مقالة منهجية

كيميائيا سدت [ميكروأري] لتحديد ملامح عالية الإنتاجية من تعدد في الإرسال ارتباط بالغليكوزيل بروتين معين في عينات مجمع

DOI:

10.3791/3791

⸱

مايو 4, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Hepatitis and Virus Research, 2Department of Microbiology and Immunology, Thomas Jefferson University, 3Drexel University College of Medicine, 4Van Andel Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، فإننا وصف بروتوكول محسن لميكروأري المضاعفة الأجسام المضادة عالية الإنتاجية مع طريقة كشف كتين التي يمكن استخدامها في التنميط ارتباط بالغليكوزيل من بروتينات محددة. يتميز هذا البروتوكول الكواشف موثوق جديدة ويخفف كثيرا من الوقت والتكلفة، ومتطلبات معدات مختبر بالمقارنة مع الإجراء السابق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف في هذه الدراسة بروتوكولاً فعالاً للاستخدام في مصفوفة أجسام مضادة مجهرية عالية الإنتاجية ومتعددة الإشارات مع الكشف عن البروتينات الرابطة للجليكان، مما يسمح بتحديد ملف الجليكوزيلة لبروتينات محددة. تعد جليكوزيلة البروتينات التعديل الأكثر انتشاراً بعد الترجمة في البروتينات، وتؤدي إلى تعديلات متنوعة في الخصائص الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية للبروتينات. ونظراً لأن آلية الجليكوزيلة تكون عرضة بشكل خاص لتطور المرض والتحول الخبيث، فقد تم التعرف على الجليكوزيلة الشاذة كعلامات بيولوجية للكشف المبكر عن السرطان وأمراض أخرى. ومع ذلك، فإن الطرق الحالية لدراسة جليكوزيلة البروتينات عادة ما تكون معقدة للغاية أو مكلفة للاستخدام في معظم المختبرات العادية أو الإعدادات السريرية، لذا تبرز الحاجة إلى طريقة أكثر عملية لدراسة جليكوزيلة البروتينات. يستخدم البروتوكول الجديد الموصوف في هذه الدراسة مصفوفة أجسام مضادة مجهرية محجوبة كيميائياً مع الكشف عن البروتينات الرابطة للجليكان (GBP)، مما يقلل بشكل كبير من الوقت والتكلفة ومتطلبات المعدات المختبرية اللازمة لدراسة جليكوزيلة البروتينات. في هذه الطريقة، يتم طباعة أجسام مضادة متعددة ومثبتة ومحددة للبروتينات السكرية مباشرة على شرائح المصفوفة المجهرية، ويتم حجب ن-جليكانات (N-glycans) الموجودة على الأجسام المضادة. وتكون هذه الأجسام المضادة المحددة للبروتينات السكرية والمثبتة والمحجوبة قادرة على التقاط وعزل البروتينات السكرية من عينة معقدة يتم وضعها مباشرة على شرائح المصفوفة المجهرية. بعد ذلك، يمكن إجراء الكشف عن الجليكان عن طريق إضافة الليكتينات المبيوتينية (biotinylated lectins) والبروتينات الرابطة للجليكان الأخرى إلى شريحة المصفوفة المجهرية، بينما يمكن تحديد مستويات الارتباط باستخدام Dylight 549-Streptavidin. ومن خلال استخدام لوحة أجسام مضادة والفحص باستخدام ليكتينات مبيوتينية متعددة، تسمح هذه الطريقة بتطوير ملف جليكوزيلة فعال لمختلف البروتينات الموجودة في عينة بشرية أو حيوانية معينة.

مقدمة

تعد عملية غلكزة البروتين (Glycosylation)، وهي التعديل الأكثر انتشاراً بعد الترجمة على البروتينات، وسيلة لتعديل الخصائص الفيزيائية والكيميائية والبيولوجية للبروتين، وتلعب دوراً أساسياً في مختلف العمليات البيولوجية1-6. ونظراً لأن آلية الغلكزة تكون عرضة بشكل خاص لتطور المرض والتحول الخبيث، فقد تم التعرف على الغلكزة الشاذة كعلامات بيولوجية للكشف المبكر عن السرطان وأمراض أخرى 7-12. وفي الواقع، فإن معظم العلامات البيولوجية الحالية للسرطان، مثل جزء L3 من α-1 fetoprotein (AFP) لسرطان الخلايا الكبدية 13-15، وCA199 لسرطان البنكرياس 16, 17، هي جميعها أجزاء غليكان شاذة على البروتينات السكرية. ومع ذلك، فإن طرق دراسة غلكزة البروتين كانت معقدة وغير مناسبة للاستخدام الروتيني في المختبرات والإعدادات السريرية. وقد ابتكر Chen et al. مؤخراً مصفوفة ميكروية من الأجسام المضادة المحجوبة كيميائياً مع طريقة كشف عن البروتين الرابط للغليكان (GBP) لتحليل غلكزة البروتينات السكرية الأصلية في عينة معقدة بشكل عالي الإنتاجية ومتعدد الإشارات 18. في هذه الطريقة القائمة على المصفوفة الميكروية ذات الألفة، تقوم أجسام مضادة متعددة ومثبتة متخصصة في البروتينات السكرية بالتقاط وعزل البروتينات السكرية من الخليط المعقد مباشرة على شريحة المصفوفة الميكروية، ثم يتم قياس الغليكانات الموجودة على كل بروتين ملتقط بشكل فردي بواسطة GBPs. وبما أن جميع الأجسام المضادة العادية تحتوي على N-glycans يمكن التعرف عليها بواسطة معظم GBPs، فإن الخطوة الحاسمة في هذه الطريقة هي حجب الغليكانات الموجودة على الأجسام المضادة كيميائياً لمنعها من الارتباط بـ GBP. وفي هذا الإجراء، تم أولاً أكسدة مجموعات cis-diol للغليكانات الموجودة على الأجسام المضادة لتحويلها إلى مجموعات ألدهيد باستخدام NaIO4 في محلول صوديوم أسيتات المنظم مع تجنب الضوء. ثم تم ربط مجموعات الألدهيد بمجموعة الهيدرازيد لرابط متقاطع، وهو 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH)، يليه ربط ببتيد ثنائي، Cys-Gly، بمجموعة maleimide الخاصة بـ MPBH. وبذلك، تم تحويل مجموعات cis-diol الموجودة على غليكانات الأجسام المضادة إلى مجموعات ضخمة غير هيدروكسيلية، مما أعاق ارتباط الليكتينات وGBPs الأخرى بالأجسام المضادة الملتقطة. هذا الإجراء الحجبي يجعل GBPs والليكتينات ترتبط فقط بغليكانات البروتينات الملتقطة. وبعد هذا الحجب الكيميائي، تم تحضين عينات المصل مع المصفوفة الميكروية للأجسام المضادة، تلا ذلك الكشف عن الغليكانات باستخدام ليكتينات وGBPs مختلفة وموسومة بالبيوتين، وتم التصوير باستخدام Cy3-streptavidin. إن الاستخدام المتوازي لمجموعة من الأجسام المضادة وسبر متعدد بالليكتينات يوفر ملفات غلكزة منفصلة لبروتينات متعددة في عينة معينة 18-20. وقد استُخدمت هذه الطريقة بنجاح في مختبرات متعددة ومختلفة 1, 7, 13, 19-31. ومع ذلك، فإن استقرار MPBH وCys-Gly، والإجراء المعقد والمطول في هذه الطريقة يؤثر على قابلية تكرار الطريقة وفعاليتها وكفاءتها. في هذا البروتوكول الجديد، استبدلنا كلاً من MPBH وCys-Gly بكاشف واحد أكثر استقراراً وهو glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide)، مما أدى إلى تحسين قابلية تكرار الطريقة بشكل كبير، وتبسيط وتقصير الإجراء بأكمله بحيث يمكن إكماله في غضون يوم عمل واحد. وفي هذا البروتوكول الجديد، نصف الإجراء التفصيلي للبروتوكول الذي يمكن اعتماده بسهولة من قبل المختبرات العادية لدراسة غلكزة البروتين الروتينية والتقنيات الضرورية للحصول على نتائج قابلة للتكرار والReproducibility.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. طباعة جسم [ميكروأري] لفحص

  1. تمييع كل الأجسام المضادة إلى 0.5 ملغ / مل في المياه المالحة العازلة الفوسفات ودرجة الحموضة 7.2 (PBS).
  2. قسامة 40 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة في لوحة مصدر 384 أيضا.
  3. تحميل لوحة مصدر جيد على 384 من Scienion microarrayer sciFLEXARRAYER.
  4. تحميل 20 الشرائح ميكروأري PATH على هذا microarrayer هدفا.
  5. تعيين microarrayer لطبا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بروتين الهدف والتقاط اختيار الأضداد

قبل فحص الجسم المضاد ميكروأري، وهناك حاجة إلى بعض الكواشف والمواد التي سينظر فيها، وأعد. وينبغي لتصميم جسم [ميكروأري] لتحديد ملامح غليكان أو غليكان فحص العلامات البيولوجية، وفريق من الاجسام المضادة المحددة للمرشحين بروتين سكري يتم تحديدها وفقا للأدب أو من النتائج السابقة. تم شراؤها عادة هذه الأجسام المضادة من مختلف البائعين، مثل البحث والتطوير الجماعات الحكومية الدولية وما إلى .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل معهد أبحاث التهاب الكبد الوبائي وفيروس.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
معرف اسم كاشف الاختصار شركة كتالوج #
L1 المعقدة البيروكسيديز كونكانافالين A كونا ناقلات مختبرات BK-1000
L2 المعقدة البيروكسيديز كتين خمان؛ بلسان أسود SNA ناقلات مختبرات B-1305
L3 عدسة المعقدة البيروكسيديز Culinaris الملزن LCA ناقلات مختبرات BK-2000
L4 المعقدة البيروكسيديز الخروع COMMUNIS الملزن أنا RCA ناقلات مختبرات BK-1000
L5 المعقدة البيروكسيديز كتين Aleuria برتقالية AAL ناقلات مختبرات B-1395
L6 المعقدة البيروكسيديز كتين الحمرية Cristagalli أطلق بيت التمويل الخليجي ناقلات مختبرات BK-3000
L7 المعقدة البيروكسيديز غريفونيا كتين Simplicifolia (Bandeiraea) الثاني GSL الثاني ناقلات مختبرات BK-3000
L8 المعقدة البيروكسيديز القمح الجرثومي الملزن WGA ناقلات مختبرات BK-1000
L9 المعقدة البيروكسيديز Erythroagglutinin الشائع فاصيلوس PHA-E ناقلات مختبرات BK-2000
L10 المعقدة البيروكسيديز Leucoagglutinin الشائع فاصيلوس PHA-L ناقلات مختبرات BK-2000
L11 المعقدة البيروكسيديز الفول السوداني الملزن السلطة الوطنية الفلسطينية ناقلات مختبرات BK-1000
L12 المعقدة البيروكسيديز بيسوم Pisum الملزن PSA ناقلات مختبرات BK-2000
L13 المعقدة البيروكسيديز Dolichos Biflorus الملزن DBA ناقلات مختبرات BK-1000
L14 المعقدة البيروكسيديز كتين جوز ماثل DSL ناقلات مختبرات BK-3000
L15 المعقدة البيروكسيديز الصفيراء الملزن تفرضه اليابان SJA ناقلات مختبرات BK-2000
L16 فول الصويا المعقدة البيروكسيديز الملزن SBA ناقلات مختبرات BK-1000
L17 المعقدة البيروكسيديز بطاطس (بطاطا) يكتين المحكمة الخاصة بلبنان ناقلات مختبرات BK-3000
L18 غريفونيا المعقدة البيروكسيديز (باندeiraea) Simplicifolia كتين أنا GSL أنا ناقلات مختبرات BK-2000
L19 المعقدة البيروكسيديز كتين بيقية Villosa VVL ناقلات مختبرات BK-2000
L20 المعقدة البيروكسيديز اسكولينتوم (الطماطم) يكتين حد الانفجار الأدنى ناقلات مختبرات BK-3000
L21 Ulex المعقدة البيروكسيديز Europaeus الملزن أنا أنا UEA ناقلات مختبرات BK-1000
L22 المعقدة البيروكسيديز Jacalin JACALIN ناقلات مختبرات BK-3000
A1 F عنزة ('أ ب) 2 قطعة مضادة للالغلوبولين المناعي البشري، الأجسام المضادة Fc5μ الغلوبولين المناعي جاكسون المناعي للبحوث 109-006-129
A2 حمار F ('أ ب) 2 فرج المضادة للمفتش الإنسان (H + L) 1tibody AB1 جاكسون المناعي للبحوث 709-006-149
A3 الماوس المضادة للمفتش الإنسان F ('أ ب) 2 ريتوكسيماب AB3 جاكسون المناعي للبحوث 209-005-097
A4 الماعز المضادة للجسم البشري ألفا macroglobulin 2 بولكلونل A2M GeneTex GTX62924
A5 أرنب المضادة للبشرية ألفا-1-انتيتريبسين الجسم المضاد بولكلونل A1AT لي Biosiences CA1T-80A
A6 الماوس المضادة للبشرية ألفا-1-انتيتريبسين ريتوكسيماب A1AT سيجما ألدريتش SAB4200198
A7 أرنب المضادة للبشرية ألفا-1-انتيتريبسين الجسم المضاد بولكلونل تحرك NeoMarkers RB-367-A1
A8 أرنب المضادة للبشريةألفا-1-antichymotrypsin الجسم المضاد بولكلونل تحرك فيشر العلمية RB9213R7
A9 جسم الفأر ترانسفيرين المناهضة للبشرية وحيدة النسيلة ترانسفيرين GeneTex GTX101035
A10 أرنب الضد ترانسفيرين المضادة للبشرية بولكلونل ترانسفيرين GeneTex GTX77130
A11 الماعز المضادة للجسم البشري J ئي بولكلونل ApoJ Abcam ab7610
A12 الماوس المضادة للبشرية GP73 ريتوكسيماب GP73 أبوت 14H4-23
A13 الماوس المضادة للبشرية GP73 ريتوكسيماب GP73 سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية المؤتمر الوطني العراقي SC-101275
A14 أرنب المضادة للبشرية ألفا-1 fetoprotein الجسم المضاد بولكلونل ا ف ب GenWay GWB-41C966
A15 الماوس المضادة للبشرية ألفا-1 بروتين جنيني ريتوكسيماب ا ف ب فيتزجيرالد 10-A05A
A16 جسم الفأر هيموبيكسين المناهضة للبشرية وحيدة النسيلة هيموبيكسين Assaypro 60190-05011
A17 الماوس المضادة للبشرية glypican-3 (1G12) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة GPL3 سانتا كروز بيو SC-65443
A18 الماوس المضادة للمولد الكاينين ​​الإنسان (LMW) الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مولد الكاينين Assaypro 20333-05011
A19 أرنب المضادة للبشرية MMP-21 ضد وحيد النسيلة MMP21 Epitomic 1955-1
A20 الماوس المضادة للبشرية CEACAM الأضداد وحيدة النسيلة-1ذ CEACAM R & D أنظمة MAB1180
A21 الفئران المضادة للبشرية DPPIV/CD26 ريتوكسيماب DPPIV R & D أنظمة MAB22441
A22 ماوس لمكافحة الأجسام المضادة البشرية وحيدة النسيلة الثاني PIVKA PIVICA الكريستال الكيميائي 8040
A23 الماوس المضادة للمستضد سرطاني مضغي CEA الولايات المتحدة البيولوجية C1300
A24 مستضد الماوس المضادة للسرطان CA125 CA125 الولايات المتحدة البيولوجية C0050-01D
A25 ماوس لمكافحة السرطان CA19-9 مستضد CA19-9 الولايات المتحدة البيولوجية C0075-18
A26 جسم الفأر X المضادة لللويس وحيدة النسيلة لويس العاشر Calbiochem 434631
الحيوي جيش صرب البوسنة المعقدة البيروكسيديز (مراقبة إيجابية) الحيوي محلية الصنع N / A

الجدول رقم 1. قائمة من الليستين والأجسام المضادة المستخدمة في هذا البروتوكول.

اسم المعدات / الكاشف ق شركة فهرس العدد
غير اتصال microarrayer BioDot المؤتمر الوطني العراقي sciFLEXARRAYER
384 microplate الصياد 14-230-243
FoodSaver FoodSaver V3835
سامسونج النيتروسليلوز coate ميكروأري الشرائح Gentel PATH
الشريحة Imprinter (اختياري) الجل الشركة WSP60-1
شاكر الصياد 15-453-211
نبذ إيبندورف 5804 000.013
الشريحة غسيل صحن تلطيخ حوض / الشرائح مع الرف القابل للإزالة الصياد 08-812
الشريحة مربع حضانة الشريحة غرفة / مجهر الصياد 03-448-5
بريج 35، 30٪ حل ث / ت في المياه العضوية Acros AC32958-0025
توين-20 الصياد P337-100
الصوديوم بريودات (NaIO 4) سيغما 311448
L-حمض الغلوتاميك γ-هيدرازيد سيغما G-7257
خلات الصوديوم اللامائية (CH 3 COONa) سيغما S2889
البقري ألبومين المصل (BSA) Lampire مختبرات البيولوجي 7500804
المؤسسة العامة لتحلية الفوسفات عازلة (PBS) (10X) Denville العلمية CP4390-48
Dylight 549 NeutrAvidin مترافق الحرارية 22837
أقراص البروتيني مانع كوكتيل روش 4693159001
ChromPure الإنسان مفتش الحكومة، FC شظية جاكسون Immunoresearch 009-000-008
ChromPure الإنسان مفتش الحكومة، كل جزيء جاكسون Immunoresearch 009-000-003
ChromPure الفأر مفتش الحكومة، كل جزيء جاكسون Immunoresearch 015-000-003
ChromPure الفأر مفتش الحكومة، FC شظية جاكسون Immunoresearch 015-000-008
ChromPure أرنب مفتش الحكومة، كل جزيء جاكسون Immunoresearch 011-000-003
ChromPure حمار مفتش الحكومة، كل جزيء جاكسون Immunoresearch 017-000-003
[ميكروأري] ماسحة Tecan معاد تحميل LS

الجدول 2. قائمة من المعدات والكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fang, M. The ER UDPase ENTPD5 promotes protein N-glycosylation, the Warburg effect, and proliferation in the PTEN pathway. Cell. 143, 711-724 (2010).
  2. Marino, K., Bones, J., Kattla, J. J., Rudd, P. M. A systematic approach to....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة