Method Article

Endothelialized على microfluidics لدراسة التفاعلات الاوعية الدموية الدقيقة في الأمراض الدموية

DOI:

10.3791/3958

⸱

June 22nd, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Wallace H. Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology and Emory University, 3Aflac Cancer Center and Blood Disorders Service of Children's Healthcare of Atlanta , 4Winship Cancer Institute of Emory University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" > تم وصف طريقة لزراعة طبقة أحادية الخلية البطانية في جميع أنحاء السطح الداخلي ثلاثي الأبعاد بالكامل لجهاز موائع دقيقة مع قنوات بحجم الأوعية الدموية الدقيقة (<30 ميكرومتر). يتيح نموذج الأوعية الدموية الدقيقة في المختبر دراسة التفاعلات الفيزيائية الحيوية بين خلايا الدم والخلايا البطانية والعوامل القابلة للذوبان في أمراض الدم.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مكنت التطورات في تقنيات التصنيع الدقيق من إنتاج أنظمة موائع دقيقة غير مكلفة وقابلة للتكرار لإجراء التجارب البيولوجية والكيميائية الحيوية على المقاييس الدقيقة والنانوية 1،2. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام الموائع الدقيقة أيضا على وجه التحديد لتحليل العمليات الدموية والأوعية الدموية الدقيقة كميا ، نظرا لقدرتها على التحكم بسهولة في البيئة السائلة الديناميكية والظروف البيولوجية3-6. على هذا النحو ، استخدم الباحثون مؤخرا أنظمة الموائع الدقيقة لدراسة تشوه خلايا الدم ، وتراكم خلايا الدم ، وتدفق الدم في الأوعية الدموية الدقيقة ، وتفاعلات خلايا الدم والخلايا البطانية6-13. ومع ذلك ، فإن أنظمة الموائع الدقيقة هذه إما لم تشمل الخلايا البطانية المستنبتة أو كانت أكبر من الحجم المتعلق بالعمليات المرضية للأوعية الدموية الدقيقة. هناك حاجة إلى منصة موائع دقيقة مع خلايا بطانية مستنبتة تلخص بدقة البيئة الخلوية والفيزيائية وديناميكية الدورة الدموية للدوران الدقيق لتعزيز فهمنا للفيزيولوجيا المرضية الفيزيائية الحيوية الأساسية لأمراض الدم التي تنطوي على الأوعية الدموية الدقيقة.

هنا ، نبلغ عن طريقة لإنشاء نموذج "بطاني" في المختبر للأوعية الدموية الدقيقة ، باستخدام عملية تصنيع دقيق بسيطة أحادية القناع جنبا إلى جنب مع تقنيات زراعة الخلايا البطانية القياسية ، لدراسة تفاعلات الأوعية الدموية الدقيقة الفيزيائية الحيوية المرضية التي تحدث في أمراض الدم. يوفر هذا "الأوعية الدموية الدقيقة على رقاقة" للباحث فحصا قويا يتحكم بإحكام في الظروف البيولوجية والفيزيائية الحيوية ويتم تشغيله باستخدام مضخة حقنة قياسية وفحص مجهري ساطع / فلوري. يمكن التحكم بسهولة في المعلمات مثل ظروف الدورة الدموية الدقيقة ، ونوع الخلايا البطانية ، ونوع (أنواع) خلايا الدم والتركيز (التركيزات) ، وتركيز الدواء / المثبط وما إلى ذلك. على هذا النحو ، يوفر نظامنا المجهر طريقة للتحقيق الكمي في عمليات المرض التي يضعف فيها تدفق الأوعية الدموية الدقيقة بسبب التغيرات في التصاق الخلايا وتجميعها وتشويهها ، وهي قدرة غير متوفرة مع المقايسات الحالية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_title" >1. تصنيع الجهاز الدقيق البطاني

  1. قم بإنشاء قناع ضوئي عن طريق إرسال رسم تصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) لجهاز الموائع الدقيقة إلى بائع قناع خارجي. يتكون القناع المستخدم من طبقة من الكروم على زجاج الجير الصودا. في هذه الحالة ، كان عرض قناة الموائع الدقيقة 30 ميكرومتر.
  2. نظف رقاقة السيليكون العارية مع سمكة البيرانا (نسبة 10: 1 من حمض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين) لمدة 15 دقيقة واغمس في حمض الهيدروفلوريك لمدة 30 ثانية. اشطفه بالماء منزوع الأيونات (DI) لمدة 10 ثوان تقريبا.
  3. باستخدام آلة طلاء الدوران ، قم بتدوير Microchem SU-8 2025 المقاوم للضوء على الرقاقة على ارتفاع 30 ميكرومتر. بالنسبة إلى SU-8 2025 ، يوصى بسرعة دوران تبلغ 3000 دورة في الدقيقة. تتوفر لزوجة أخرى من SU-8 والتي ستحقق هذا الارتفاع. تتوفر التعليمات الكاملة لاستخدام SU-8 على www.microchem.com
  4. ضع الرقاقة مع SU-8 على لوح تسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للتخلص من المذيبات الزائدة.
    ملحوظة: سوف يجفف الفرن الرقاقة بشكل مختلف عن لوح التسخين ولا ينصح به.
  5. ضع قناعا بالشكل المطلوب للميزة فوق الرقاقة ، وقم بتعريضه للأشعة فوق البنفسجية (160 مللي جول / سم2 مقاس عند 365 نانومتر) في تقويم القناع (Karl Suss ، MA-6). يربط هذا الصليب المقاوم للضوء.
  6. ضع الرقاقة مرة أخرى على لوح تسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق إضافية لتسريع بلمرة SU-8.
  7. اغمر الرقاقة في SU-8 Developer ، المتكون بشكل أساسي من PGMEA (أسيتات البروبيلين جلايكول ميثيل الأثير) لمدة 4 دقائق لإزالة SU-8 غير المتشابك.
  8. اشطف الرقاقة المطورة حديثا بكحول الأيزوبروبيل 100٪ (IPA) لمدة 10 ثوان. يمكن بعد ذلك تجفيف الرقاقة باستخدام النيتروجين المضغوط أو عن طريق السماح للمذيب بالتبخر من الرقاقة في غطاء دخان نظيف لعدة دقائق.
  9. قم بلصق حواف الرقاقة الجافة باستخدام SU-8 المزخرف في طبق بتري لمنع الحركة.
  10. ضع 1 مل من Sigmacote على الرقاقة باستخدام ماصة ، وقم بتغطيتها بالجزء العلوي من طبق بتري ، ورقاقة دوامة لضمان الطلاء الكامل للرقاقة ، وإزالة الغطاء ، والسماح للرقاقة بالجفاف لعدة دقائق حتى يتبخر كل المذيبات.
فئة

2. تحضير PDMS (Polydimethylsiloxane)

  1. امزج بوليمر PDMS وعامل المعالجة بنسبة 10: 1 (وزن / وزن) وقم بإزالة فقاعات الهواء باستخدام مجفف فراغ. يختلف طول الوقت اللازم لتفريغ PDMS حسب قوة نظام التفريغ المتاح ، ولكنه يتراوح عادة من عدة دقائق إلى ساعة واحدة. بالنسبة لطبق بتري بحجم ستة بوصات بدون PDMS مصبوب مسبقا ، يوصى بحجم إجمالي يبلغ 60 مل من البوليمر.
  2. يسكب المزيج على الرقاقة بسمك 5 مم تقريبا. اسكبيها أيضا على طبق مسطح القاع لعمل ورقة رقيقة من PDMS ، بسمك 1 مم تقريبا. عالج عند 60 درجة مئوية في فرن طوال الليل.
  3. باستخدام سكين أو مشرط ، اقطع حول جهاز PDMS المعالج وقم بإزالته من الرقاقة. بالإضافة إلى ذلك ، قم بقص ورقة رقيقة من PDMS أكبر قليلا من الجهاز.
  4. قم بإنشاء فتحات مدخل ومخرج في جهاز PDMS باستخدام ثقب ثقب 1.0 مم. يمكن تحقيق ذلك إما باستخدام نائب دبوس أو Harris Uni-Core أو جهاز مشابه.
  5. نظف أسطح الجهاز والورقة باستخدام شريط سكوتش.
  6. باستخدام منظف البلازما ، قم بتعريض أسطح جهاز PDMS وورقة PDMS لبلازما الأكسجين لمدة 30 ثانية. تخلق بلازما الأكسجين أنواعا تفاعلية على السطح المكشوف ل PDMS والتي ترتبط عند ملامستها الجسدي.
  7. قم بتوصيل أنبوب أصغر بطول صغير (عدة سنتيمترات) من الأنابيب الكبيرة ، والتي بدورها متصلة بحقنة بإبرة حادة ، مملوءة ب 50 ميكروغرام / مل من الفيبرونيكتين من البلازما البشرية في PBS. يتم تحديد حجم الأنبوب والإبرة بحيث يتم إنشاء احتكاك بين الأنبوب. أدخل أنبوبا أصغر في مدخل جهاز PDMS الدقيق واضغط على المحقنة لملء القنوات بالكامل بمحلول الفيبرونيكتين ولإنشاء قطرة صغيرة تبلغ 100 ميكرولتر عند منفذ المخرج، لضمان بقاء القنوات رطبة. احتضان الجهاز عند 37 درجة مئوية لمدة 40-60 دقيقة.
  8. قم بتوصيل حقنة جديدة مملوءة ب PBS بإبرة النقطة الحادة. اضغط على المحقنة لشطف الجهاز باستخدام PBS.
< p class = "jove_title" >3. بذر جهاز الموائع الدقيقة بالخلايا البطانية
  1. تحضير 1،000،000 خلية / مل من الخلايا البطانية الوريدية السرية البشرية (HUVECs) في وسط النمو البطاني مع 8٪ ديكستران. تم استخدام مجموعة من 500,000 إلى 2,000,000 خلية / مل بنجاح. تؤدي إضافة ديكستران إلى وسط تحميل الخلية إلى زيادة لزوجة السائل ، مما يقلل من سرعة الخلايا البطانية عند دخولها نظام الموائع الدقيقة المطلي بالفيبرونكتين. وهذا بدوره يزيد من احتمالية أن تلتصق الخلايا وتزرعها بنجاح داخل الجهاز الدقيق.
  2. قم بتوصيل المحقنة والأنبوب الجديدين كما في الخطوة 2.7. ولكن بأنبوب أطول (يبلغ طوله حوالي 1 متر).
  3. لتحسين أداء هذا النظام ، من الأهمية بمكان في هذه المرحلة منع أي تسرب أو فقاعات في نظام التروية بأكمله ؛ أي تسرب للمحلول أو وجود فقاعات في الوسائط سيغير التدفق ويمنع البذر الناجح للخلايا البطانية. لذلك ، يعد التركيب المحكم للأنبوب أمرا ضروريا للتخلص من التسرب بين أي اتصالات. يجب التخلص من الفقاعات الموجودة في المحقنة و / أو الأنبوب قبل إدخال الخلايا في الجهاز الدقيق ويجب تحضير نظام التروية بالكامل بمحلول الخلية قبل ربط الأنبوب بالسائل الدقيق لتجنب إدخال فقاعات الهواء.
  4. باستخدام مضخة حقنة ، قم بضخ تعليق الخلية في جهاز PDMS بمعدل تدفق حجمي يبلغ 1.23 ميكرولتر / دقيقة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. تم تحقيق أفضل النتائج عندما كانت مضخة الحقنة على نفس ارتفاع جهاز PDMS. بالنسبة للمدخل ، يضمن الأنبوب الأطول ، الذي يمكن لفه داخل الحاضنة ، تسخين الخلايا والوسائط بشكل كاف قبل ملامسة الجهاز. في نظامنا ، يقترب معدل التدفق الحجمي البالغ 1.23 ميكرولتر / دقيقة من سرعة منتصف الطريق ~ 1 مم / ثانية في أصغر القنوات الدقيقة ، وهو ما يتوافق مع إجهاد قص الجدار ~ 1 داين / سم2 في تلك القنوات باستخدام الدم الكامل.
  5. باستخدام نفس مضخة الحقنة والأنابيب الطويلة ، قم ببث وسائط النمو الطازجة لمدة 2-8 أيام بنسبة 1.23 ميكرولتر / دقيقة. سيحتوي الجهاز الناجح على طبقة أحادية من الخلايا البطانية تنمو داخل الجهاز في غضون 24-48 ساعة. أظهرت التجارب السابقة أن الطبقات الأحادية المتقاربة تعبر بشكل مناسب عن VE-cadherin عند تقاطعات الخلية في جميع أنحاء الجهاز14.
  6. حقن الدم أو تعليق الخلايا في نظام للتجريب.

4. النتائج التمثيلية

باستخدام هذا البروتوكول ، يتم استخدام تقنيات التصنيع الدقيق الحجرية القياسية لإنشاء القالب اللازم لإنتاج قنوات الموائع الدقيقة التي تحاكي فسيولوجيا حجم الأوعية الدموية الدقيقة (الشكل 1 أ). باستخدام تقنية التروية المحسنة ، تقوم الخلايا البطانية بعد ذلك بالبذور وزراعت السطح الداخلي بالكامل لنظام الموائع الدقيقة في غضون 24-48 ساعة من بذر الخلايا (الشكل 1 ب). نظرا لأن نظام الموائع الدقيقة شفاف ، يمكن وضع الجهاز الدقيق بالكامل على مرحلة مجهر المجال الساطع / الفلور للتصوير وجمع البيانات.

يمكن بعد ذلك تطبيق نظامنا لدراسة أمراض الدم التي تنطوي على خصائص فيزيائية حيوية متغيرة ، مثل مرض فقر الدم المنجلي ، حيث تساهم الصلابة المتزايدة للخلايا الحمراء المنجلية والتصاق الكريات البيض الشاذة والالتصاق البطاني في انسداد الأوعية الدموية الدقيقة. يعمل الدواء المعتمد سريريا ، هيدروكسي يوريا ، على تخفيف الأعراض ولكن تأثيره المباشر على تدفق الأوعية الدموية الدقيقة غير معروف. يأخذ فحصنا في الاعتبار صلابة الخلية والالتصاق ، ويوضح أن هيدروكسي يوريا يحسن بشكل كبير من التدفق في مرض فقر الدم المنجلي (الشكل 2).

مرض فقر الدم المنجلي هو مثال واحد فقط على تطبيق الأوعية الدموية الدقيقة على رقاقة ، حيث أن هذا النظام مناسب بشكل مثالي لدراسة أي عملية دموية تتفاعل فيها خلايا الدم مع بعضها البعض والخلايا البطانية في الأوعية الدموية الدقيقة. تشمل التطبيقات الأخرى ذات الصلة سريريا الاضطرابات الالتهابية ، والإنتان / إصابة الرئة ، واعتلال الأوعية الدقيقة الخثاري ، والملاريا ، والورم الخبيث للسرطان بينما تشمل التطبيقات الأساسية بيولوجيا الكريات البيض وبيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم ، من بين أشياء أخرى كثيرة.

figure-protocol-1
الشكل 1. أ) جهاز الموائع الدقيقة PDMS الأولي قبل البطانة. هنا ، يتم حقن الجهاز الدقيق بألوان الطعام لتوضيح الحجم والتصميم العام للنظام. ب) يظهر الفحص المجهري Brightfield أن نظام الموائع الدقيقة يتم إدخاله بالكامل في غضون 48 ساعة من بذر الخلايا باستخدام البروتوكول الموضح هنا.

figure-protocol-2
الشكل 2. أ) تقارب الأوعية الدموية الدقيقة على رقاقة مع قنوات دقيقة من حجم الأوردة بعد الشعيرات الدموية (30 ميكرومتر) ، وهي موقع معظم أحداث انسداد الأوعية الدموية الدقيقة للخلايا المنجلية. يتم تدفق الدم الكامل من مرضى فقر الدم المنجلي الذين يتلقون هيدروكسي يوريا ومن المرضى الذين لا يتلقون هيدروكسي يوريا من خلال جهازين مختلفين للأوعية الدموية الدقيقة على رقاقة. ب) الدم الكامل من مرضى فقر الدم المنجلي الذين يتلقون هيدروكسي يوريا يتدفق بسهولة نسبية داخل القنوات الدقيقة البطانية. ج) في ظل نفس الظروف الديناميكية الدموية ، فإن الدم الكامل من مرضى فقر الدم المنجلي الذين لا يتلقون هيدروكسي يوريا ، ومع ذلك ، يظهر تدفقا بطيئا أكثر بكثير مع انسداد القنوات الدقيقة. يتم إعاقة القناة السفلية تماما بدون تدفق وتكون سرعات التدفق في القنوات الدقيقة البطانية الأخرى أقل بكثير مما هي عليه في حالة هيدروكسي يوريا. شريط المقياس في الصور الثلاث هو 30 ميكرومتر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد نظام الأجهزة الدقيقة البطاني الخاص بنا هو الأنسب عند استخدامه جنبا إلى جنب مع التجارب في الجسم الحي ، وقد يساعد نهجه الاختزالي في توضيح الآليات الفيزيائية الحيوية لعمليات الدم التي يتم ملاحظتها في البشر والنماذج الحيوانية. علاوة على ذلك ، فإن نظامنا لا يخلو من القيود. على سبيل المثال ، قنواتنا الدقيقة مربعة في المقطع العرضي. على الرغم من أنه يمكن تصنيع القنوات الدقيقة الدائرية تقنيا10،11 ، فقد اخترنا استخدام إجراء تصنيع أكثر بساطة وقياسية للسماح للباحثين الآخرين بتطبيق هذا النظام بسهولة على عملهم ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر T. Hunt و M. Rosenbluth و Lam Lab على نصائحهم ومناقشاتهم المفيدة. نحن نقدر الدعم المقدم من G. Spinner ومعهد الإلكترونيات وتكنولوجيا النانو في معهد جورجيا للتكنولوجيا. تم تقديم الدعم المالي لهذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة K08-HL093360 ، وجائزة UCSF REAC ، وجائزة مركز تطوير الطب النانوي للمعاهد الوطنية للصحة PN2EY018244 ، وتمويل من مركز بيولوجيا الخلايا البطانية لرعاية الأطفال في أتلانتا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
إبرة نقطة حادةOK International920050-TEإبرة TE دقيقة 20 مقياس × 1/2 بوصة ،
ديكسترانSigma-Aldrich31392
FibronectinSigma-AldrichF0895
ثقب الثقب (ملزمة الدبوس)الابتكارات
الخلايا البطانية للحبل السري البشري (HUVECs)LonzaCC-2519
منظف البلازماالبلازماPDC-326
بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS)فيشر ساينتفيكNC9285739سيلجارد 184 سيليكون مطاط الصناعي كيت
سيجماكوتسيجما ألدريتشSL2
SU-8 2025ميكروكيمياءY111069
SU-8 مطورمضخة حقنة Y020100
هارفارد جهاز70-3008أنابيب PHD-ULTRA
(أكبر)شركة Cole-Parmer InstrumentCompany 06418-02أنابيب Tygonreg microbore ، 0.020 "معرف × 0.060" أنابيب OD
(أصغر)شركة Cole-Parmer InstrumentCompany 06417-11أنابيب PTFE microbore ، 0.012 "معرف × 0.030" OD
وردي التقنيةميكروكيمياء

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays. Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).
  2. Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
  3. Young, E. W. K., Simmons, C. A. Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology. Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).
  4. Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).
  5. Rosano, J. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
  6. Meer, A. D. vander, Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. Microfluidic Technology in Vascular Research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
  7. Karunarathne, W., Ku, C. -J., Spence, D. M. The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist. Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).
  8. Kotz, K. T. Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics. Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).
  9. Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).
  10. Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).
  11. Borenstein, J. Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate. Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).
  12. Nesbitt, W. S. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15, 665-673 (2009).
  13. Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
  14. Tsai, M. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).
  15. Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors. Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endothelialized MicrofluidicsMicrovascular InteractionsHematologic DiseasesPDMS Channel FabricationEndothelial Cell SeedingSyringe Pump PerfusionBrightfield MicroscopyConfocal MicroscopyBlood Cell DeformabilityLeukocyte Biology

Related Articles