنواع متعددة، بما في ذلك الطيور والثدييات (مثل الإنسان)، والأسماك، والبرمائيات، في أنسجة متعددة، بما في ذلك الدماغ والجلد والعضلات، والذين تتراوح أعمارهم متعددة، بما في ذلك السلاحف / حديثي الولادة، والأحداث والبالغين، وهنا في الفروع جنين كامل 2،3،5،15-17. السمات الخاصة للبروتوكول لدينا ما يلي: (1) وتنتج توازنا بين خصوصية التشريحية والتحديد الكمي. لقياس التعبير الجيني في فيلم الأشعة السينية، ونحن نأخذ الصور الرقمية من الصور (مثلا:. الشكل 1A و 1B)، استخدم فوtoshop وظيفة الرسم البياني (أدوبي) لقياس كثافة بكسل في مناطق الاهتمام وطرح مستويات أساسية عن فيلم خارج من النسيج ولكن لا يزال على شريحة زجاجية 2،4. لقياس التعبير على المستوى الخلوي، ونحن نأخذ صورا من الحبوب الفضة أكثر من الخلايا تحت التكبير عالية (40 100X؛ الشكل 4). نحن بعد ذلك استخدام عتبة ووظائف مقياس J صورة بواسطة Rasband وين في المعاهد الوطنية للصحة لحساب عدد من الحبوب الفضية في الصورة، وطرح عدد من خلفية في منطقة مماثلة من دون الخلايا على شريحة زجاجية، تقسيم من قبل عدد من الخلايا، للحصول على القيم والتعبير في كل خلية. 4،18 (2) ويمكن أن يكون إنتاجية عالية نسبيا، مما يسمح للتجهيز 100-200 الشرائح في وقت واحد، ونظرا لضيق ختم ساترة التي أنشأتها المعدنية حمام الزيت. معيار طرق التهجين في الموضع يستغرق وقتا أطول لختم الشرائح مع parafilm، طلاء الأظافر، وغيرها من الوسائل، حيث الشرائح يستغرق الكثير من الفضاء، (3) وهي عاليةالحساسة من النصوص وفرة منخفضة نظرا لكبريتات ديكستران وحل دينهارت في المنطقة العازلة تهجين 2،13، (4) ونهج التصوير في الساحة المظلمة يعطي صورا عالية على النقيض من ذلك بسبب التقاط الصور تحت إضاءة الساحة المظلمة على مجهر تشريح 4،5. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يسمح كشف حساسة للتغيرات الصغيرة في التعبير الجيني، مثل في التعبير الجيني التي تعتمد على نشاط لتحديد مناطق محددة في الدماغ تنشط أثناء الإدراك وإنتاج سلوكيات معينة 19. القيود بالنسبة لغير المشعة البروتوكولات هي أن هذا الأخير أكثر وضوحا في القرار الخلوية وموقع مرنا داخل الخلية، والعمل مع مستحلب حساس جدا للتلاعب والضوء. ومن الممكن الجمع بين أسلوب لدينا مع وسائل أخرى، مثل مشعة غير تهجين موضعية لتسمية التعبير مرنا أكثر من جين واحد في نفس النسيج 10،17،20. ويمكن دمجها مع كيمياء سيتولوجية مناعيةلتسمية كل من الحمض النووي الريبي والتعبير بروتين على نفس العينة من أجل المشاركة في توطين ومرنا مع بعض أنواع الخلايا 10. وصفت التعديلات اللازمة لبروتوكول هذه التجارب وضع العلامات المزدوجة في المراجع المشار إليها.

وخلاصة القول، نهجنا يسهل فهم توقيت ومكان الخلوية في التعبير الجيني من أجل فهم تنظيم المنطقة، ونشاط الأنسجة وظيفية، وظيفة الجين.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر جميع أعضاء مختبر جارفيس الذي تحسنت البروتوكول على مر السنين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات
أنهيدريد الأسيتيك VWR MK242002
الكلوروفورم VWR BDH1109
بنفسجية الكريزيل خلات سيغما C5042
ناظم البرد الحرارية العلمية Microm HM550
منزوع الأيونات formamide سيغما F9037
DTT Promega P1171 100mM
EDTA سيغما ED
تضمين قالب VWR 15160-215
فيشر Superfrost العلامة التجارية بالاضافة الى الشريحة فيشر العلمية 22-034-979
الفورمالديهايد VWR BDH0506-4LP
Formamide سيغما F7508
GENECLEAN عدة Q-بيو الجين 1001-200
كوداك BioMax MR فيلم سيغما Z350370
كوداك مستحلب حظر التجارب النووية Carestream الصحة 8895666
كوداك الفنية المطور D19 الة ألتصوير اليدوية 1462593
كوداك المهنية المثبت الة ألتصوير اليدوية 1971746
β-المركابتويثانول Calbiochem 444203
الزيوت المعدنية VWR IC15169491
هيدروكسيد الصوديوم VWR SX0600-1
بارافورمالدهيد سيغما 76240
بولي A إينفيتروجن POLYA.GF
rATP Promega P1132 10MM
rCTP Promega P1142 10MM
rGTP Promega P1152 10MM
RNasin Promega N2111 40Units/μl
S 35 UTP PerkinElmer NEG039C001MC
بالسلامة حل حل سلامة حل للبحوث المنتجات الدولية 111177
أسيتات الصوديوم سيغما S7899 3M
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة سيغما S3264
صوديوم فوسفات أحادى سيغما S3139
SP6رنا بوليميراز Promega P1085
تلطيخ رف معدني علوم المجهر الإلكتروني 70312-54
T7 رنا بوليميراز Promega P2075
الأنسجة تيك أكتوبر ساكورا 4583
5X النسخ العازلة Promega P1181
ترايثولامين VWR IC15216391
تريس، حمض الهيدروكلوريك (1 م، ودرجة الحموضة 8.0) VWR 101449-446
الحمض الريبي النووي النقال روش 10109509001

الحلول:

  1. الكواشف لصنع من riboprobes: 1.5 قالب الحمض النووي ميكروليتر (0،2-0،3 ميكروغرام / ميكرولتر)، 2 ميكرولتر من 5X العازلة نسخ محسنة، 1 ميكرولتر من DTT 100mM (يأتي مع بوليميريز من Promega، مزيججيد في درجة حرارة الغرفة)، 0،3 ميكرولتر من RNasin (40 وحدة / ميكرولتر)، 1.5 ميكرولتر من حل AGC مزيج ريبونوكليوتيد، 3.5 ميكرو لتر من S 35 UTP، و 1 ميكروليتر بوليميريز الحمض النووي الريبي. جلب ما يصل إلى 10 ميكروليتر مع nuclease خالية من المياه.
  2. AGC حل مزيج ريبونوكليوتيد: خلط كميات متساوية من بطولة 10MM، GTP وCTP معا.
  3. الصوديوم محلول خلات لهطول الأمطار EtOH لإزالة الحرة S 35 UTP: 40 ريبونوكلياز ميكرولتر والدناز المياه مجانا، 5 ميكرولتر من خلات الصوديوم 3M، و 125 ميكرولتر من EtOH 100٪.
  4. العازلة التهجين (10ML الأوراق المالية): 5 مل من formamide منزوع الأيونات 100٪، 600 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم 5M، 1M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني = 8.0)، 240 ميكرولتر من EDTA 0.5M (الرقم الهيدروجيني = 8.0)، و 100 ميكرولتر من حل 100X Denhart، و 100 ميكرولتر من DTT 1M، 250 ميكرولتر من الحمض الريبي النووي النقال 20mg/ml، 125 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بولي، و 1 غرام من كبريتات الصوديوم ديكستران. إضافة DEPC المعالجة للمياه لتحقيق الحجم الكلي إلى 10 مل. هزة بقوة ومن ثم احتضان عند 55 درجة مئوية حتى يذوب كل كبريتات الصوديوم ديكستران. تخزين العازلة في تهجين-20 درجة مئوية، وهو أمر جيد لمدة 6 أشهر ~.
  5. مخزنة 4٪ حل لامتصاص العرق: أضف 40 غ من امتصاص العرق في 760 مل من الماء المقطر في دورق المخصصة لامتصاص العرق، والحرارة إلى 50 درجة مئوية على طبق ساخن مع التحريك. إضافة 320 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 10N للمساعدة في حل لامتصاص العرق. بعد حل (~ 10 دقيقة)، إضافة 100 مل من برنامج تلفزيوني 10X، وتحقيق رفع مستوى الصوت مع الماء المقطر حتى 1 لتر. إثارة وتسخين حل حتى يذوب لامتصاص العرق. وينبغي أن يكون الرقم الهيدروجيني 7.4.
  6. العازلة أستلة: 13.6 مل من ترايثولامين زائد 2.52 مل من أنهيدريد الخل في 1 لتر من الماء المقطر.
  7. 20X SSPE الحل: 3M كلوريد الصوديوم، و 200 ملي ناه 2 PO 4-H 2 O، و 200 ملي EDTA في الماء المقطر. ضبط درجة الحموضة إلى حل مع هيدروكسيد الصوديوم 7.4 10N.
  8. 10X PBS العازلة: 80G من كلوريد الصوديوم، 2.0g من بوكل، 14.4g من نا 2 هبو 4، و 2.4G من KH 2 PO 4 في الماء المقطر. ضبط حل إلى 7.0 درجة الحموضة وجلب الحجم الإجمالي إلى 1 لايتص.
  9. الثانية حل غسيل: 0.1٪ β-المركابتويثانول وformamide 50٪ في SSPE 2X
  10. Cresyl حل خلات البنفسجي: 3٪ خلات البنفسجي cresyl في ماء الصنبور (الماء المقطر يمنع تلطيخ جيد)، حل بين عشية وضحاها مع التحريك في قارورة في درجة حرارة الغرفة. تصفية مع شفط فراغ من خلال ورقة 1MM مرشح Whatman وقمع بوخنر.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Clayton, D. F., Huecas, M. E., Sinclair-Thompson, E. Y., Nastiuk, K. L., Nottebohm, F. Probes for rare mRNAs reveal distributed cell subsets in canary brain. Neuron. 1, 249-261 (1988).
  2. Wada, K., Sakaguchi, H., Jarvis, E. D., Hagiwara, M. Differential expression of glutamate receptors in avian neural pathways for learned vocalization. J. Comp. Neurol. 476, 44-64 (2004).
  3. Haesler, S. FoxP2 expression in avian vocal learners and non-learners. J. Neurosci. 24, 3164-3175 (2004).
  4. Jarvis, E. D., Nottebohm, F. Motor-driven gene expression. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 4097-4102 (1997).
  5. Holzenberger, M. Selective expression of insulin-like growth factor II in the songbird brain. J. Neurosci. 17, 6974-6987 (1997).
  6. Mahmood, R., Mason, I. In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections. Methods Mol. Biol. 461, 675-686 (2008).
  7. Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. Detection of messenger RNA by in situ hybridization to tissue sections and whole mounts. Methods Enzymol. 225, 361-373 (1993).
  8. Acloque, H., Wilkinson, D. G., Nieto, M. A. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole-mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 87, 169-185 (2008).
  9. Moorman, A. F., Houweling, A. C., de Boer, P. A., Christoffels, V. M. Sensitive nonradioactive detection of mRNA in tissue sections: novel application of the whole-mount in situ hybridization protocol. J. Histochem. Cytochem. 49, 1-8 (2001).
  10. Horita, H., Wada, K., Rivas, M. V., Hara, E., Jarvis, E. D. The dusp1 immediate early gene is regulated by natural stimuli predominantly in sensory input neurons. J. Comp. Neurol. 518, 2873-2901 (2010).
  11. Braissant, O., Wahli, W. A simplified in situ hybridization protocol using non-radioactively labelled probes to detect abundant and rare mRNAs on tissue sections. Biochemica. 1, 10-16 (1998).
  12. Kubikova, L., Wada, K., Jarvis, E. D. Dopamine receptors in a songbird brain. J. Comp. Neurol. 518, 741-769 (2010).
  13. Wada, K. A molecular neuroethological approach for identifying and characterizing a cascade of behaviorally regulated genes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 15212-15217 (2006).
  14. Jarvis, E. D. Avian brains and a new understanding of vertebrate brain evolution. Nat. Rev. Neurosci. 6, 151-159 (2005).
  15. Hoke, K. L., Ryan, M. J., Wilczynski, W. Social cues shift functional connectivity in the hypothalamus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 10712-10717 (2005).
  16. Burmeister, S. S., Jarvis, E. D., Fernald, R. D. Rapid behavioral and genomic responses to social opportunity. PLoS. Biol. 3, e363(2005).
  17. Jarvis, E. D., Schwabl, H., Ribeiro, S., Mello, C. V. Brain gene regulation by territorial singing behavior in freely ranging songbirds. Neuroreport. 8, 2073-2077 (1997).
  18. Jarvis, E. D., Scharff, C., Grossman, M. R., Ramos, J. A., Nottebohm, F. For whom the bird sings: context-dependent gene expression. Neuron. 21, 775-788 (1998).
  19. Feenders, G. Molecular mapping of movement-associated areas in the avian brain: a motor theory for vocal learning origin. PLoS One. 3, e1768(2008).
  20. Chen, C. C., Fernald, R. D. Distributions of two gonadotropin-releasing hormone receptor types in a cichlid fish suggest functional specialization. J. Comp. Neurol. 495, 314-323 (2006).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة