مقالة منهجية

مهام سير العمل صفها البروتيني وحمض حفز توظيف-

11.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/3891

⸱

فبراير 20, 2013

 , 
1Boston Biomedical Research Institute

في هذه المقالة

ملخص

وضع العلامات النظائر المستقرة العمل توظيف 18 O-المخصب المياه (LEO-سير العمل) هي أدوات متعددة للدراسات البروتيوميات الكمية والنوعية. في العمل بمساعدة الأنزيم البروتيني (باليو)، 18 O-ذرات من الانقسام والكربوكسيل بروتين تفاعلات تبادل الأكسجين بوساطة البروتياز. في سير العمل (اليو) حمض المحفزة، 18 O-ذرات الأكسجين عن طريق تبادل الكربوكسيل في انخفاض الرقم الهيدروجيني.

الملخص

النظائر المستقرة هي أدوات أساسية في مطياف الكتلة البيولوجية. تاريخيا، تم 18 O-النظائر المستقرة المستخدمة على نطاق واسع لدراسة آليات الحفاز من الإنزيمات المحللة للبروتين 1-3. مع ظهور البروتيوميات الطيف القائم الشامل، أصبح إدماج إنزيمي المحفزة من 18 ذرات من O-مستقر الماء المخصب isotopically وسيلة شعبية لمقارنة مستويات بروتين تعبير كميا (مراجعتها من قبل Fenselau وياو 4، مياجي وراو 5 و يي وآخرون 6). 18 O وضع العلامات تشكل بديلا بسيطة ومنخفضة التكلفة للمواد الكيميائية (مثل iTRAQ، ICAT) والتمثيل الغذائي تقنيات الوسم (على سبيل المثال SILAC) 7. اعتمادا على الأنزيم البروتيني المستخدمة، يمكن وضع العلامات 18 O يؤدي إلى إدماج تصل إلى ذرات منهما 18-O في المجموعة C-الكربوكسيل محطة للمنتج الانقسام 3 8. لدينا في باليو (ع rotease-A abeling ل ه ssisted mploying 18 O التخصيب الماء) تكييف الأنزيمية 18 O وضع العلامات، ونحن تستخدم 50٪ 18 O-المخصب لانتاج المياه التوقيعات النظائر مميزة. بالاشتراك مع عالية الدقة بمساعدة الليزر مصفوفة الامتزاز التأين وقت من رحلة مطياف الكتلة جنبا إلى جنب (MALDI-TOF/TOF MS / MS)، يمكن استخدام المغلفات النظائر لتحديد المنتجات المميزة الانقسام مع مستوى عال من الدقة. ونحن قد استخدمت سابقا باليو-منهجية لكشف وتميز البروتياز الذاتية 9 و رصد ردود بروتين 10-11. منذ باليو بترميز جوهر رد الفعل الانقسام بروتين، والإعداد التجريبية هو enri بسيطة والكيمياء الحيويةيمكن الخطوات chment من المنتجات الانقسام التحايل. يمكن بسهولة باليو-الأسلوب أن تمتد إلى (ط) التجارب بالطبع الوقت الذي رصد لديناميات تفاعلات الانقسام وبروتين (ب) تحليل العينات البيولوجية في التحلل البروتيني المعقد الذي يمثل الظروف الفسيولوجية. باليو-TimeCourse تجارب مساعدة في تحديد خطوات المعالجة معدل منظم للتفاعل وسيطة في مجمع ردود الفعل مسار بروتين. وعلاوة على ذلك، فإن رد فعل باليو تتيح لنا التعرف الإنزيمات المحللة للبروتين مثل التربسين سيرين البروتياز قادر إلى rebind المنتجات الانقسام وتحفيز إدماج في 18 2 O-ذرية. ويمكن استخدام مثل هذه "انقر نقرا مزدوجا وضع العلامات" الانزيمات لpostdigestion 18 O وضع العلامات، والتي وصفت حصرا الببتيدات عن طريق تفاعل الأوكسجين الصرف الكربوكسيل. استراتيجية الثالث من عمرنا يمتد وصفها توظيف 18 O التخصيب خارج المياه الانزيمات ويستخدم الرقم الهيدروجيني الحمضية الظروف لإدخال 18 علامة النظائر مستقرة O-atures في الببتيدات.

البروتوكول

وقدم ليو-سير العمل تسمح لوضع العلامات النظائر المستقرة للهضم البروتين والببتيدات الاصطناعية. بالطبع هذه التجارب الزمن (الشكل 1) تنطبق على الدراسات المقارنة البروتيوميات والكمية وكذلك البحوث البروتيني. لكل سير عمل يتكون من خطوتين التجريبية (الشكل 2): A) الساعة أخذ العينات من كل حل 18 رد فعل النظائر ترميز O-مستقرة (البروتيني المحفزة الانقسام الببتيد؛ البروتيني المحفزة تبادل الأكسجين الكربوكسيل التفاعل؛ حمض الكربوكسيل حفز تبادل الأكسجين رد فعل) وتحليل الإفطار) من خلال مطياف الكتلة وتمثيل رسومي للحركية O-التأسيس 18.

تجارب A. TimeCourse

I.-باليو TimeCourse: البروتياز المحفزة وسم الانشقاقات بروتين

  1. (اختياري) يتم تخفيض السندات ثاني كبريتيد البروتينات (10 ميكرومتر) والببتيدات (250 ميكرومتر) مع DTT (تركيز النهائي 2.5 ملم)25 مم في NH 4 HCO 3 (كلا الطازجة) من قبل الحضانة لمدة 30 دقيقة عند 50 ° C.
  2. (اختياري) والألكيلية cysteines الحرة مع iodoacetamide (تركيز النهائي 10 ملم) 25 مم في NH 4 HCO 3 في الحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  3. اعتمادا على الأنزيم البروتيني من الفائدة، والبروتين / الببتيد الحلول تحتاج إلى تنظيفها لإزالة متابعة العازلة المتبقية وكيل ألكلة. استخدام الأعمدة PepClean C-18 زيادة ونقصان (الحرارية) لتنظيف الببتيد والمكثفات Vivaspin الطرد المركزي (سارتوريوس) لتبادل مخازن للعينات البروتين.
  4. Redissolve / الببتيدات تبادل / البروتينات في 20 ميكرولتر العازلة رد فعل الأنزيم البروتيني (ECE-1: 50 مم MES-KOH، ودرجة الحموضة 5.5؛ التربسين: 25 مم NH 4 HCO 3، درجة الحموضة 8.0) تحتوي على 1:1 (V / V) H 2 النهائي 18 O (95٪، سيغما Isotec).
  5. سحب نقطة الصفر مرة العينة قبل إضافة الأنزيم البروتيني: مزيج 0،5 ميكرولتر من خليط التفاعل و 0.5 ميكرولتر ألفا cyano-4-hydroxycinnamicحمض مصفوفة (10 ملغ / مل في أسيتونتريل 50٪، 0.1٪ TFA). بقعة على عينة OPTI-TOF MALDI 384 لوحة الهدف (AB SCIEX) وترك قطرات المذيب في درجة حرارة الغرفة حتى تجف (حوالي 5 دقائق).
  6. تقسيم محلول التفاعل إلى قسمين مأخوذة. سيتم المحتضنة في قسامة الأولى مع الأنزيم البروتيني من الفائدة (ECE-1: 75 نانومتر؛ التربسين: 0.04 نيوتن متر) عند درجة حرارة الغرفة أو درجة الحرارة الموصى بها لانزيم معين. سيتم المحتضنة في قسامة ثانية دون البروتيني، وسيكون بمثابة نموذج السيطرة. وقسامة الأول يمثل عينة القياسية لالبروتيني المحفزة 18 O وضع العلامات، ويمكن استخدامها لتحديد الببتيد والبروتينات، والكشف عن الأنشطة بروتين ورصد ردود الفعل الانقسام بروتين. يتم استخدام قسامة ثانية لإظهار أن يسببها 18 O-التأسيس من قبل الأنزيم البروتيني، وبالتالي، لا يتوقع وضع العلامات ولا الانقسام لهذه العينة.
  7. متابعة رد فعل رد فعل مأخوذة عن طريق إزالة واكتشاف لهم كما قصرالخطوة 5 تحت صفه ب على فترات زمنية يبدو كما مناسبا. يتم استخدام ظروف التفاعل المذكورة أعلاه لمراقبة رد فعل بروتين لمدة تصل إلى أربعة أيام (تقريبا 24 بقع). بدء أخذ العينات كل 5 دقائق حتى 30 دقيقة، ثم كل بقعة 30 دقيقة حتى 2 ساعة، ثم كل ساعة حتى 8 ساعة وكل ساعة 8 حتى 4 أيام. يجب أن تظهر منتجات انشقاق داخل ساعة 12 الأولى والركيزة يجب أن يكون تحلل تماما بعد 24 ساعة. تمديد أوقات رد الفعل حضانة تسمح لتحديد المنتجات التي هي رد فعل مستقرة منفصلة من رد فعل وسيطة، والتي يتم تجهيزها أخرى. اعتمادا على سؤال البحث، ونظرا أزواج انزيم الركيزة، واكتشاف مرات حرارة الحضانة والتضمين لتكون الأمثل لضمان أخذ العينات التفاعل.
  8. بعد وقت رد الفعل رصدت النهائي أو نقطة في فترات ممتدة بين اكتشاف، يقدم لوحة الهدف MALDI لتحليل MS / MS MALDI-TOF/TOF كما هو موضح أدناه (B القسم).

II. باليو-TimeCourse: Postdigوضع العلامات estion من مصطلحات بروتين

  1. (اختياري) يتم تخفيض السندات ثاني كبريتيد البروتينات (10 ميكرومتر) والببتيدات (250 ميكرومتر) مع DTT (تركيز النهائي 2.5 ملم) في 25 ملم NH 4 HCO 3 (كلا الطازجة) من قبل الحضانة لمدة 30 دقيقة عند 50 ° C.
  2. (اختياري) والألكيلية cysteines الحرة مع iodoacetamide (تركيز النهائي 10 ملم) 25 مم في NH 4 HCO 3 في الحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  3. اعتمادا على الأنزيم البروتيني من الفائدة، والبروتين / الببتيد الحلول تحتاج إلى تنظيفها لإزالة متابعة العازلة المتبقية وكيل ألكلة. استخدام الأعمدة PepClean C-18 لتنظيف تدور الببتيد والمكثفات Vivaspin الطرد المركزي لتبادل العازلة البروتين.
  4. Redissolve / تبادل المنتجات تنظيفها الببتيد / البروتينات في 20 ميكرولتر العازلة رد فعل الأنزيم البروتيني (مثل التربسين: 25 مم NH 4 HCO 3، درجة الحموضة 8.0) وخلاصة مع البروتيني التي تهم إنجاز (مثل التربسين: 0.04 نانومتر، 37 ° C و 12 ساعة).
  5. منتجات تنظيف الانقسام مع الأعمدة PepClean C-18 زيادة ونقصان. وهذه الخطوة القضاء على الأنزيم البروتيني الأنشطة المتبقية.
  6. Redissolve / تبادل المنتجات تنظيفها الببتيد في 20 ميكرولتر العازلة رد فعل الأنزيم البروتيني (التربسين: 25 مم NH 4 HCO 3، درجة الحموضة 8.0) تحتوي على 1:1 (V / V) H النهائي 2 18 O.
  7. سحب نقطة الصفر مرة العينة قبل إضافة انزيم: مزيج 0،5 ميكرولتر من خليط التفاعل و 0.5 ميكرولتر حمض ألفا مصفوفة cyano-4-hydroxycinnamic (10 ملغ / مل في أسيتونتريل 50٪، 0.1٪ TFA). بقعة العينة على لوحة الهدف MALDI وترك قطرات المذيب في درجة حرارة الغرفة حتى تجف (حوالي 5 دقائق).
  8. تقسيم محلول التفاعل إلى قسمين مأخوذة. سيتم المحتضنة في قسامة الأولى مع الأنزيم البروتيني من الفائدة (على سبيل المثال التربسين: 0.04 نيوتن متر) عند درجة حرارة الغرفة أو درجة الحرارة الموصى بها للانزيم معين. سيتم المحتضنة في قسامة ثانية دون البروتيني، وسيكون بمثابة عنصر تحكم. أولقسامة تمثل عينة قياسية لوضع العلامات البروتيني المحفزة O-18 و postdigestion يمكن استخدامها لالببتيد وتقدير البروتين. يتم استخدام قسامة ثانية لإظهار أن يتم تحفيز 18 O-التأسيس من قبل الأنزيم البروتيني، وبالتالي، لا يتوقع وضع العلامات لهذه العينة.
  9. متابعة رد فعل رد فعل مأخوذة عن طريق إزالة واكتشاف لهم كما هو موضح في الخطوة 7.) في فترات زمنية يبدو كما مناسبا. على سبيل المثال، رصدت في البداية نحن كل 5 دقائق لمدة تصل إلى 30 دقيقة كل 15 دقيقة وبعد ذلك تبادل لمراقبة الأكسجين الكربوكسيل رد فعل يحفزه التربسين.
  10. بعد وقت رد الفعل رصدت النهائي أو نقطة في فترات ممتدة بين اكتشاف يقدم لوحة الهدف MALDI لتحليل MS / MS MALDI-TOF/TOF كما هو موضح أدناه (B القسم).

III. اليو-TimeCourse: حمض المحفزة وسم مجموعات الكربوكسيل

  1. احتضان الببتيد الفردية (50 نانومتر) مع 1:1 (V / V) 18 O-المخصب المياه في رانه جود أو غياب (التحكم) من 0.1٪ (V / V) حمض trifluoroacetic النهائي (المجموع 30 حجم ميكرولتر).
  2. العينة منتجات التفاعل اليومي لمدة 48 يوما من شارك في اكتشاف وقسامة 0،5 ميكرولتر من خليط من المصفوفة مع 0.5μl حمض ألفا cyano-4-hydroxycinnamic (10 ملغ / مل في أسيتونتريل 50٪، 0.1٪ TFA) مباشرة على الهدف MALDI لوحة.
  3. بين فترات اكتشاف وبعد ان شاهد رد فعل من وجهة مرة الأخيرة تقدم MALDI وحة هدفا للتحليل MS / MS MALDI-TOF/TOF كما هو موضح أدناه في الفرع باء.

B. MALDI-TOF/TOF الحصول على البيانات MS / MS وتحليل

  1. يتم الحصول على أطياف الشامل على محلل TOF 4800 / TOF MALDI (AB SCIEX).
  2. قبل التحليل، ومعايرة أجهزة القياس مع مزيج من المعايير الببتيد (قداس معايير كيت لمعايرة أدوات AB TOF / TOF SCIEX) التسامح مع كتلتها القصوى الخطأ قياس 50 ± جزء في المليون، وعدد لا تقل عن ستة قمم للمباراة.
  3. MS الأطياف (المدى الشامليتم الحصول على 4000 م / ض) في ثلاث نسخ باستخدام الوضع الإيجابي مع أيون قابلة للتعديل كثافة الليزر (3400 - - 400 3800؛ حجم الخطوة 50) مع مجموعة قاعدة مقبولة شدة ذروة 2،000 - 45،000. يتم الحصول على لقطات واحدة لأطياف الفرعية، مع 400 طلقات الكل / الطيف، والتوقف عن ظروف حيز التنفيذ منذ 800 الأطياف الفرعية يتم الحصول على (تمرير أو فشل) أو 400 تمريرة معايير القبول الفرعية الأطياف. وينبغي في حالة منخفضة وفيرة عينات أو في وجود خلفيات البيولوجية المعقدة يمكن رفع الطرف الأدنى من نطاق الكشف MS إلى 800 م / ض. وبالإضافة إلى ذلك، قد يكون من الضروري لإزالة الملح وغيرها من المركبات التدخل في عينة خطوة تنظيف كما هو موضح سابقا أو عن طريق فصل LC.
  4. ويتم تصدير ملفات البيانات MS (. t2d الملفات) من سلسلة 4000 مستكشف البرامج الحصول على البيانات واستيرادها إلى لدينا في المنزل المختبرات نظام المعلومات، والتي تستخدم البرمجيات MASCOT المقطر (مصفوفة العلوم) للتجهيز والكشف الطيفي الذروة. النظائر المغلفاتهي deconvoluted و 18 O-إدماج نسب تحدد تلقائيا باستخدام خوارزمية مماثلة لتلك التي وصفها ماسون وآخرون 12 و تكييفها من قبل مجموعتنا 9. بدلا من ذلك، أدوات البرمجيات مثل الافعى ZoomQuant 13 و 14، وكذلك حزم البرامج التجارية مثل كما إكسبرس BioWorks (الحرارية فيشر العلمية) والتميمة المقطر أدوات الكمي يمكن (مصفوفة العلوم) deconvolute 18 O من نوع البيانات 15،16. وعبر 18 O-إدماج نسب والإسهامات النسبية للفرد الأنواع النظير الببتيد (أي الببتيدات تحتوي على 16 O، 18 O 18 O 1 أو 2) لالمغلف النظائر بأكمله.
  5. لكل تجربة TimeCourse، الجماهير الجزيئية ([M + H] +) ليتم استخراج جميع أنواع الببتيد من الكشف عن الملفات المقترنة البيانات MS القيم واهمال في عرض جزء في المليون الشامل 100.
  6. Aر الأقل ثلاثة [M + H] + من المقرر أن تكون هناك حاجة لملء بن. في حالة ركائز معروفة، تتم مقارنة قائمة تمت تصفيتها بن لقائمة من المنتجات الانقسام بروتين توقع من الركيزة تسلسل الببتيد باستخدام أداة FindPept ExPASy 17 ( http://au.expasy.org/tools/findpept.html ) وعلى 200 جزء في المليون الخطأ الشامل التسامح القبول.
  7. يتم الحصول على MS / MS لجميع أطياف القيم الشامل من المنتجات الانقسام وتوقع من قبل أداة FindPept وللقيم التي لديها بن 18 O-المدرجه المرتبطة بها. يتم الحصول على MS / MS البيانات على محلل TOF 4800 / TOF MALDI في وضع عاكس 1KV أيون إيجابية، مع كثافة الليزر الثابتة من 4200 و CID الغاز في وضع إيقاف التشغيل. يتم الحصول على 50 رصاصة في نمط العشوائية في أطياف الفرعية تصل إلى ما مجموعه 40 الأطياف الفرعية في بقعة (مما يعني أن مجموع من 2،000 لقطات / البقعة).
  8. ويتم تصدير MS / MS ملفات البيانات (. t2d الملفات) من سلسلة 4000 ExploRER برامج الحصول على البيانات واستيرادها إلى لدينا في المنزل المختبرات نظام المعلومات، تم الكشف عن القمم وترتبط MS / MS قوائم الذروة مع البيانات MS اهمال المقابلة.
  9. لتحديد الببتيد، يتم البحث MS / MS قوائم الذروة مقابل قاعدة البيانات SwissProt باستخدام محرك البحث MASCOT مع المعلمات البحث التالية: لا خصوصية انزيم، 150 جزء في المليون أيون السلائف و 0.2 جزء أيون التحمل الشامل دا.
  10. بالإضافة إلى ذلك يمكن التعرف الببتيد يمكن التحقق من صحة البيانات باستخدام مستكشف البرامج (AB SCIEX) من خلال التأكيد على السمة 18 O-إدماج أنماط عبر أيونات جزء Y-سلسلة كما وصفها آخرون شيفتشينكو 18.

C. إعداد التوقيت الطيفي و 18 مؤامرات O-التأسيس

المؤامرات الوقت الطيفية: يتم تصدير ملفات البيانات MS (. t2d الملفات) لكل نقطة رد الفعل الوقت من برنامج مستكشف والبيانات ASCII-الملفات باستخدامالكلي واستيرادها إلى تحليل البيانات والرسوم البيانية برنامج حاسوبي (على سبيل المثال من أصل OriginLab) ويظهر على شكل شلال مؤامرات (الشكل 3).

18 O-إدماج المخططات: لكل منتج الببتيد الانقسام اهمال، يتم استخراج المساهمات النسبية للدول، فرادى الأنواع النظير الببتيد (16 O و 18 O 18 O 1 أو 2) في جميع نقاط وقت رد الفعل وتآمر مع الزمن (الشكل 4).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

استخدمنا سير العمل باليو-TimeCourse لرصد حيوي إدماج نظائر مستقرة O-18 في المنتجات الانقسام الببتيد التي تم إنشاؤها بواسطة الإنزيمات المحللة للبروتين. النهج قدم هو أداة مرنة لدراسة مسارات المعالجة نسبيا لبروتين الركيزة مختلفة وتركيبات البروتيني. ردود الفعل من قبل أخذ العينات المحللة للبروتين مرارا وتكرارا على مدى رد الفعل، والتجربة باليو-TimeCourse يقدم لقطات من وقت حل الركيزة وفرة المنتج ومعالجة المعلومات. شارك في اكتشاف عينات بمحلول حمضي مصفوفة على لوحة الهدف يتوقف رد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

من خلال الجمع بين النظائر المستقرة وضع العلامات وعالية الدقة قياس الطيف الكتلي بطريقة حلها في الوقت، وطريقة باليو-TimeCourse يسمح لتحليل ديناميكية من الجيل من المنتجات الببتيد. ويمكن استخدام الفحص لتوليد مستقرة الببتيدات المسمى isotopically للدراسات البروتيوميات الكمية والنوعية وتقييم حركية التي يتم إنشاؤها الببتيدات proteotypic. وعلاوة على ذلك، تم تصميم باليو-TimeCourse لتقييم مسارات محددة تحت بروتين، ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في الجسم الحي السابقين الظروف. يمكن ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIDCR المنح 1R01DE019796.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم المادة شركة كتالوج رقم
أعمدة PepClean C-18 سبين الحرارية 89870
OPTI-TOF MALDI الهدف 384 لوحة AB SCIEX 1016629
4800 MALDI TOF / TOF AB SCIEX

الجدول 1. مواد

اسم كاشف شركة كتالوج رقم
ألفا cyano-4-hydroxycinnamic حمض سيغما الدريتش 70990-1G-F
ألبومين المصل البقري (BSA) سيغما الدريتش A3294-10G
Dithiothreitol (DTT) أكروس 16568-0050
Iodoacetamide (IAM) سيغما الدريتش 1149-5G
Endothelin تحويل انزيم-1 (ECE-1) R & D أنظمة 1784-ZN
التربسين الذهب Promega V5280
O-18 المياه، 97٪ ذرة 18 O سيغما الدريتش 329878-1G
Trifluoroacetic حمض (TFA) الحرارية 28904
الشامل لمعايير عدة معايرة أدوات AB TOF / TOF SCIEX AB SCIEX 4333604

الجدول 2. الكواشف

المراجع

  1. Bender, M., Kemp, K. Oxygen-18 Studies of the Mechanism of the alpha-Chymotrypsin-catalyzed Hydrolysis of Esters. Journal of the American Chemical Society. 79, 111-116 (1957).
  2. Sharon, N., Grisaro, V., Neumann, H. Pepsin-catalyzed exchange of oxygen atoms between water and carboxylic acids. Archives of Biochemistry and Biophysics. 97, 219-221 (1962).
  3. Antonov, V., Ginodman, L., Rumsh, L., Kapitannikov, Y., Barshevskaya, T., Yavashev, L., Gurova, A., Volkova, L. Studies on the mechanisms of action of proteolytic enzymes using heavy oxygen exchange. European Journal of Biochemistry. 117, 195-200 (1981).
  4. Fenselau, C., Yao, X. 18O2-labeling in quantitative proteomic strategies: a status report. Journal of Proteome Research. 8, 2140-2143 (2009).
  5. Miyagi, M., Rao, K. C. S. Proteolytic 18O-labeling strategies for quantitative proteomics. Mass Spectrom. Rev. 26, 121-136 (2007).
  6. Ye, X., Luke, B., Andresson, T., Blonder, J. 18O stable isotope labeling in MS-based proteomics. Brief Funct. Genomic Proteomic. 8, 136-144 (2009).
  7. Bantscheff, M., Schirle, M., Sweetman, G., Rick, J., Kuster, B. Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 389, 1017-1031 (2007).
  8. Yao, X., Afonso, C., Fenselau, C. Dissection of proteolytic 18O labeling: endoprotease-catalyzed 16O-to-18O exchange of truncated peptide substrates. Journal of Proteome Research. 2, 147-152 (2003).
  9. Robinson, S., Niles, R. K., Witkowska, H. E., Rittenbach, K. J., Nichols, R. J., Sargent, J. A., Dixon, S. E., Prakobphol, A., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. A mass spectrometry-based strategy for detecting and characterizing endogenous proteinase activities in complex biological samples. Proteomics. 8, 435-445 (2008).
  10. Cottrell, G. S., Padilla, B. E., Amadesi, S., Poole, D. P., Murphy, J. E., Hardt, M., Roosterman, D., Steinhoff, M., Bunnett, N. W. Endosomal endothelin-converting enzyme-1: a regulator of beta-arrestin-dependent ERK signaling. The Journal of Biological Chemistry. 284, 22411-22425 (2009).
  11. Subramanian, S., Hardt, M., Choe, Y., Niles, R. K., Johansen, E. B., Legac, J., Gut, J., Kerr, I. D., Craik, C. S., Rosenthal, P. J. Hemoglobin cleavage site-specificity of the Plasmodium falciparum cysteine proteases falcipain-2 and falcipain-3. PLoS ONE. 4, e5156(2009).
  12. Mason, C., Therneau, T., Eckel-Passow, J., Johnson, K., Oberg, A., Olson, J., Nair, K., Muddiman, D. C., Bergen, H. A method for automatically interpreting mass spectra of 18O-labeled isotopic clusters. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 305-318 (2007).
  13. Hicks, W. A., Halligan, B. D., Slyper, R. Y., Twigger, S. N., Greene, A. S., Olivier, M. Simultaneous quantification and identification using 18O labeling with an ion trap mass spectrometer and the analysis software application "ZoomQuant". J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16, 916-925 (2005).
  14. Qian, W. -J., Petritis, B. O., Nicora, C. D., Smith, R. D. Trypsin-catalyzed oxygen-18 labeling for quantitative proteomics. Methods Mol. Biol. 753, 43-54 (2011).
  15. Ye, X., Luke, B. T., Johann, D. J., Ono, A., Prieto, D. A., Chan, K. C., Issaq, H. J., Veenstra, T. D., Blonder, J. Optimized method for computing (18)O/(16)O ratios of differentially stable-isotope labeled peptides in the context of postdigestion (18)O exchange/labeling. Anal. Chem. 82 (18), 5878-5886 (2010).
  16. Hardt, M., Lam, D. K., Dolan, J. C., Schmidt, B. L. Surveying proteolytic processes in human cancer microenvironments by microdialysis and activity-based mass spectrometry. Proteomics Clin. Appl. 5, 636-643 (2011).
  17. Gattiker, A., Bienvenut, W., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. Proteomics. 2, 1435-1444 (2002).
  18. Shevchenko, A., Chernushevich, I., Ens, W., Standing, K. G., Thomson, B., Wilm, M., Mann, M. Rapid 'de novo' peptide sequencing by a combination of nanoelectrospray, isotopic labeling and a quadrupole/time-of-flight mass spectrometer. Rapid Commun. Mass Spectrom. 11, 1015-1024 (1997).
  19. Niles, R. K., Witkowska, H. E., Allen, S., Hall, S. C., Fisher, S. J., Hardt, M. Acid-catalyzed oxygen-18 labeling of peptides. Analytical Chemistry. 81, 2804-2809 (2009).
  20. Bender, M., Stone, R., Dewey, R. Kinetics of Isotopic Oxygen Exchange between Substituted Benzoic Acids and Water. Journal of the American Chemical Society. 78, 319-321 (1956).
  21. Kuster, B., Schirle, M., Mallick, P., Aebersold, R. Scoring proteomes with proteotypic peptide probes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 577-583 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

18 PALeO MALDI TOF MS

مقالات ذات صلة