يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير تلألؤ بيولوجي من نشاط إنزيم NADPH في مختلف النماذج الحيوانية

16.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/3925

⸱

أكتوبر 22, 2012

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Departments of Medicine and Immunology, Roswell Park Cancer Institute, 3Department of Medicine, University at Buffalo School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

NADPH أوكسيديز هو المصدر الرئيسي للأنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) في البالعات. نظرا لطبيعة زائلة من ROS، فإنه من الصعب قياس ومراقبة مستويات ROS في الحيوانات الحية. يوصف أسلوب القياس الكمي للمينيملي المسلسل من ROS في الفئران الحية.

الملخص

يُعد إنزيم NADPH oxidase إنزيماً حاسماً يتوسط الدفاع المضيف المضاد للبكتيريا والفطريات. وبالإضافة إلى دوره في الدفاع المضيف ضد الميكروبات، يمتلك NADPH oxidase وظائف إشارية حاسمة تعمل على تعديل الاستجابة الالتهابية 1. وبناءً على ذلك، فإن تطوير طريقة لقياس حركية توليد ROS المشتقة من NADPH oxidase في "الوقت الفعلي" من المتوقع أن تكون أداة بحثية قيمة لفهم الآليات المتعلقة بالدفاع المضيف والالتهاب والإصابة.

يعد مرض الحبيبات المزمن (CGD) اضطراباً وراثياً في إنزيم NADPH oxidase، ويتميز بحدوث عدوى شديدة والتهابات مفرطة. يتطلب تنشيط NADPH oxidase في الخلايا البلعمية انتقال وحداته السيتوبلازمية (p47phox و p67phox و p40phox) وبروتين Rac إلى فلافوسيتوكروم مرتبط بالغشاء (يتكون من ثنائي الببتيد غير المتجانس gp91phox و p22phox). وتؤدي طفرات فقدان الوظيفة في أي من مكونات NADPH oxidase هذه إلى الإصابة بمرض الحبيبات المزمن. وعلى غرار المرضى المصابين بـ CGD، تظهر الفئران التي تعاني من نقص في gp91phox والفئران التي تعاني من نقص في p47phox خللاً في نشاط NADPH oxidase في الخلايا البلعمية وضعفاً في دفاعات المضيف 2, 13. وبالإضافة إلى الخلايا البلعمية التي تحتوي على مكونات NADPH oxidase المذكورة أعلاه، تعبر مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الأخرى عن أشكال مختلفة من إنزيم NADPH oxidase.

نصف هنا طريقة لتقدير كمية إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الفئران الحية، وتحديد مساهمة إنزيم NADPH oxidase في توليد هذه الأنواع في نماذج الالتهاب والإصابة. تعتمد هذه الطريقة على تفاعل أنواع الأكسجين التفاعلية مع L-012 (أحد نظائر اللومينول) لإصدار وميض يتم تسجيله بواسطة جهاز شحن مقترن (CCD). في الوصف الأصلي لمسبار L-012، تم إبطال التألق الكيميائي المعتمد على L-012 تماماً بواسطة إنزيم superoxide dismutase، مما يشير إلى أن النوع الرئيسي من ROS الذي تم اكتشافه في هذا التفاعل كان أنيون السوبر أكسيد 14. وقد أظهرت الدراسات اللاحقة أن L-012 يمكنه اكتشاف جذور حرة أخرى، بما في ذلك أنواع النيتروجين التفاعلية 15, 16. وأظهر Kielland et al. 16 أن التطبيق الموضعي لـ phorbol myristate acetate، وهو منشط قوي لإنزيم NADPH oxidase، أدى إلى توليد ROS معتمد على NADPH oxidase يمكن اكتشافه في الفئران باستخدام المسبار المضيء L-012. وفي هذا النموذج، أظهروا أن الوميض المعتمد على L-012 قد أُبطل في الفئران التي تعاني من نقص في p47phox.

لقد قارنا توليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الفئران البرية والفئران التي تعاني من نقص في NADPH oxidase من النوع p47phox-/- 2 في النماذج الثلاثة التالية: 1) الإعطاء الرغامي للزيموزان (zymosan)، وهو منتج مشتق من جدار خلوي فطري محفز للالتهاب يمكنه تنشيط NADPH oxidase؛ 2) ربط وثقب الأعور (CLP)، وهو نموذج لإنتان داخل البطن مع التهاب وإصابة رئوية حادة ثانوية؛ 3) رابع كلوريد الكربون (CCl4) عن طريق الفم، وهو نموذج لإصابة كبدية تعتمد على ROS. لقد تم اختيار هذه النماذج خصيصاً لتقييم توليد ROS المعتمد على NADPH oxidase في سياق الالتهابات غير المعدية، والإنتان متعدد الميكروبات، وإصابة الأعضاء الناجمة عن السموم، على التوالي. إن مقارنة التألق الحيوي في الفئران البرية مع الفئران p47phox-/- تمكننا من تحديد المساهمة المحددة لـ ROS الناتج عن NADPH oxidase المحتوي على p47phox في إشارة التألق الحيوي في هذه النماذج.

أظهرت نتائج تصوير bioluminescence زيادة في مستويات ROS في الفئران من النوع البري (wildtype) مقارنة بفئران p47phox-/-، مما يشير إلى أن NADPH oxidase هو المصدر الرئيسي لتوليد ROS استجابةً للمنبهات الالتهابية. توفر هذه الطريقة نهجاً طفيف التوغل للمراقبة "في الوقت الفعلي" لتوليد ROS أثناء الالتهاب in vivo.

البروتوكول

1. نماذج الحيوان

  1. الفئران: استخدام P47-phox / - الفئران والعمر والجنس المتطابقة-الفئران C57BL6/DBA. الحصول على موافقة لإجراء التجارب من رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام.
  2. التخدير: استخدام نظام إدارة isoflurane المستمر للحث على التخدير. يتم تعبئة النظام المرذاذ (VetEquip) مع isoflurane (2-3٪). تؤكد أن الفئران هي تخدير كامل من خلال مراقبة حركة التنفس، ومنعكس القرنية استجابة للمؤثرات الخارجية.
  3. العمليات الجراحية: فرك منطقة العمليات الجراحية (الفوق) مع الايثانول 70٪. ارتداء قفازات معقمة ونظيفة ثوب الجراحية والقناع. إعداد الفئران عن طريق تقليم الشعر وتطبيق betadine بالتناوب مع الايثانول 70٪ إلى المنطقة حيث سيتم شق. إجراء عمليات جراحية على سطح معقمة واستخدام أدوات معقمة. رصد الفئران بعد العملية حتى مستيقظا ويتحرك بحرية.
  4. داخل الرغامى زيموزان الإدارة
    1. إدارة التخديركما هو موضح في 1.2.
    2. تطهير منطقة العمليات الجراحية (الرقبة) مع betadine والايثانول 70٪ وفضح القصبة الهوائية عن طريق تشريح الجراحي.
    3. بيرس القصبة الهوائية مع إبرة قياس 27-وضخ زيموزان (سانت لويس، MO) بجرعة من 1 ميكروغرام / غرام باستخدام ميكروغرام 0.5 / ميكرولتر حل (المجموع 50 ميكرولتر حجم للماوس ز 25) الذائب في PBS العقيمة.
    4. إغلاق الجرح الفئران الرقبة مع خيوط الحرير 5-0 في ظل ظروف معقمة العقيم.
    5. الصورة بعد 4 ساعات وعلى مدار 24 ساعة.
  5. الأعور ربط وثقب
    1. إدارة التخدير كما هو موضح في 1.2.
    2. مقطع الشعر في منطقة العمليات الجراحية (البطن) وتعقيمها مع betadine والايثانول 70٪.
    3. تنفيذ خط الوسط البطن وتحديد الأعور.
    4. Ligate على القاصي 50٪ من المعرضين الأعور مع خياطة الحرير 4-0 و الأعور ثقب البعيدة للربط مع مرور واحد من إبرة قياس 21-.
    5. إغلاق شق مع خيوط الحرير 4-0 العقيمة.
    6. الصورة بعد 4 ساعات و24 ساعة.
  6. رابع كلوريد الكربون عن طريق الفم (لجنة علم المناخ 4) الإدارة
    1. إدارة التخدير كما هو موضح في 1.2.
    2. إدارة لجنة علم المناخ 4 (2 ميكروغرام / غرام، سانت لويس، MO) المذاب في زيت الذرة بالتزقيم عن طريق الفم. يجب أن يتم تنفيذ الإجراء من CCL4 الإدارة في مجال معين وفقا للIBC / EHS السياسات.
    3. الصورة بعد 4 ساعات وعلى مدار 24 ساعة.

2. الحصول على صورة Bioluminescent

  1. تهيئة ال 200 IVIS نظام التصوير (Xenogen شركة، ألاميدا، CA)، تعيين إلى وضع التلألؤ، وانتظر الجهاز المسؤول عن يقترن (CCD) لتأمين درجة حرارة.
  2. حدد وقت التعرض، binning (وسط) وF / إيقاف إعدادات (8).
  3. الفئران في موقف ضعيف مكان في غرفة التصوير على مسرح ساخنة للحفاظ على درجة حرارة الجسم طبيعية. إدارة التخدير كما هو موضح في 1.2 عن طريق الأنف بينما مخروط الفئران هي في غرفة التصوير IVIS.
  4. إدارة L-012 (20 ميكروغرام / غرام) في حل PBS العقيمة (10 ميكروغرام / ميكرولتر) عن طريق الوريد عن طريق الحقن خلف الحجاج في كل نقطة الوقت المحدد للتصوير.
  5. التقاط الصور في بداية 2 دقيقة بعد الحقن L-012. نستخدم عادة التعرض و 40 ثانية.

3. تحليل البيانات باستخدام منطقة الاهتمام

  1. تحليل البيانات باستخدام البرامج الحية صورة v.4.2 (Xenogen شركة، ألاميدا، CA).
  2. فتح صورة وحدد قياس المنطقة من الأدوات الفائدة.
  3. تحديد المنطقة من شكل وحجم الفائدة على / أو الصدر والبطن بعد تتراكب صورة ملونة شبه الرقمية (التي تمثل كشف الفوتون) على صورة فوتوغرافية من الفأرة.
  4. تحديد كثافة إشارة (الفوتون تدفق) من منطقة الفائدة.

4. إحصائيات

  1. استخدام حزمة برامج التحليل الإحصائي لأداء اتجاهين مع ANOVA Bonferroni بعد الاختبار في نقاط زمنية الفردية.
TLE "> نتائج الممثل 5.

زيموزان هي خلايا الخميرة الموالية للالتهابات المنتج الجدار ومنشط قوي للأوكسيديز NADPH 3. أظهرنا سابقا أن زيموزان داخل الرغامى يدفع أكثر قوة والتهاب الرئة عدلة الموالية للالتهابات إنتاج السيتوكينات في P47-phox / - مقارنة wildtype الفئران 1. هنا، كان هدفنا لمقارنة ROS الجيل في الرئتين من wildtype وP47-phox / - الفئران بعد التحدي زيموزان. في 4 ساعات بعد تناوله زيموزان داخل الرغامى، لاحظنا زيادة كبيرة في الانبعاثات الفوتون على الصدر في الفئران مقارنة مع wildtype الأساس، وكذلك زيادة في الانبعاثات الفوتون في wildtype مقارنة P47-phox / - الفئران في 4 ساعات وعلى مدار 24 ساعة. في المقابل، إشارات تلألؤ بيولوجي في P47-phox / - الفئران ظلت عند مستويات خط الأساس في 4 ساعات بعد العلاج زيموزان (Fig.1 AB). وهكذا، يبدو أن أوكسيديز NADPH به المصدر الرئيسي للجيل ROS في الرئتين بعد زيموزان الإدارة.

المقبل، قمنا بتقييم ROS الإنتاج في نموذج الإنتان CLP-المستحث. الإنتان هو متلازمة تهدد الحياة المرتبطة نهاية الجهاز الضرر، بما في ذلك الضرر الرئة الحاد (ALI) ومتلازمة الضائقة التنفسية الحادة (ARDS) 4، 5. وقد اعتبر ROS بوساطة الإصابة ليكون عاملا هاما القيادة الإنتان الناجم عن اختلال وظيفي متعدد الجهاز. وجدنا أن زيادة كبيرة على مدى الصدر ROS (4 ساعة) وعلى البطن (24 ساعة) بعد CLP في الفئران مقارنة مع wildtype خط الأساس. غير أن مستويات ROS في P47-phox / - الفئران كانت مماثلة لمستويات خط الأساس في نقاط زمنية على حد سواء (Fig.2 AC). هذه النتائج تبين أن الجيل ROS في نموذج الفأر الإنتان الناجم عن CLP-NADPH أوكسيديز هو المعتمدة.

وأخيرا، كنا bioluminescent التصوير للكشف عن ROS الإنتاج في 4-الناجم عن الإصابة جنة علم المناخ الكبد الوضعلتر. 4 أسباب نخر جنة علم المناخ الخلايا الكبدية، واستخدمت في تصميم نموذج كل من اصابة الكبد الحاد وتليف الكبد 6. وعلى النقيض من النماذج التي سبق وصفها من الالتهاب والإصابة، وجدنا أن ROS الإنتاج في البطن كان متواضعا (حوالي 35٪) أكثر من خط الأساس في زيادة P47-phox / - الفئران في 4 ساعات بعد 4 للجنة علم المناخ الإدارة. ومع ذلك، كان حجم لجنة علم المناخ الناجم 4-ROS جيل أكبر بكثير على الفئران في P47 wildtype من phox / - الفئران (Fig.3 AB). هذه البيانات تشير إلى أن كلا الجيل ROS P47 phox التي تحتوي على NADPH أوكسيديز التي تعتمد على ومستقلة تحدث في لجنة علم المناخ الحاد الناجم عن إصابة 4-الكبد.

figure-protocol-1
الرقم الإنتاج ROS 1. في الرئتين بعد العلاج زيموزان. A) الممثل bioluminescenم التصوير الإنتاج ROS. ملاحظة أنه بالإضافة إلى صدره، والتلألؤ قابلا للاكتشاف على البطن في كل من wildtype وP47-phox / - الفئران والتلألؤ البطن هو دون تغيير عن طريق العلاج زيموزان. B) من التهم الفوتون صدر wildtype وP47-phox / - الفئران بعد حقنة واحدة داخل الرغامى (IT) من زيموزان. تم إجراء التصوير تلألؤ بيولوجي في الأساس، ح 4، و24 ساعة. وقد تم تحديد انبعاث الضوء من منطقة الفوائد على الصدر باستخدام المشار شبه لون الحجم. يتم عرض النتائج على النحو يعني ± SE، ن = 6-9 في المجموعة، * = P <0.05. اضغط هنا لتكبير الرقم .

figure-protocol-2
الكشف عن الرقم ROS 2. بعد CLP. A تلألؤ بيولوجي الممثل) التصوير الإنتاج ROS، B) من التهم الفوتون الصدر، وC) التهم الفوتون من بطن wildtype وP47-phox / - الفئران في الأساس، 4 ساعة، وبعد 24 ساعة CLP. يتم عرض النتائج على النحو يعني ± SE، ن = 4-5 في المجموعة، * = P <0.05. اضغط هنا لتكبير الرقم .

figure-protocol-3
إنتاج الرقم ROS 3. في البطن بعد لجنة علم المناخ الناجم عن إصابة 4-الكبد. A) التصوير تلألؤ بيولوجي الممثل الإنتاج ROS وB) التهم الفوتون من بطن wildtype وP47-phox / - الفئران في الأساس، والموارد البشرية 4، وعلى مدار 24 ساعة عن طريق الفم بعد العلاج 4 للجنة علم المناخ. يتم عرض النتائج على النحو يعني ± SE؛ ن = 4-5 في المجموعة، * = P <0.05 انقر هنا للحصول على أكبر شخصية .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لا يمكن أن يتحقق "في الوقت الحقيقي" قياس أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) في الحيوانات الحية باستخدام تحقيقات الفلورسنت وchemiluminescent. في حين تحقيقات الفلورسنت يعانون من ضعف وجود إشارة إلى الضوضاء نسب 12، تقنية التصوير صفها هو أكثر حساسية للكشف عن انبعاث الضوء بعد تفاعل كيميائي من ROS مع الركيزة كسيماترين المستندة إلى L-012. مثل كل تقنيات التصوير bioluminescent، يقتصر هذه المنهجية من قبل امتصاص الضوء التي تعتمد على الطول الموجي والتشرذم من قبل الأعضاء والأنس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة RO1 AI079253 وزارة شؤون المحاربين القدامى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم تعليقات
L-012 واكو كيماويات الولايات المتحدة الأمريكية، وشركة 120-04891
زيموزان سيغما، وسانت لويس، MO Z4250
رابع كلوريد الكربون سيغما، وسانت لويس، MO 289116

المراجع

  1. Segal, B., Han, W., Bushey, J. NADPH oxidase limits innate immune response in the lungs in mice. PLoS ONE. 5, e9631(2010).
  2. Jackson, S., Gallin, J., Holland, S. M. The p47phox mouse knock-out model of chronic granulomatous disease. J. Exp. Med. 182, 751-758 (1995).
  3. Gantner, B. N., Simmons, R. M., Underhill, D. M. Collaborative induction of inflammatory responses by dectin-1 and Toll-like receptor 2. J. Exp. Med. 197, 1107-1117 (2003).
  4. Dejager, L., Pinheiro, I., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends Microbiol. 19, 198-208 (2011).
  5. Tsiotou, A. G., Sakorafas, G. H., Bramis, J. Septic shock; current pathogenetic concepts from a clinical perspective. Med. Sci. Monit. 11, 76-85 (2005).
  6. Fujii, T., Fuchs, B. C., Tanabe, K. K. Mouse model of carbon tetrachloride induced liver fibrosis: Histopathological changes and expression of CD133 and epidermal growth factor. BMC Gastroenterology. 10, 79-90 (2010).
  7. Kubo, H., Morgensterm, D., Doerschuk, C. M. Preservation of complement-induced lung injury in mice with deficiency of NADPH oxidase. J. Clin. Invest. 97, 2680-2684 (1996).
  8. Segal, B., Sakamoto, N., Bulkley, G. B. Xanthine oxidase contributes to host defense against Burkholderia cepacia in the p47(phox-/-) mouse model of chronic granulomatous disease. Infect Immun. 68, 2374-2378 (2000).
  9. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological reviews. 82, 47-95 (2002).
  10. Jones, D. Radical-free biology of oxidative stress. American journal of physiology. Cell physiology. 295, C849-C868 (2008).
  11. Hubbard, W. J., Choudhry, M., Chaudry, I. H. Cecal ligation and puncture. Shock. 24, 52-57 Forthcoming.
  12. Wardman, P. Fluorescent and luminescent probes for measurement of oxidative and nitrosative species in cells and tissues: progress, pitfalls, and prospects. Free Radic. Biol. Med. 43, 995-1022 (2007).
  13. Pollock, J. D., Williams, D. A., Gifford, M. A. Mouse model of X-linked chronic granulomatous disease, an inherited defect in phagocyte superoxide production. Nat. Genet. 9, 202-209 (1995).
  14. Aramaki, Y., Y,, Yoshida, H. A new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 193, 554-559 (1993).
  15. Daiber, A., Oelze, M., August, M. Detection of superoxide and peroxynitrite in model systems and mitochondria by the luminol analogue L-012. Free Radic. Res. 38, 259-269 (2004).
  16. Kielland, A., Blom, T., Nandakumar, K. S. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

L 012 P47phox
التصوير تلألؤ بيولوجي من نشاط إنزيم NADPH في مختلف النماذج الحيوانية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.