تحليل التطبع الخلوي من الجزيئات الدقيقة والبكتيريا التي متعددة الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Summary

في هذه المقالة، نحن وصف طريقة استخدام متعددة الأطياف التدفق الخلوي التصوير لقياس استيعاب النانوية polyanhydride أو البكتيريا بواسطة الخلايا 264.7 الخام.

Abstract

ظهرت نظم الجسيمات النانوية وأدوات قيمة في مجال تقديم اللقاحات من خلال قدرتها على تحقيق كفاءة البضائع، بما في ذلك البروتينات، إلى الخلايا مستضد تقديم ^1-5. تدخيل النانوية (NP) بواسطة الخلايا مستضد تقديم هو خطوة حاسمة في توليد استجابة فعالة المناعي للمستضد مغلفة. لتحديد كيف يمكن للتغييرات في صياغة جسيمات متناهية الصغر وظيفة الأثر، وسعينا لتطوير إنتاجية عالية، بروتوكول تجريبي الكمية التي كانت متوافقة مع الكشف عن الجسيمات النانوية المنضوية فضلا عن البكتيريا. حتى الآن، وكانت اثنين من التقنيات مستقلة، المجهري والتدفق الخلوي، والأساليب المستخدمة في دراسة البلعمة النانوية. طبيعة إنتاجية عالية من التدفق الخلوي يولد بيانات إحصائية قوية. ولكن نظرا لدقة منخفضة، فإنه فشل لتحديد بدقة المنضوية مقابل النانوية متجهة الخلية. المجهري يولد صورا مع القرار المكانية العالية؛ حowever، وهو مضيعة للوقت وينطوي على أحجام عينة صغيرة ^6-8. متعددة الأطياف التدفق الخلوي التصوير (MIFC) هي التكنولوجيا الجديدة التي تتضمن جوانب من كلا المجهري والتدفق الخلوي الذي ينفذ متعددة الألوان الطيفية مجال التصوير مضان ومشرق في نفس الوقت من خلال مجموعة أساسية الصفحي. هذه القدرة يقدم تحليلا دقيقا لشدة إشارة الفلورسنت والعلاقات المكانية بين مختلف الهياكل والميزات الخلوية بسرعة عالية.

هنا، نحن تصف طريقة استخدام MIFC لتوصيف السكان الخلية التي قد استوعبت النانوية polyanhydride أو السالمونيلا التيفية الفأرية الملهبة للضرب مصلي. وصفنا أيضا إعداد تعليق جسيمات متناهية الصغر، ووضع العلامات الخلية، واقتناء على نظام ^X ImageStream وتحليل البيانات باستخدام تطبيق الأفكار. علينا أن نبرهن أيضا تطبيق تقنية التي يمكن استخدامها للتمييز بين ع تدخيلathways للجسيمات الدقيقة والبكتيريا باستخدام مثبط حركة الخلايا-D كما المانع من الأكتين بوساطة البلعمة.

Protocol

1. RAW الثقافة خلية 264.7

1. حصاد الخام 264.7 الخلايا من قوارير بها عندما تصل confluency عن طريق كشط لهم بلطف مع مكشطة الخلية. العد وطبق وضعها في طبق خلية ثقافة 24-جيدة في كثافة من 5 خلايا س ⁵ 10 / جيدا في 0.5 مل كاملة Dulbecco ومتوسطة النسر المحورة (cDMEM؛ حرارة المعطل الجنين بنسبة 10٪ مصل بقري (FBS)، 2 مم Glutamax، و 10 HEPES ملم) واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في حاضنة 5٪ CO _2.

2. المسببة للأمراض السالمونيلا الملهبة للضرب مصلي....

Discussion

وقد أظهرت الدراسات التي يمكن أن تستخدم جزيئات قابلة للتحلل على أساس بولي حامض اللبنيك، شارك في الجليكوليك ((PLGA) أو polyanhydrides لتقديم المستضدات مغلفة أو المخدرات إلى الخلايا المستهدفة. استيعاب هذه الجسيمات متناهية الصغر من الخلايا البلعمية من المهم بالنسبة لفعاليتها، مما يجعل الكمية . تحليل لاستيعاب حاسما في تصميم نظم رواية تسليم جسيمات متناهية الصغر باستخدام هذه الطريقة، يمكن تحليل الفرق امتصاص الجسيمات النانوية من قبل مختلف أنواع الخلايا بسهولة وحتى الآن، الفحص المجهري التق.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RAW 264.7 خط الخلية	مجموعة الثقافة الأمريكية من النوع الأمريكي (ATCC)	TIB-71
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Cellgro	10-013-CV
مصل الأبقار الجنيني	Atlanta Biologicals	S 11150	Premium Grade
Glutamax	GIBCO ، من Life Technologies	35050-061
HEPES	GIBCO ، بواسطة Life Technologies	15630-080
24 بئر لوحة	تكنو بلاستيك منتجات	92024
قوارير ثقافة الخلية	تكنو بلاستيك	منتجات 90151
مكشطة خلية	تكنو بلاستيك منتجات	99002	24
سم < م > السالمونيلا المعوية < / em> مصل مصل التيفيموريوم	ATCC	14028
BTX ECM630 مناور الخلايا الكهربائية	BTX Technologies
MOPS	فيشر Scientific	BP308
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) معالج	فوق الصوتية Cellgro	21-040-CV
	Misonix	S-4000
Cytochalasin-D	Sigma-Aldrich ،	C8273
Formaldehyde	Polysciences، Inc.	04018
عازلة غسيل	2٪ FBS معطل بالحرارة ، 0.1٪ أزيد الصوديوم في PBS.
بيرم / غسل عازلة	BD Biosciences	554714
الأنابيب الدقيقة ذات الغطاء المفاجئ ذات الرؤية الواضحة	Sigma-Aldrich	T4816
Alexa Fluor phalloidin 660	Invitrogen	A22285
ImageStreamX< / sup>	Amnis Corporation	100200	الخيارات: ليزر 658 نانومتر ، جهاز أخذ العينات
التلقائي أزيد الصوديوم	فيشر العلوم	S 227I-500