الكمية بوليميريز سلسلة من ردود الفعل في الوقت الحقيقي (qPCR) هو وسيلة سريعة وحساسة للتحقيق في مستويات التعبير عن مختلف microRNA (ميرنا) الجزيئات في عينات الورم. ويمكن استخدام هذا التعبير أسلوب مئات من جزيئات ميرنا مختلفة يتم تضخيمها، كميا، وتحليلها من القالب نفسه [كدنا].
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف microRNA في أورام البروستات بواسطة PCR الوقت الحقيقي الكمية (qPCR)
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تُعد جزيئات الميكرو آر إن إيه (miRNAs) جزيئات حمض ريبي نووي (RNA) غير مشفرة، أحادية السلسلة، ويتراوح طولها بين 18 و24 نوكليوتيد. وهي تشارك في جميع العمليات الخلوية تقريباً، بما في ذلك النمو1، والموت الخلوي المبرمج (apoptosis)2، وتنظيم الدورة الخلوية3. وتُشير التقديرات إلى أن جزيئات miRNAs تنظم تعبير 30% إلى 90% من الجينات البشرية4 عن طريق الارتباط بجزيئات الحمض الريبي النووي المرسال (mRNAs) المستهدفة5. وقد تم الإبلاغ عن خلل واسع النطاق في تنظيم miRNAs في أمراض وأنواع فرعية مختلفة من السرطان6. ونظراً لانتشارها وبنيتها الفريدة، فمن المرجح أن تمثل هذه الجزيئات الصغيرة الجيل القادم من المؤشرات الحيوية، أو العوامل العلاجية، و/أو الأهداف الدوائية.
تشمل الطرق المستخدمة لاستقصاء تعبير miRNA تقنية qPCR القائمة على صبغة SYBR green I وكذلك التقنية القائمة على مسبار Taqman. ولكي تُستخدم miRNAs بفعالية في السياق السريري، فمن الضروري أن يكون الكشف عنها في العينات السريرية الطازجة و/أو المؤرشفة دقيقاً، وقابلاً للتكرار، ونوعياً. وقد استُخدمت تقنية qPCR على نطاق واسع للتحقق من تعبير miRNAs في تحليلات الجينوم الكامل مثل دراسات المصفوفات الدقيقة (microarray)7. كانت العينات المستخدمة في هذا البروتوكول من مرضى خضعوا لاستئصال جذري للبروستاتا لعلاج سرطان البروستاتا الموضعي سريرياً؛ ومع ذلك، يمكن استبدالها بأنسجة وخطوط خلوية أخرى. وقد تم تجميد عينات البروستاتا تجميداً سريعاً في النيتروجين السائل بعد الاستئصال. كما جُمعت المتغيرات السريرية ومعلومات المتابعة لكل مريض لإجراء التحليلات اللاحقة8.
تحديد كمية مستويات miRNA في عينات أورام البروستاتا. تتمثل الخطوات الرئيسية في تحليل qPCR للأورام فيما يلي: استخلاص RNA الكلي، وتخليق cDNA، والكشف عن نواتج qPCR باستخدام بادئات متخصصة لـ miRNA. تم استخلاص RNA الكلي، والذي يشمل mRNA و miRNA وأنواعًا أخرى من RNAs الصغيرة، من العينات باستخدام كاشف TRIzol. واستُخدم نظام miScript من شركة Qiagen لتخليق cDNA وإجراء qPCR (الشكل 1). ونظرًا لأن miRNAs الداخلية ليست مضافًا إليها عديد الأدينيلات (polyadenylated)، فإن إنزيم poly(A) polymerase يقوم بإضافة ذيول عديد الأدينيلات إلى miRNA خلال عملية النسخ العكسي. ويُستخدم miRNA كقالب لتخليق cDNA باستخدام oligo-dT وإنزيم Reverse Transcriptase. وتسهل تسلسلات الوسم الشاملة (universal tag) الموجودة على الطرف '5 لبادئات oligo-dT عملية تضخيم cDNA في خطوة PCR. ويتم الكشف عن تضخيم ناتج PCR من خلال مستوى الفلورة المنبعثة من SYBR Green، وهو صبغ يتخلل الحمض النووي DNA مزدوج الخيوط. وتقوم بادئات miRNA المتخصصة، جنباً إلى جنب مع بادئ شامل (Universal Primer) يرتبط بتسلسل الوسم الشامل، بتضخيم تسلسلات miRNA محددة.
تتوفر مقاييس بادئات miScript لأكثر من ألف من جزيئات miRNA الخاصة بالبشر، ومئات من جزيئات miRNA الخاصة بالفئران. وقد استُخدمت طريقة الكمية النسبية هنا لقياس مستوى تعبير جزيئات miRNA. ولتصحيح التباين بين العينات المختلفة، يتم ضبط مستويات تعبير miRNA المستهدف وفقًا لمستويات تعبير جين مرجعي. ويعد اختيار الجين الذي يتم بناءً عليه ضبط تعبير الأهداف أمرًا بالغ الأهمية في طريقة التحليل بالكمية النسبية. ومن الأمثلة على الجينات المرجعية المستخدمة عادةً في هذا السياق جزيئات RNA الصغيرة RNU6B وRNU44 وRNU48، حيث تُعتبر مستقرة التعبير في معظم العينات. وفي هذا البروتوكول، استُخدم RNU6B كجين مرجعي.
البروتوكول
1. البروستاتا جمع العينات
- جمع عينات من البروستاتا في وقت استئصال البروستاتا. توجه العينة باستخدام معالم التشريحية. ورسمت على البروستاتا والحويصلات المنوية على النحو التالي: حق أخضر الجانب، جانب اليسار الزرقاء.
- يتم أخذ القسم الوسطي عشوائية عرضية من البروستاتا عمودي على سطح المستقيم، مجمدة في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية 9.
- شرائح من العينات المخزنة المصورة، الموجهة (الأمامية، الخلفية، اليمين واليسار)، quadris....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وقد تم التعبير عن الشاذة من بعض miRNAs وجدت على الدوام في أورام البروستات بالمقارنة مع الأنسجة الطبيعية 10، والذين وردت أسماؤهم بعض هذه miRNAs كعوامل محتملة علاجية جديدة ضد سرطان البروستاتا 11. لذلك نجد أن مستويات التعبير المنحرف من miRNAs تكون مفيدة المؤشرات الحيوية التشخيصية و / أو النذير. منهجية qPCR في الوقت الحقيقي المقدمة هنا يقدم فحص دقيق لتقدير مستويات ميرنا في أنسجة ورم البروستات. لا يمكن للنظام PCR miScript تستخدم لكشف الاختلافات بين النوكليوتيدات و.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الكندي لابحاث السرطان في المجتمع، لا تمنح. 019038.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | |
| TRIzol الكاشف | إينفيتروجن | 15596 | |
| miScript كيت النسخ العكسي | QIAGEN | 218061 | |
| فحوصات التمهيدي miScript | QIAGEN | تجربة محددة | |
| miScript SYBR الأخضر PCR كيت | QIAGEN | 218073 | |
| LightCycler 3.5 نظام PCR في الوقت الحقيقي | روش | ||
| ضوء Cycler الأوعية الشعرية | روش | 04929292001 | |
| NanoDrop 1000 طيفي | الحرارية العلمية | 2538 | |
| اجيلنت 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
المراجع
- Reinhart, B. J. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).
- Xu, P. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr. Biol. 13, 790(2003).
- Bueno, M. J., Perez, deC. astro, I,, Malumbres, M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
