يتم في هذا البحث وصف طريقة لاستزراع طبقة أحادية من الخلايا البطانية على كامل السطح الداخلي ثلاثي الأبعاد لجهاز مائعيات مجهرية يحتوي على قنوات بحجم الأوعية الدموية المجهرية (<30 μm). يتيح نموذج الأوعية الدموية المجهرية هذا in vitro دراسة التفاعلات الفيزيائية الحيوية بين خلايا الدم والخلايا البطانية والعوامل الذائبة في الأمراض الدموية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
Endothelialized على microfluidics لدراسة التفاعلات الاوعية الدموية الدقيقة في الأمراض الدموية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
لقد مكنت التطورات في تقنيات التصنيع الدقيق من إنتاج أنظمة مائعات دقيقة منخفضة التكلفة وقابلة للتكرار لإجراء التجارب البيولوجية والكيميائية الحيوية على المقاييس الدقيقة والنانوية 1,2. بالإضافة إلى ذلك، استُخدمت المائعات الدقيقة خصيصاً لتحليل العمليات الدموية والأوعية الدموية الدقيقة كمياً، وذلك لقدرتها على التحكم بسهولة في البيئة المائعية الديناميكية والظروف البيولوجية3-6. وبناءً على ذلك، استخدم الباحثون في الآونة الأخيرة أنظمة المائعات الدقيقة لدراسة قابلية تشوه خلايا الدم، وتجمع خلايا الدم، وتدفق الدم في الأوعية الدقيقة، والتفاعلات بين خلايا الدم والخلايا البطانية6-13. ومع ذلك، فإن أنظمة المائعات الدقيقة هذه إما أنها لم تتضمن خلايا بطانية مستزرعة أو كانت أكبر من مقياس الحجم ذي الصلة بالعمليات المرضية للأوعية الدموية الدقيقة. لذا، هناك حاجة إلى منصة مائعات دقيقة تحتوي على خلايا بطانية مستزرعة تحاكي بدقة البيئة الخلوية والفيزيائية والديناميكية الدموية للدورة الدموية الدقيقة، وذلك لتعزيز فهمنا للفيزيولوجيا المرضية الفيزيائية الحيوية الكامنة وراء الأمراض الدموية التي تشمل الأوعية الدموية الدقيقة.
نقدم هنا طريقة لإنشاء نموذج in vitro "مبطن بالخلايا البطانية" للأوعية الدموية الدقيقة، وذلك باستخدام عملية تصنيع دقيق بسيطة تعتمد على قناع واحد بالاقتران مع تقنيات زراعة الخلايا البطانية القياسية، لدراسة التفاعلات الفيزيائية الحيوية المرضية للأوعية الدقيقة التي تحدث في الأمراض الدموية. يوفر هذا "النظام الوعائي الدقيق على شريحة" للباحث مقايسة قوية تتحكم بدقة في الظروف البيولوجية والفيزيائية الحيوية، ويتم تشغيله باستخدام مضخة حقن قياسية ومجهر الحقل المضيء/الفلوري. ويمكن التحكم بسهولة في معايير مثل الظروف الديناميكية الدموية للدورة الدموية الدقيقة، ونوع الخلايا البطانية، ونوع (أو أنواع) وتركيز (أو تركيزات) خلايا الدم، وتركيز الدواء/المثبط، وغيرها. وبذلك، يوفر نظامنا الدقيق طريقة للتقصي الكمي للعمليات المرضية التي يضعف فيها تدفق الأوعية الدقيقة بسبب التغيرات في التصاق الخلايا وتجمعها وقابليتها للتشكل، وهي قدرة غير متوفرة في المقايسات الحالية.
البروتوكول
1. تصنيع الجهاز الميكروي البطاني
- قم بإنشاء قناع ضوئي عن طريق إرسال رسم تصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) للجهاز الموائع دقيقة إلى مورد أقنعة خارجي. يتكون القناع المستخدم من طبقة من الكروم على زجاج الصودا والجير. في هذه الحالة، كان عرض قناة الموائع الدقيقة 30 μm.
- نظف رقاقة سيليكون عارية باستخدام محلول بيرانا (بنسبة 10:1 من حمض الكبريتيك وبيروكسيد الهيدروجين) لمدة 15 دقيقة، ثم اغمرها في حمض الهيدروفلوريك لمدة 30 ثانية. اشطفها بالماء منزوع الأيونات (DI) لمدة 10 ثوانٍ تقريبًا.
- باستخدام جهاز طلاء دوار، قم بطلاء مادة المقاوم الضوئي Microchem SU-8 2025 على الرقاقة حتى يصل الارتفاع إلى 30 μm. بالنسبة لـ SU-8 2025، يوصى بسرعة دوران تبلغ 3000 rpm. تتوفر لزوجات أخرى من SU-8 يمكنها تحقيق هذا الارتفاع. تتوفر التعليمات الكاملة لاستخدام SU-8 على www.microchem.com
- ضع الرقاقة المطلية بـ SU-8 على لوح تسخين عند 95 °C لمدة 5 دقائق للتخلص من المذيب الزائد.
ملاحظة: سيؤدي التجفيف في الفرن إلى تجفيف الرقاقة بشكل مختلف عن اللوح الساخن، لذا لا يوصى به. - ضع القناع الذي يحتوي على شكل الميزة المطلوب فوق الرقاقة، وعرضها للأشعة فوق البنفسجية (160 mJ/cm2 مقاسة عند 365 nm) في جهاز محاذاة الأقنعة (Karl Suss, MA-6). تؤدي هذه العملية إلى ربط المقاوم الضوئي تشابكيًا.
- أعد وضع الرقاقة على لوح تسخين عند 95 °C لمدة 5 دقائق إضافية لتسريع بلمرة SU-8 بشكل أكبر.
- اغمر الرقاقة في محلول مُظهِّر SU-8، المكون أساسًا من PGMEA (بروبيلين جليكول ميثيل إيثر أسيتات) لمدة 4 دقائق لإزالة الـ SU-8 غير المترابط تشابكيًا.
- اشطف الرقاقة التي تم إظهارها حديثًا بكحول أيزوبروبيل (IPA) بتركيز 100% لمدة 10 s. يمكن بعد ذلك تجفيف الرقاقة باستخدام النيتروجين المضغوط أو عن طريق ترك المذيب يتبخر من الرقاقة في خزانة أبخرة نظيفة لعدة دقائق.
- ثبت حواف الرقاقة الجافة ذات نمط SU-8 في طبق بتري باستخدام شريط لاصق لمنع الحركة.
- ضع 1 mL من Sigmacote على الرقاقة باستخدام ماصة، وغطها بغطاء طبق البتري، وقم بتدوير الرقاقة لضمان تغطيتها بالكامل، ثم أزل الغطاء واترك الرقاقة تجف لعدة دقائق حتى يتبخر المذيب بالكامل.
2. تحضير الـ PDMS (بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان)
- امزج بوليمر PDMS وعامل المعالجة بنسبة 10:1 (وزن/وزن) وأزل فقاعات الهواء باستخدام مجفف فراغي. تختلف المدة الزمنية اللازمة لإزالة الغازات من PDMS بناءً على قوة نظام الفراغ المتاح، ولكنها تتراوح عادةً من عدة دقائق إلى ساعة واحدة. بالنسبة لطبق بتري مقاس ست بوصات لم يتم صب PDMS فيه مسبقاً، يوصى بحجم إجمالي قدره 60 mL من البوليمر.
- صب المزيج فوق الرقاقة، بسمك 10 mm تقريباً. صب أيضاً فوق طبق مسطح القاع لإنشاء ورقة رقيقة من PDMS، بسمك 1 mm تقريباً. تتم المعالجة عند 60 °C في فرن طوال الليل.
- باستخدام سكين أو مشرط، قص حول جهاز PDMS الذي تمت معالجته وأزله من الرقاقة. بالإضافة إلى ذلك، قص ورقة رقيقة من PDMS تكون أكبر قليلاً من الجهاز.
- اصنع ثقوب دخول وخروج في جهاز PDMS باستخدام ثاقبة ثقوب مقاس 1.0 mm. يمكن تحقيق ذلك باستخدام مثقاب يدوي صغير، أو Harris Uni-Core، أو جهاز مماثل.
- نظف أسطح الجهاز والورقة باستخدام شريط لاصق.
- باستخدام منظف بلازما، عرّض أسطح جهاز PDMS وورقة PDMS لبلازما الأكسجين لمدة 30 s. تخلق بلازما الأكسجين أنواعاً تفاعلية على السطح المكشوف لـ PDMS والتي تترابط عند التلامس المادي.
- وصل أنابيب أصغر بقطعة صغيرة (عدة سنتيمترات) من أنابيب كبيرة، والتي تتصل بدورها بمحقنة ذات إبرة ذات طرف غير مدبب، مملوءة بـ 50 μg/ml من fibronectin من بلازما بشرية في PBS. يتم اختيار حجم الأنابيب والإبرة بحيث يتم إنشاء تثبيت محكم بالاحتكاك بين الأنابيب. أدخل الأنابيب الأصغر في مدخل جهاز PDMS الدقيق واضغط على المحقنة لملء القنوات تماماً بمحلول fibronectin ولإنشاء قطرة صغيرة بحجم 100 μL عند فتحة المخرج، لضمان بقاء القنوات رطبة. قم بتحضين الجهاز عند 37 °C لمدة 40-60 min.
- وصل محقنة جديدة مملوءة بـ PBS بالإبرة ذات الطرف غير المدبب. اضغط على المحقنة لشطف الجهاز باستخدام PBS.
3. استزراع الجهاز الموائع الدقيقة بالخلايا البطانية
- قم بتحضير معلق بتركيز 1,000,000 cells/mL من الخلايا البطانية لوريد السرة البشري (HUVECs) في وسط نمو بطاني يحتوي على 8% dextran. وقد تم استخدام نطاق يتراوح من 500,000 إلى 2,000,000 cells/mL بنجاح. تؤدي إضافة dextran إلى وسط تحميل الخلايا إلى زيادة لزوجة السائل، مما يقلل من سرعة الخلايا البطانية أثناء دخولها إلى النظام الموائع الدقيقة المطلي بـ fibronectin. وهذا بدوره يزيد من احتمالية التصاق الخلايا واستنباتها بنجاح داخل الجهاز الدقيق.
- قم بتوصيل المحقنة والأنابيب الجديدة كما في الخطوة 2.7، ولكن باستخدام أنبوب أطول (بطول 1 متر تقريبًا).
- لتحسين أداء هذا النظام، من الضروري في هذه المرحلة منع حدوث أي تسرب أو تكون فقاعات في نظام التروية بالكامل؛ حيث إن أي تسرب للمحلول أو وجود فقاعات في الأوساط سيغير التدفق ويمنع الاستزراع الناجح للخلايا البطانية. لذلك، يعد الربط المحكم للأنابيب أمرًا أساسيًا للقضاء على التسريب بين أي توصيلات. يجب التخلص من الفقاعات في المحقنة و/أو الأنابيب قبل إدخال الخلايا في الجهاز الدقيق، كما يجب تحضير نظام التروية بالكامل بمحلول الخلايا قبل توصيل الأنابيب بجهاز الموائع الدقيقة لتجنب دخول فقاعات الهواء.
- باستخدام مضخة محقنة، قم بضخ معلق الخلايا في جهاز PDMS بمعدل تدفق حجمي قدره 1.23 μl/min لمدة ساعتين عند 37 °C و 5% CO2. تم تحقيق النتائج المثلى عندما كانت مضخة المحقنة في نفس مستوى ارتفاع جهاز PDMS. بالنسبة للمدخل، يضمن الأنبوب الأطول، الذي يمكن لفه داخل الحاضنة، تدفئة الخلايا والأوساط بشكل كافٍ قبل ملامستها للجهاز. في نظامنا، يقارب معدل التدفق الحجمي 1.23 μl/min سرعة تيار متوسطة تبلغ ~1 mm/s في أصغر القنوات الدقيقة، وهو ما يقابل إجهاد قص جداري يبلغ ~1 dyne/cm2 في تلك القنوات عند استخدام الدم الكامل.
- باستخدام نفس مضخة المحقنة والأنبوب الطويل، قم بتروية وسط نمو طازج لمدة تتراوح من 2 إلى 8 أيام بمعدل 1.23 μl/min. يتميز الجهاز الناجح بوجود طبقة أحادية من الخلايا البطانية تنمو على الجزء الداخلي من الجهاز خلال 24-48 ساعة. وقد أظهرت التجارب السابقة أن الطبقات الأحادية الملتئمة تعبر بشكل مناسب عن VE-cadherin عند الوصلات بين الخلايا في جميع أنحاء الجهاز14.
- احقن الدم أو معلق الخلايا في النظام لبدء التجربة.
4. النتائج التمثيلية
باستخدام هذا البروتوكول، تُستخدم تقنيات التصنيع الدقيق الليثوغرافي القياسية لإنشاء القالب اللازم لإنتاج القنوات الموائعية الدقيقة التي تحاكي فسيولوجياً المقياس الحجمي للأوعية الدموية الدقيقة (الشكل 1A). وباستخدام تقنية تروية محسنة، يتم بعد ذلك استزراع الخلايا البطانية لتغطي بشكل متلاحم كامل السطح الداخلي للنظام الموائعي الدقيق في غضون 24-48 ساعة من استزراع الخلايا (الشكل 1B). وبما أن النظام الموائعي الدقيق شفاف، يمكن وضع الجهاز الدقيق بالكامل على منصة مجهر الحقل المضيء/الفلوري للتصوير وجمع البيانات.
يمكن بعد ذلك تطبيق نظامنا لدراسة الأمراض الدموية التي تتضمن تغيرات في الخصائص الفيزيائية الحيوية، مثل مرض الخلايا المنجلية، حيث تساهم الصلابة المتزايدة لكريات الدم الحمراء المنجلية والالتصاق غير الطبيعي لكريات الدم البيضاء والخلايا البطانية في حدوث انسداد الأوعية الدقيقة. ويقوم دواء hydroxyurea، المعتمد سريريًا، بتخفيف الأعراض ولكن تأثيره المباشر على تدفق الأوعية الدقيقة لا يزال غير معروف. يأخذ اختبارنا في الاعتبار كلاً من صلابة الخلايا والالتصاق، ويُظهر أن hydroxyurea يحسن التدفق بشكل ملحوظ في مرض الخلايا المنجلية (الشكل 2).
يُعد مرض فقر الدم المنجلي مجرد مثال واحد على تطبيقات رقاقة الأوعية الدموية الدقيقة، حيث أن هذا النظام ملائم تماماً لدراسة أي عملية دموية تتفاعل فيها خلايا الدم مع بعضها البعض ومع الخلايا البطانية في الأوعية الدموية الدقيقة. وتشمل التطبيقات الأخرى ذات الصلة سريرياً الاضطرابات الالتهابية، وإصابات الرئة الناجمة عن إنتان الدم، واعتلالات الأوعية الدقيقة التخثرية، والملاريا، وانتقال السرطان، بينما تشمل التطبيقات الأساسية بيولوجيا الكريات البيضاء وبيولوجيا الخلايا الجذعية المكونة للدم، من بين العديد من التطبيقات الأخرى.
الشكل 1. أ) جهاز الموائع الدقيقة المصنوع من PDMS قبل عملية التبطين الغشائي. هنا، تم حقن الجهاز الدقيق بملون طعام لتوضيح مقياس الحجم والتصميم العام للنظام. ب) يُظهر المجهر ذو المجال المضيء أن نظام الموائع الدقيقة قد تمت عملية تبطينه الغشائي بالكامل خلال 48 ساعة من استزراع الخلايا باستخدام البروتوكول الموصوف هنا.
الشكل 2. أ) شريحة الأوعية الدموية الدقيقة (microvasculature-on-a-chip) التي تحتوي على قنوات مجهرية تقارب في حجمها الوريدات التالية للشعيرات الدموية (30 μm)، وهي الموقع الذي تحدث فيه معظم حالات انسداد الأوعية الدقيقة في مرضى فقر الدم المنجلي. يتم تمرير دم كامل من مرضى فقر الدم المنجلي الذين يتلقون عقار hydroxyurea ومن مرضى لا يتلقون hydroxyurea عبر جهازين مختلفين من شرائح الأوعية الدموية الدقيقة. ب) يتدفق الدم الكامل من مرضى فقر الدم المنجلي الذين يتلقون hydroxyurea بسهولة نسبية داخل القنوات المجهرية المبطنة بالخلايا البطانية. ج) تحت نفس الظروف الهيموديناميكية، يظهر الدم الكامل من مرضى فقر الدم المنجلي الذين لا يتلقون hydroxyurea تدفقًا أكثر بطئًا مع حدوث انسداد في القنوات المجهرية. القناة السفلية مسدودة تمامًا ولا يوجد بها تدفق، كما أن سرعات التدفق في القنوات المجهرية المبطنة بالخلايا البطانية الأخرى أقل بكثير مما هي عليه في حالة استخدام hydroxyurea. يمثل شريط المقياس في الصور الثلاث 30 μm.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يعد نظام الجهاز الدقيق المبطن بالخلايا البطانية لدينا هو الأكثر ملاءمة عند استخدامه بالتزامن مع التجارب in vivo، وقد يساعد نهجه الاختزالي في توضيح الآليات الفيزيائية الحيوية للعمليات الدموية التي تُلاحظ في البشر والنماذج الحيوانية. وعلاوة على ذلك، فإن نظامنا لا يخلو من القيود؛ فعلى سبيل المثال، تتخذ القنوات الموائعية الدقيقة لدينا مقطعاً عرضياً مربعاً. وبالرغم من إمكانية تصنيع قنوات دقيقة دائرية من الناحية التقنية10,11، إلا أننا اخترنا استخدام إجراء تصنيع أكثر بساطة ومعيارية لتمكين الباحثين الآخرين من...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نتوجه بالشكر إلى T. Hunt و M. Rosenbluth ومختبر Lam على مشورتهم ومناقشاتهم المفيدة. كما نقدر الدعم المقدم من G. Spinner ومعهد الإلكترونيات وتقنية النانو في معهد جورجيا للتكنولوجيا. تم تقديم الدعم المالي لهذا العمل من خلال منحة NIH رقم K08-HL093360، وجائزة UCSF REAC، وجائزة مركز تطوير الطب النانوي التابع لـ NIH رقم PN2EY018244، وتمويل من مركز بيولوجيا الخلايا البطانية في رعاية الأطفال الصحية في أتلانتا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| إبرة ذات سن غير مدبب | OK International | 920050-TE | إبرة Precision TE مقاس 20 Gauge x 1/2"، وردية |
| ديكستران | Sigma-Aldrich | 31392 | |
| فيبرونيكتين | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| خارمة ثقوب (منجلة دقيقة) | Technical Innovations | ||
| خلايا بطانية من الحبل السري البشري (HUVECs) | Lonza | CC-2519 | |
| جهاز تنظيف بالبلازما | Plasma | PDC-326 | |
| بوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) | Fisher Scientific | NC9285739 | طقم Sylgard 184 Silicone Elastomer KIT |
| سيجماكوت | Sigma-Aldrich | SL2 | |
| SU-8 2025 | Microchem | Y111069 | |
| مظهر SU-8 | Microchem | Y020100 | |
| مضخة حقنة | Harvard Apparatus | 70-3008 | PHD-ULTRA |
| أنابيب (أكبر) | Cole-Parmer Instrument Company | 06418-02 | أنابيب Tygonreg microbore، قطر داخلي 0.020" x قطر خارجي 0.060" |
| أنابيب (أصغر) | Cole-Parmer Instrument Company | 06417-11 | أنابيب PTFE microbore، قطر داخلي 0.012" x قطر خارجي 0.030" |
المراجع
- Mezzano, D., Quiroga, T., Pereira, J. The Level of Laboratory Testing Required for Diagnosis or Exclusion of a Platelet Function Disorder Using Platelet Aggregation and Secretion Assays. Semin. Thromb. Hemost. 35, 242-254 (2009).
- Young, E. W. K., Beebe, D. J. Fundamentals of microfluidic cell culture in controlled microenvironments. Chemical Society Reviews. 39, 1036-1048 (2010).
- Young, E. W. K., Simmons, C. A. Macro- microscale fluid flow systems for endothelial cell biology. Lab on a Chip. 10, 143-160 (2010).
- Higgins, J. M., Eddington, D. T., Bhatia, S. N., Mahadevan, L. Sickle cell vasoocclusion and rescue in a microfluidic device. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 20496-20500 (2007).
- Rosano, J. A physiologically realistic in vitro model of microvascular networks. Biomedical Microdevices. 11, 1051-1057 (2009).
- Meer, A. D. vander, Poot, A. A., Duits, M. H. G., Feijen, J., Vermes, I. Microfluidic Technology in Vascular Research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Karunarathne, W., Ku, C. -J., Spence, D. M. The dual nature of extracellular ATP as a concentration-dependent platelet P2X1 agonist and antagonist. Integrative Biology. 1, 655-663 (2009).
- Kotz, K. T. Clinical microfluidics for neutrophil genomics and proteomics. Nat. Med. 16, 1042-1047 (2010).
- Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry. Lab on a Chip. 8, 1062-1070 (2008).
- Shelby, J. P., White, J., Ganesan, K., Rathod, P. K., Chiu, D. T. A microfluidic model for single-cell capillary obstruction by Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14618-14622 (1073).
- Borenstein, J. Functional endothelialized microvascular networks with circular cross-sections in a tissue culture substrate. Biomedical Microdevices. 12, 71-79 (2010).
- Nesbitt, W. S. A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation. Nat. Med. 15, 665-673 (2009).
- Prabhakarpandian, B., Shen, M. -C., Pant, K., Kiani, M. F. Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature. Microvascular Research. 82, 210-220 (2011).
- Tsai, M. In vitro modeling of the microvascular occlusion and thrombosis that occur in hematologic diseases using microfluidic technology. The Journal of Clinical Investigation. , Forthcoming (2011).
- Green, D. A., Murphy, W. G., Uttley, W. S. Haemolytic uraemic syndrome: prognostic factors. Clinical & Laboratory Haematology. 22, 11-14 (2000).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
