يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في

46.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/4056

⸱

نوفمبر 12, 2012

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 2Banting and Best Department of Medical Research, Donnelly Centre, University of Toronto, 3Department of Biochemistry, Research and Innovation Centre, University of Regina

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

ويمكن استخدام منهجية واسعة النطاق الاصطناعية الوراثية شاشات التفاعل (الجينات الجين أو قشوة) لاستكشاف التكرار الجيني وعبر مسار الحديث. ووصف eSGA هنا، نحن تصف عالية الإنتاجية الكمية الاصطناعية الفحص الجيني مجموعة التكنولوجيا، التي قمنا بتطويرها لتوضيح العلاقات واستكشاف روكبي شبكات التفاعل الوراثية في كولاي.

الملخص

تتحدد الأنماط الظاهرية بواسطة سلسلة معقدة من التفاعلات الفيزيائية (على سبيل المثال بروتين-بروتين) والوظيفية (على سبيل المثال جين-جين أو وراثية) (GI)1. وبينما يمكن للتفاعلات الفيزيائية أن تشير إلى البروتينات البكتيرية المرتبطة كمعقدات، إلا أنها لا تكشف بالضرورة عن العلاقات الوظيفية على مستوى المسارات1. ويمكن لعمليات فحص التفاعلات الجينية (GI screens)، والتي يتم فيها قياس نمو الطفرات المزدوجة التي تحمل جينين محذوفين أو غير نشطين ومقارنتها بالطفرات الفردية المقابلة، أن تسلط الضوء على الاعتمادات فوق الجينية (epistatic dependencies) بين المواقع الكروموسومية، وبالتالي توفر وسيلة لاستقصاء واكتشاف علاقات وظيفية جديدة2. وقد تم الإبلاغ عن خرائط GI واسعة النطاق للكائنات حقيقية النواة مثل الخميرة3-7، ولكن تظل معلومات GI شحيحة بالنسبة لبدائيات النواة8، مما يعيق التوصيف الوظيفي للجينومات البكتيرية. وتحقيقاً لهذه الغاية، قمنا ونحن وآخرون بتطوير طرق فحص كمية عالية الإنتاجية للتفاعلات الجينية البكتيرية9, 10.

نقدم هنا الخطوات الأساسية المطلوبة لإجراء عملية فحص مصفوفة الجينات الاصطناعية الكمية (eSGA) لبكتيريا E. coli على نطاق الجينوم9، وذلك باستخدام الاقتران البكتيري الطبيعي وإعادة التركيب المتماثل لتوليد وقياس لياقة أعداد كبيرة من الطفرات المزدوجة بشكل منهجي في تنسيق مصفوفة مستعمرات. وباختصار، يتم استخدام روبوت لنقل أليلات طافرة موسومة بالكلورامفينيكول (Cm) من "سلالات مانحة" Hfr (عالية تكرار إعادة التركيب) مهندسة، عبر الاقتران، إلى مصفوفة مرتبة من السلالات المستقبلة F- الموسومة بالكاناميسين (Kan). وعادةً ما نستخدم طفرات مفردة باعثة لفقدان الوظيفة تحمل عمليات حذف لجينات غير أساسية (على سبيل المثال مجموعة "Keio"11) وطفرات نقصية (hypomorphic) لجينات أساسية (أي أليلات تمنح تعبيراً بروتينياً أو استقراراً أو نشاطاً منخفضاً9, 12, 13) لاستقصاء الارتباطات الوظيفية للجينات غير الأساسية والأساسية، على التوالي. وبعد الاقتران والتبادل الجيني اللاحق الذي يتم بوساطة إعادة التركيب المتماثل، يتم انتخاب الطفرات المزدوجة الناتجة على وسط صلب يحتوي على كلا المضادين الحيويين. وبعد النمو، يتم تصوير الأطباق رقمياً وتقييم أحجام المستعمرات كمياً باستخدام نظام آلي لمعالجة الصور مطور داخلياً14. وتنكشف التفاعلات الجينية (GIs) عندما يكون معدل نمو الطفرة المزدوجة إما أفضل أو أسوأ بكثير مما هو متوقع9. وغالباً ما تنتج التفاعلات الجينية المفاقمة (أو السلبية) بين طفرات فقدان الوظيفة في أزواج من الجينات من مسارات تعويضية تؤثر على نفس العملية الأساسية2. وفي هذه الحالة، يتم تخفيف فقدان جين واحد، بحيث تكون أي من الطفرات المفردة قابلة للحياة. ومع ذلك، فإن فقدان كلا المسارين يكون ضاراً ويؤدي إلى فتك اصطناعي أو اعتلال (أي نمو بطيء). وعلى العكس من ذلك، يمكن أن تحدث تفاعلات مخففة (أو إيجابية) بين الجينات في نفس المسار أو المعقد البروتيني2، حيث يكون حذف أي من الجينين بمفرده كافياً في كثير من الأحيان لتعطيل الوظيفة الطبيعية للمسار أو المعقد بحيث لا تؤدي الاضطرابات الإضافية إلى تقليل النشاط، وبالتالي النمو، بشكل أكبر. وبشكل عام، يمكن أن يوفر التحديد والتحليل المنهجي لشبكات التفاعلات الجينية خرائط عالمية غير منحازة للعلاقات الوظيفية بين أعداد كبيرة من الجينات، والتي يمكن من خلالها استنتاج معلومات على مستوى المسار قد تغفل عنها النهج الأخرى9.

البروتوكول

1. بناء سلالات HFR المانحة كافالي المسخ بواسطة Recombineering 15 و 16

يتم وصف الخطوات لبناء البقع المانحة eSGA أدناه. لفترة وجيزة، ونحن نستخدم λ المستهدفة - الأحمر توسط إعادة التركيب مثلي 16 من تضخيم الحمض النووي كاسيت اختيار علامة الشظايا الناتجة من PCR لخلق طفرات غير الضرورية حذف الجينات (القسم 1.1) أو الجينات الأساسية hypomorphic سلالات متحولة المانحة (القسم 1.2) التي يتم استخدامها بعد ذلك "الاستعلامات" لتحديد شبكات GI.

ملاحظة: خلال عملية تطوير التكنولوجيا، ونحن تقييم فعالية استخدام HFR بوساطة نقل conjugative للجمع بين الطفرات باستخدام المانحة HFR واضحة المعالم سلالة (HFR كافالي، هايز HFR، وHFR 3000). درسنا (ط) القدرة على اتخاذ بكفاءة المسوخ المانحة باستخدام طريقة recombineering رائدها يو وآخرون. (2000) 16، (الثاني) والكفاءة النسبيةنقل DNA من علامات conjugative الكروموسومات المختلفة، و (الثالث). آثار موقف الجينات الصبغية الاستعلام والتوجيه بالنسبة للمكان نقل HFR، أوريت وجدنا أن λ - الأحمر بوساطة كفاءة إعادة التركيب مثلي كان أعلى من ذلك بكثير في كافالي HFR من HFR في هايز أو Hfr3000. إذا لزم الأمر، يمكن استخدام تنبيغ P1 أو سلالة HFR الزائف 17، الجهات المانحة لإنشاء متحولة. تكيفنا بنجاح جميع هذه الطرق لصنع وفرز أعداد كبيرة من المانحين. منذ تجاربنا في تصريف المحاكمة، الكفاءة العامة للنقل وعدد من السابقين لاحظ conjugants كان أكبر بكثير مع كافالي HFR، وقد تم اختيار هذه الخلفية سلالة معينة للبناء المانحة وeSGA على نطاق واسع. يتم وصف كل الإجراءات لشاشات eSGA باستخدام HFR المانحين كافالي.

  1. تضخيم الحمض النووي للجزء recombineering بعد حذف الجينات غير الضرورية
    توظيف خطوتين متداخلة PCR AMPLIfication (الشكل 1) لإنشاء راديو كاسيت حذف الجينات لاستبدال الإطار الهدف القراءة مفتوحة مع علامة المقاومة سم من البلازميد pKD3 و(GI: 15554330؛ معرف البروتين: AAL02033.1) 15. ويحيط علامة ال 11 من FRT مواقع بجواز عزل الجين المقاومة، إذا لزم الأمر، في متابعة التجارب.
    ملاحظة: نحن لا تتداخل خطوتين PCR لإزالة بلازميد من المنتج تضخيم يستخدم فيما بعد لتحويل الخلايا البكتيرية. إزالة بلازميد (PCR في الأولى) وإنشاء ثم كاسيت خروج المغلوب الجينات في PCR ثان ضروري لأن التحول بلازميد مع أكثر فاعلية من recombineering، والهدف من ذلك هو الحصول على - قدر الإمكان - سلالات فقط التي لديها استبدال بنجاح الحمض النووي الجيني المستهدفة مع علامة اختيار. بديل لPCR المتداخلة هو لأداء خلاصة القيد من خارج المنطقة البلازميد تضخيم PCR في 2الخطوة. ثم يتم تنقيته من المنتجات من هضم وتقييد استخدام كقالب في الخطوة PCR المتداخلة (1.1.2). هذا الخيار هو أيضا بسيطة، ولكنها تتطلب المزيد من العمل وقتا.
    1. استخدام حوالي 45 نانوغرام من pKD3 كقالب في PCR مع الاشعال R1 F1 إلى الأمام وعكس لإنتاج منتج BP 1070. تنقية جزء PCR PCR باستخدام تنقية QIAGEN البروتوكول، وتمييع المنتج في الماء المقطر المعقم إلى 5 نانوغرام / ميكرولتر التركيز.
    2. استخدام المنتج PCR تنقية كقالب، إعداد PCR الثاني مع الاشعال (مثل خروج المغلوب) الجينات المحددة متداخلة، F2 وR2، التي لديها (ط) 45 NT من المناطق التماثل الجيني محددة في نهايات-5'للسماح لإعادة التركيب مثلي المنبع والمصب على الفور من الجين المستهدف ليحل محله مع علامة المقاومة سم و(الثاني) الإقليم الشمالي 20 في نهايات 3'-لرئيس تجميع للعلامة سم. حجم إنتاج جزء هو 1123 سنة مضت. تم تصميم مناطق محددة تماثل الجينات لإزالة المرجع الهدفEN قراءة الإطار مع ترك أي قطاعات متجاورة أو متداخلة جزئيا الترميز سليمة. بعد هذا التضخيم، انتقل إلى الخطوة 1.3.
  2. تضخيم شريط علامات لخلق طفرة جينية أساسية hypomorphic
    1. لبناء سلالات متحولة hypomorphic المانحة، إضافة محطة C-متتابعة الببتيد تقارب العلامة الانصهار (SPA)، والتي غالبا ما تؤثر قليلا الأساسية وظيفة البروتين من وفرة نص زعزعة الاستقرار (أي عدد النسخ البروتين) أو البروتين للطي / النشاط. تحقيقا لهذه الغاية، إنشاء قالب DNA اختيار SPA-علامة (SPA-CM) عن طريق تحويل علامة المقاومة في اساسه pJL148 18 إلى سم باستخدام تسلسل النوكليوتيدات recombineering بين متطابقة المرافقة علامة اساسه في pJL148 وعلامة سم في pKD3 15. القالب الناتج يتكون من في الإطار TAG-SPA تليها علامة المقاومة سم، ومناسبة لالتضخيم PCR، eSGA recombineering واللاحقة 12.
      ملاحظة: </ STRONG> الجينات الأساسية يمكن أن تكون الأكثر إثارة للاهتمام للدراسات وظائف الجينات. ومع ذلك، لأنه لا يمكن حذف هذه الجينات، كان أساليب مبتكرة لتوضع للتحقيق العلاقات الوظيفية من الجينات الأساسية. وقد وضعت عدة نهج مناسبة ناجحة للغاية في البداية في الخميرة. على سبيل المثال، Davierwala وآخرون. العثور على (2005) 19 شاشات GI تنفيذها باستخدام لوحة من 575 حساسة للحرارة المسوخ الجينات الأساسية، وأن الجينات الأساسية معارضها حول عدد من الجنود خمس مرات والجينات غير الضرورية. وبالمثل، بريسلو وآخرون. (2008) 20 وضعت 'فرة بنسبة اضطراب مرنا' (الخام) نهج لإنشاء مكتبة من الأليلات hypomorphic تغطي ~ 82٪ من الجينات الخميرة الأساسية لدراسة مسارات والمجمعات. النهج رطبة تعديل 3'end من مرنا وأعرب، خفض مستوى الجين الهدف 6، من المحتمل بسبب مرنا زعزعة الاستقرار. على غرار النهج رطبة 6، الاستراتيجيه لديناكان ذ لاستغلال الآثار الخفية للاحداث بلبلة نهاية 3 'من مرنا وأعرب البروتينات الأساسية.
      كما وصفنا أدناه، علامة في حد ذاته لا يؤثر على الأرجح للطي البروتين أو وظيفة، ولكن اضطراب خفية من مرنا من قيمة البطاقة هي كافية، وعندما يقترن الضغوطات البيئية أو غيرها من الطفرات، لتكشف وظيفيا بالمعلومات الجينات والبيئة 13 و الجين الجينات 9 و 12 التفاعلات.
      أولا، حتى الآن، كنا SPA-به لتنقية ~ 3000 كولاي الأساسية وغير الأساسية البروتينات 21-23، مع أكثر من 80٪ من كولاي التي يمثلها 307 البروتينات الضرورية بين سلالات لدينا SPA-الموسومة 8. لانه كان يستخدم بنجاح العلامة لعزل بروتين يعرف المجمعات التي تم التحقق من صحتها بشكل متبادل (أي يمكن عزل نفسه عن طريق وضع علامات معقدة وتنقية البروتينات المختلفة من داخل المجمع نفسه)، ومجمعات معزولة وذات الصلة بيولوجيا، ونحن السبب في أن العلامات فعللا يؤثر عادة طي البروتين أو وظيفة 12. وبالمثل، كشفت ملاحظاتنا غير منشورة أن العلامة في حد ذاته لا يؤثر عادة نمو السلالة. ومع ذلك، نحن مسبب أن تغيير 3'-UTR من خلال دمج العلامة والعلامة الكاسيت، كما ذكرت لسلالات رطبة 6، قد تؤدي إلى زعزعة بعض النصوص على مستوى RNA أو، في حالات نادرة، وتعوق قابلة للطي مناسبة أو وظيفة الانصهار البروتينات. ولذلك، توقعنا أن الجمع بين هذه مضطرب الأليلات من الجينات الضرورية مع الطفرات الأخرى ذات الصلة وظيفيا في أي مكان آخر في الجينوم من شأنه أن يؤدي في نظم المعلومات الجغرافية بالمعلومات، التي كانت في الواقع لوحظ 9 و 12. عرض الأليلات وعلاوة على ذلك، SPA-الموسومة من الجينات الضرورية الجينات والبيئة التفاعلات (على سبيل المثال المخدرات فرط الحساسية) وفقا لأعمال التنميط المظهري من نيكولز وآخرون. (2011) 13، الذي تعرض مجموعة فرعية من SPA-الموسومة سلالات أساسية لمجموعة متنوعة من ظروف النمو. ويتأكد نفس الدراسةد أن معظم (54 من أصل 58 اختبار) SPA-الموسومة أظهرت السلالات الأساسية للياقة البدنية في ظروف ضعف ثقافة واحدة أو أكثر 13، مما يدعم فكرة أن في كثير من الأحيان علامة SPA-يخلق الأليلات hypomorphic معتدل في الجينات الأساسية التي هي مفيدة للالجينوم على نطاق تطبيقات الشاشة GI بما في ذلك eSGA.
    2. تضخيم علامات كاسيت من القالب SPA-CM باستخدام الجينات محددة الاشعال S1 و S2، تحتوي كل منها على (ط) من 45 NT الجينات المحددة للمنطقة recombineering مثلي في نهاية 5 '، تليها (الثاني) في 27 BP-SPA تسلسل محدد الطول في نهاية 3 '.
  3. مؤكدا وتنقية المنتج PCR
    1. تأكيد أنه تم تضخيم بشكل صحيح كاسيت علامات بإخضاع 2-5 ميكرولتر من المنتج PCR لهلام الاغاروز الكهربائي وتنقية DNA المتبقية بعد بروتوكول الشركة المصنعة معيار تنقية PCR (QIAGEN). أزل المنتج PCR في 30 ميكرولتر من الماء المقطر المعقم وتمييع لنانوغرام 50 ~ / ميكرولتر التركيز. وpurifiويمكن استخدام المنتج على الفور في إد التحول (الخطوة 1.5) أو تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر حتى الاستخدام.
  4. إعداد HFR الخلايا كافالي المختصة للبناء المانحة
    1. تطعيم واحد مل من ثقافة ليلة وضحاها من سلالة المشبعة كافالي HFR في 70 مل من المتوسط ​​الطازجة (LB) لوريا Bertani-مع 35 ميكرولتر من 50 ميكروغرام الأمبيسلين مل / في قارورة 250 مل. احتضان الثقافة في C ° 32 مع اهتزاز في 220 دورة في الدقيقة حتى في كثافة الضوئية (OD) 600 نيوتن متر من ~ 0،5-0،6 يتم الحصول على (~ 2 ساعة).
    2. نقل الثقافة إلى حمام الماء لتحريض حرارة إعادة التركيب λ نظام الحمراء 16 في 42 ° C لمدة 15 دقيقة مع اهتزاز عند 160 دورة في الدقيقة. وقف التحريض عن طريق نقل الثقافة إلى حمام الماء المبرد الثلج لمدة 10-20 دقيقة الطين في 160 دورة في الدقيقة. تأكد للحفاظ على الخلايا الباردة من هذه النقطة حتى بعد التحول؛ أنابيب واستخدام cuvettes التي تم برود على الجليد لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام.
    3. تقسيم جulture على قدم المساواة إلى 2 قبل المبردة 50 مل أنابيب البولي بروبلين (~ الثقافة مل 35 في أنبوب) وأجهزة الطرد المركزي في 4400 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. تجاهل طاف، وإعادة تعليق بيليه الخلية عن طريق انعكاس لطيف في ~ 50 مل من الماء المقطر الجليد الباردة المعقمة. أجهزة الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 4400 x ج لمدة 6 دقائق في C. ° 4 تجاهل طاف واعادة تعليق كل بيليه خلية في 20 مل من الجلسرين العقيمة الجليد الباردة 10٪ وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى كما هو موضح أعلاه.
    5. صب طاف وإعادة تعليق بيليه الخلية في 500 ميكرولتر من الجليد الباردة الجلسرين 10٪. قسامة الخلايا المعدة المختصة في 50 مجلدا ميكرولتر إلى الفردية، قبل المبردة 1،5 أنابيب الطرد المركزي الصغيرة مل للتحول فورا. قد يتم تجميد الخلايا على الثلج الجاف أو النتروجين السائل في وتخزينها في -80 ° C لمدة تصل إلى 3 أشهر. ومع ذلك، وكفاءة التحول هو أعلى مع الخلايا المختصة الطازجة.
  5. تحول
    1. إضافة 100 نانوغرام من الناتج PCR تنقيته منالخطوة 1.3.1 إلى الخلايا المختصة. نفض الغبار الأنبوب والسماح التعليق على الجلوس على الجليد لمدة 5 دقائق.
    2. نقل التعليق من الجليد الباردة الخلايا المختصة وDNA إلى كوفيت الصعق الكهربائي قبل مبردة. Electroporate خليط الخلية التي تحتوي على كيلو فولت 2.5، المكثف 25، 200 أوم وضع في كوفيت ملم الفجوة 2 (أي إذا باستخدام كوفيت مختلفة، الرجاء راجع إرشادات الشركة المصنعة للإعدادات الصعق الكهربائي)، وعلى الفور إضافة 1 مل من درجة حرارة الغرفة SOC المتوسط. نقل الخلايا electroporated في المتوسط ​​SOC في أنبوب 15 مل الثقافة واحتضان في C ° 32 لمدة 1 ساعة مع الهز المدارية في 220 دورة في الدقيقة.
    3. بعد الحضانة، أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 4400 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إزالة نحو 850 ميكرولتر من طاف، وإعادة تعليق بيليه خلية في السائل المتبقي.
    4. تنتشر الخلايا LB على لوحات قبل تحسنت تحتوي على 17 ميكروغرام / مل سم، واحتضان عند 32 درجة مئوية خلال الليل. اختيار اثنين من المستعمرات transformant الفردية ومسحة من على LBسم لوحات لتأكيد متحولة. نوصي تجنب المستعمرات أكبر transformant من أجل الحد من إمكانية اختيار سلالات نادرة مع الطفرات القامع. أيضا في خط transformants نفسه على اساسه-LB للتأكد من أن السلالات المقاومة ليست اساسه.
      ملاحظة: بما أن يتم استخدام العلامة المقاومة سم لجعل سلالات المانحة، ونحن لا نتوقع أن تكون المسوخ المانحة اساسه مقاومة. من streaking وtransformants على حد سواء اساسه-LB LB-وحات وسم، علينا أن نضمن أن الطفرة نفسها المانحة لم يتسبب إلى حد ما اساسه المقاومة. إذا لم تكن تنفيذ هذه الخطوة والطفرات المستهدفة كانت لتؤثر على قدرة سلالة من أجل البقاء على اساسه، لن تكون المسوخ مزدوجة الاستخدام الفعال eSGA منذ سلالات المانحة سيبقى على قيد الحياة جميع الخطوات الاختيار. هذا هو مجرد خطوة احترازية منطقية للقبض على الظواهر غير متوقعة أو أي قضايا أخرى قد تتداخل مع الانتهاء من شاشات eSGA. إذا تم تخطي هذه الخطوة، عوا عناصر التحكم الأخرىد تحديد تزال شاشات الفاشلة. ومع ذلك، فإن وجود كشف في وقت سابق من إحدى الجهات المانحة التي هي مقاومة للقضاء على اساسه سلسلة من الخطوات غير المنتجة وغير ضرورية. انتهت الأسباب المحتملة الأخرى لسلالة لتنمو على اساسه يمكن أن تشمل على سبيل المثال المضادات الحيوية وكذلك استخدام منتج PCR الخطأ أو سلالة لهذا التحول. ويمكن تحديد كل هذه القضايا والتعامل معها في وقت مبكر من الإجراء مع المعونة من هذه السيطرة، والتي ليست مطلوبة، ولكنها أوصت لeSGA.
  6. تأكيد الحذف الجينات غير الضرورية (الخطوة 1.6.1) أو طفرة جينية أساسية hypomorphic (القسم 1.6.2)
    ملاحظة: عندما يؤكد حذف الجينات بواسطة PCR، ينبغي استخدام الحمض النووي الجيني من سلالة النوع البري كمجموعة تحكم.
    1. مؤكدا غير الضرورية حذف الجينات
      1. لتأكيد الحذف من الجينات PCR، عزل الحمض النووي الجيني من تحول، سلالات خروج المغلوب المفترضة نمت في المتوسط ​​LB-CM السائل، وبعد التصنurer في التعليمات (Promega).
      2. لتأكيد recombineering ناجحة، تضخيم الحمض النووي من كل transformant مع ثلاث مجموعات مختلفة من الاشعال تأكيد خروج المغلوب. أداء التفاعلات مع نانوغرام 150 ~ من قالب الحمض النووي الجيني، وتأكيد أحجام جزء الصحيح عن طريق تشغيل المنتجات PCR-توليفها على هلام الاغاروز.
      3. مجموعة التمهيدي الأول يتكون من 20 مادة اولية NT-المرافقة، على بعد 200 BP المنبع من المنطقة المستهدفة (KOCO-F)، وسم التمهيدي-R، والذي هو مكمل للتسلسل كاسيت سم. ومن المتوقع هذا التضخيم لإنتاج AMPLICON NT 445 في متحولة، ولكن ليس في النوع البري سلالة (الشكل 1).
      4. المجموعة الثانية تضم التمهيدي إلى الأمام (سم-F)، الصلب للتسلسل كاسيت سم، والعكس 20-NT المرافقة التمهيدي تأكيد (KOCO-R)، الذي يهدف إلى يصلب 200 المصب بي بي نهاية 3 'من حذف الجينات. ومن المتوقع رد الفعل هذا التضخيم لإنتاج AMPLICON NT 309 في متحولة، ولكن لار في سلالة النوع البري (الشكل 1).
      5. والثالث يحتوي PCR-F KOCO والاشعال KOCO-R. مطلوب رد الفعل هذا للتأكد من أن سلالة مختارة ليست merodiploid، حيث تم استبدال أحد الجينات من مكان الكاسيت وتكرار آخر ولكن على خلاف ذلك الجين نسخة من النوع البري لا تزال موجودة. ومن المتوقع هذا التضخيم من متحولة الحذف الصحيح لإنتاج منتج KB 1.4 (الشكل 1).
        ملاحظة: عند الجين المستهدف لديها نحو نفس الطول في أزواج قاعدة الجين كما كاسيت الحذف، واحد لن تلاحظ الفرق بين موضع التي حلت محلها الكاسيت، والتي لم موضع. تأكيد نهائي في مثل هذه الحالات، ونحن نوصي باستخدام الاشعال إضافية لتضخيم تحديدا شريحة DNA داخل الجين حذف. في هذه الحالة، إذا تم حذف هذا الجين، سيتم وحظ منتج التضخيم فقط في نوع عنصر التحكم سلالة البرية وليس في متحولة. هذه الاشعاليمكن أن يكون يدويا أو مصممة خصيصا لتضخيم حسابيا جزء من الحمض النووي داخل المنطقة المحذوفة. ونحن عادة تضخيم المناطق BP 140.
    2. يؤكد الطفرة الجينية الأساسية hypomorphic
      1. لتأكيد الطفرة hypomorphic بواسطة PCR، استخدم الجينات المحددة 20-NT إلى الأمام (KOCO-F) والاشعال العكسي (KOCO-R) BP بعد 200 المنبع والمصب، على التوالي، من موقع الإدراج SPA-علامة (الشكل 2).
        ملاحظة: يتم استخدام هذه الخطوة التضخيم كعنصر تحكم لضمان عدم وجود نسخة من هذا الجين untagged الهدف الأساسي. فقط عندما نسخة الموسومة موجودة، لكن لوحظ أنه واحد الفرقة 310 BP أكبر من AMPLICON SPA-CM. ومن شأن المنتج BP 400 إشارة وجود نسخة من هذا الجين untagged.
      2. بالتوازي مع تأكيد PCR، استخدم الغربية النشاف للتحقق من الإدراج في الإطار للمجتمع طلال أبوغزاله للSPA باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة FLAG M2 محددة إلى الحواتم-FLAG للSPA-21 علامة.
  7. تخزين سلالة المانحة أكدت
    1. نقل الثقافة بين عشية وضحاها من سلالة متحولة أكد المانحة المؤتلف إلى cryovials المسمى، مع الجلسرين لاستكمال تركيز النهائي 15٪، وتخلط جيدا. على المدى الطويل تخزين، والحفاظ على cryovials في -80 ° C.

2. Arraying E. القولونية F-مستلم المسوخ لشاشات eSGA

  1. طبق دبوس وE. (يمكن الحصول عليها من النظم البيولوجية فتح سلالات 3968 11؛؛ F-BW25113) آليا إلى 384 microplates جيدا 24 تحتوي على 80 ميكرولتر من وسائل الإعلام LB السائل لكل بئر واحدة القولونية كيو حذف الجينات غير الضرورية التي تم إنشاؤها بواسطة مجموعة متحولة موري وآخرون. ، على أن تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل كانساس
    ملاحظة: للحصول على تقييم منهجي نظم المعلومات الجغرافية مع الجينات الأساسية، يمكن استكمال كيو المتلقي جمع 11 مع لF-اساسه وضع علامات ناقص المفعول الجينات الأساسيةسلالات متحولة مع جيم C-SPA-محطة به 22 و 23.
  2. لإفساح المجال لمراقبة الحدود سلالة، والذي سيكون بمثابة مراقبة إيجابية، والمساعدات في داخل وبين التطبيع لوحة وكذلك في quantizations مستعمرة الآلي، وإزالة وسائل الإعلام تلقيح من الآبار الأبعد من كل لوحة من الخطوة أعلاه ونقلها إلى لوحات جديدة، وترك مرة أخرى الآبار الأبعد فارغة.
    ملاحظة: يتم حذف سلالة مراقبة الحدود JW5028 من مجموعة كيو 11 لجين زائفة الصغيرة التي لا ينبغي، ولم شاشات في كامل الجينوم لدينا، يحمل نظم المعلومات الجغرافية مع أي الجهات المانحة. لذلك، هذا هو جيد السلالة مراقبة إيجابية لتحديد حالات نادرة عندما الاقتران، تعلق، أو تحديدات قد فشلت، مما أدى إلى غياب أو متفرقة الحدود النمو التوتر. على سبيل المثال، إذا المستعمرات مراقبة الحدود لا تنمو بعد اختيار متحولة مزدوجة، سلالة الاستعلام قد لا تكون قادرة على تصريف الافعال، قد تم اقتران حاولتقد يكون NA شرط أن منعها من الحدوث (مثل المضادات الحيوية على صفيحة تحتوي على)، أو مضاد حيوي خاطئ تضاف إلى لوحة الاختيار. وبالمثل، إذا لوحظ عدد قليل جدا، والمستعمرات المتفرقة على لوحة كاملة، بما في ذلك الحدود، قد فشلت الاقتران أو تعلق الشاشة ويحتاج إلى تكرار. إذا كانت هذه هي النمو الحدود متفرقة استنساخه، فإنه قد تشير إلى الفقراء باستمرار اقتران المانحة وبالتالي الحالات التي لا تراعى المسوخ المزدوجة ربما بسبب فشل الاقتران، وليس صحيحا البيانات الجغرافية. ومثل هذه الشاشات تحتاج إلى التخلص من مزيد من التحليل. وعلاوة على ذلك، من خلال التواجد في جميع لوحات، وسلالة مراقبة الحدود يسمح البرنامج تكميم مستعمرة لتحديد المواقع تلقائيا مستعمرة على لوحات مزدوجة متحولة، وبالتالي المواقف مستعمرة ليس من الضروري أن يتم ترسيم يدويا. وأخيرا، فإن الإيدز سلالة مراقبة الحدود في تطبيع الأحجام داخل مستعمرة (على سبيل المثال صفوف مختلفة داخل لوحة) وbetwEEN (مثل لوحات مختلفة المتلقي يشبك مع الجهة المانحة نفسها في أوقات مختلفة) لوحات.
  3. وبالمثل، وخلق بؤر المراقبة السلبية عن طريق إزالة أي سلالتين من موقع مختلف في كل لوحة (لا حدود) ونقل إلى لوحة سلالات جديدة. ملء هذه الآبار فارغة مع وسائل الإعلام التي تحتوي على LB 17 ميكروغرام / مل من سم. ومن المتوقع أن تحكم هذه البقع السلبية لتكون فارغة في المتلقي وبالتالي لوحات مزدوجة متحولة والمساعدة على ضمان عدم وجود أي أخطاء أو التعامل مع تجهيز لوحة الترقيم عند والتصوير، أو تعلق لوحات.
    ملاحظة: هذه مطلوبة بقع فارغة الضوابط السلبية. الضوابط السلبية تساعد في تحديد حالات عندما فشل الاختيار - عندما سلالات المراقبة السلبية تنمو خلال التحديد. نقترح ليس فقط تحديد المواقع الفريدة المراقبة السلبية لكل من لوحات المتلقي، ولكن أيضا لاختيار المواقع المراقبة السلبية داخل نفس الربع من لوحة (على سبيل المثال اليمنى السفلى). بهذه الطريقة، ونمطوالبقع من المراقبة السلبية تحديد الأخطاء المحتملة لوحة سوء (يتم تسميتها لوحات معلقة على سبيل المثال أو يجري رأسا على عقب، حيث يتم شبك المستعمرة العلوي الأيسر في وضع اليمنى السفلى).
  4. تطعيم سلالة كيو JW5028 11، مع حذف جين كاذب، إلى قارورة 500 مل مع LB 200 مل، يحتوي على 50 ميكروغرام / مل من كانساس وبناء على شاشاتنا eSGA كامل الجينوم، ونمو هذا المسخ خاصة هو الأقرب إلى البرية يتم استخدام نوع وبالتالي BW25113 وأنها مراقبة الحدود.
  5. زراعة سلالات العريض فضلا عن الثقافة بين عشية وضحاها في JW5028 32 ° C مع 190 دورة في الدقيقة المدارية تهز إلى OD ~ من 0،4 حتي 0،6 في 600 نانومتر. بعد النمو بين عشية وضحاها، وملء في الآبار الحدودية مع حوالي 80 ميكرولتر من JW5028 الثقافة بين عشية وضحاها.
  6. ويمكن استخدام لوحات تجميعها في الخطوة 3.2. بدلا من ذلك، على المدى الطويل تخزين، يكمل كل منهما جيدا في لوحات المتلقي مع الجلسرين 15٪، مزيج وسائل الإعلام والجلسرين، والحفاظ على لوحاتفي -80 ° C.

3. عالية الكثافة إجراء التزاوج سلالة لتوليد E. المسوخ القولونية مزدوجة

  1. تنمو سلالة المانحة HFR، مع الطفرة الاستعلام، مع وضع علامة سم، بين عشية وضحاها في 32 درجة مئوية في المتوسط ​​الغنية السائل LB-CM (17 ميكروغرام / مل من سم) مع اهتزاز في 220 دورة في الدقيقة.
  2. دبوس جمع المتلقية أمر متحولة في 384 مستعمرة على لوحات الكثافة الصلبة LB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل من كانساس وفي موازاة ذلك، دبوس سلالة متحولة الاستعلام المانحة في 384 مستعمرة على كثافة نفس العدد من لوحات LB، على أن تستكمل مع 17 ميكروغرام / مل من سم. احتضان لوحات في ليلة وضحاها C. ° 32
    ملاحظة: لوحات تستخدم لتعلق المتلقي قد تتطلب تصل إلى 36 ساعة للحصول على مستعمرات كبيرة بما فيه الكفاية لاتخاذ خطوات لاحقة. عندما متوسط ​​حجم مستعمرة الحدود حوالي 2 مم في القطر (أو أكثر)، لوحات جاهزة للشبك.
  3. لالمتقارن السلالات، يعلقون عليه من المانحين لوحة 384 مستعمرة المانحة ليلة وضحاها علىلوحة LB الصلبة. دبوس واحد في وقت لاحق لوحة المستفيدة 384 مستعمرة على مدى المانحة الطازجة معلقة على لوحة الاقتران. تواصل تعلق حتى لوحات كل المانح والمتلقي وكانت تعلق على مترافق بواسطة الصلبة لوحات اقتران LB. احتضان لوحات معلقة في الاقتران C ° 32 من 16 إلى 24 ساعة.
    ملاحظة: فرد واحد سلالات متحولة المانحة قد تظهر الجينات الجين إلى التباين في كفاءة التزاوج بسبب الآثار المحتملة للطفرات على الاقتران، DNA كفاءة نقل، أو اللياقة البدنية. يمكن إيقاف النمو في أي وقت ما بين 16 و 24 ساعة، وعندما تم الحصول على مستعمرات كبيرة بما فيه الكفاية لاحقة الخطوات تعلق. الإقتران استمرت 16 حتي 24 ساعة إنتاج أعداد كافية من conjugants السابقين لنتائج eSGA استنساخه حتى بالنسبة للطفرات الجينات في وقت متأخر من نقل أو المسوخ مع انخفاض طفيف للياقة البدنية.
  4. كل لوحة دبوس اقتران كثافة على 384 لوحة LB الصلبة واحدة، تحتوي على سم (17 ميكروغرام / مل) واساسه (50قد علقت ميكروغرام / مل) حتى جميع لوحات الاقتران. احتضان لوحات معلقة طازجة التحديد الأول ل16-36 ساعة عند C. ° 32
    ملاحظة: في ما يخص الخطوات الاختيار، كميات مختلفة من الوقت قد تكون ضرورية لشاشات المانحة المختلفة. لأن جميع المسوخ مزدوجة في شاشة معينة لديها طفرة المانحة نفسها، في المتوسط، أبطأ متحولة المانحة المتزايد يؤدي إلى تباطؤ النمو طفرات مزدوجة. وهكذا، اعتمادا على اللياقة البدنية المانحة، قد تتطلب خطوات اختيار ما بين 16 و ساعة 36. يمكن إيقاف نمو مزدوج متحولة عندما المسوخ مزدوجة كبيرة بما فيه الكفاية للخطوة اللاحقة إما تعلق بعد اختيار الأول أو الثاني بعد التصوير. هذا يترجم عادة من الحدود المستعمرات السيطرة في المتوسط ​​مع لا يقل عن 2 مم بأقطار.
  5. إعادة يعلقون كل لوحة التحديد الأول على دواء، والثانية مزدوجة (سم واساسه)، لوحة التحديد في شكل مستعمرة-1536، بحيث يتم تمثيل كل مستعمرة من قبل أربعة التحديد الأول على المستعمراتلوحة اختيار الثاني. احتضان لوحات ل16-36 ساعة عند C. ° 32 تصوير لوحات مزدوجة النهائي اختيار متحولة لقياس كميا لياقة نمو متحولة وتحليل التفاعلات بين أزواج الجينات (الشكل 3).
    ملاحظة: على الرغم من أن وتيرة merodiploidy (الكروموسومات الازدواجية جزئي) منخفض في حوالي 1/1 خلايا 000، 24، merodiploidy يمكن أن تحجب GI. وبالتالي، فإننا نوصي بما يعيد البيولوجي في جميع شاشات eSGA. لحسن الحظ، يمكن إعادة استخدامها لوحات بلاستيكية يمكن التخلص منها التجارية ومنصات تعلق تصل إلى ثلاث مرات من قبل تعقيم المواد على النحو التالي: يتم تجاهل آجار من لوحات ويتم تعقيم لوحات وكذلك منصات بواسطة نقع عليها في التبييض 10٪ بين عشية وضحاها، تليها شطف مع الماء المقطر، وغسل في الايثانول 70٪، والهواء تجفيف بلستيكور في غطاء تدفق تحت الضوء فوق البنفسجي. يتم تخزين معقمة ومنصات لوحات في حقائب مختومة بلاستيكية معقمة حتى الاستخدام.

4. معالجة البيانات واستخلاص النتائج GI

  1. قياس المستعمرات على كل لوحة في دفعة واسطة أو باستخدام التصوير فردي مستعمرة البرمجيات المتخصصة 3 و 9.
    ملاحظة: A مناسبة جافا القائمة على التصوير مستعمرة عالية الإنتاجية وتطبيق التسجيل الآن متاحة بحرية للاطلاع الجمهور ( http://srcollins77.users.sourceforge.net/ ). البرنامج يعمل على منصات مختلفة (أي ماك أو PC) ويمكن إطلاقها إما للتنفيذ أو من نافذة الصالة.
  2. تطبيع حجم مستعمرة الخام عن طريق تصحيح القياسات للتحيزات منتظمة داخل وبين لوحات مثل لوحة حافة الآثار، والآثار الاختلاف بين لوحة، صورة متفاوتة الإضاءة، والتحف بسبب انحناء سطح المادية للأجار، والآثار التنافس على المستعمرات المجاورة وعيوب ممكن تعلق ، فضلا عن الاختلافات في النمو مرة ف> 9. هذه التحف منهجية مستقلة عن اللياقة البدنية المزدوجة متحولة وينبغي تصحيحه كما أنها تؤدي إلى تقديرات زائفة اللياقة البدنية النمو.
  3. المستعمرات في الصفوف والأعمدة حافة تميل إلى أن تكون أكبر بسبب انخفاض المنافسة على المواد الغذائية من وجدت في وسط اللوحة. وهكذا، لتصحيح لهذا الغرض، توسيع نطاق أحجام المستعمرات حافة أن تكون مثل هذه أن حجم متوسط ​​في هذا الصف أو العمود يساوي حجم متوسط ​​من المستعمرات في وسط اللوحة.
  4. تحليل النتائج إحصائيا أن تأخذ في الاعتبار إمكانية استنساخ والتباين القياسية من الأحجام وسيطة من تكرار القياسات مستعمرة. على الأقل ثلاث تجارب مستقلة تكرار البيولوجية ضرورية لتقييم استنساخ التجارب.
  5. وأخيرا، استخدام أحجام النمو تطبيع مستعمرة اللياقة البدنية متوسط ​​لإنشاء نقاط GI (S) لكل زوج الجينات باستخدام الصيغة التالية:

ن 1 "SRC =" / files/ftp_upload/4056/4056eq1.jpg "/>
حيث S = فار (فار التصدير X (ن إكسب -1) + فار المقاولات X (ن المقاولات -1)) / (ن + ن التصدير المقاولات -2)؛ فار = إكسب التباين الحد الأقصى لحجم مستعمرة للتطبيع متحولة مزدوجة؛ فار = متوسط ​​المقاولات من الفروق في أحجام طبيعية مزدوجة مستعمرة متحولة من مجموعة المرجعية، ن = إكسب عدد من القياسات من أحجام مزدوجة مستعمرة متحولة، ن = عدد المقاولات وسيطة من خلال التجارب التجريبية يعيد للجميع؛ التصدير μ = متوسط ​​أحجام مستعمرة تطبيع من المسوخ مزدوجة؛ والمقاولات μ = متوسط ​​أحجام مستعمرة تطبيع للجميع المسوخ المزدوجة الناجمة عن سلالة متحولة متبرع واحد. وS-يعكس درجة الثقة الإحصائية للتفاعل digenic المفترضة فضلا عن قوة البيولوجي للتفاعل. إيجابية قوية S-عشرات تبين وجود آثار التخفيف، قuggesting أن الجينات تتفاعل المشاركة في المسار نفسه 9، في حين سلبي كبير S-عشرات تعكس المرض تركيبية أو الفتك، والتي غالبا ما توحي العضوية في مسارات متوازية زائدة 9. لتحديد مسار العلاقات على مستوى وظيفي، ويتم إنتاج واحد S-نقاط لكل زوج من الجينات اختبار من مجموعة البيانات النهائية.
ملاحظة: في دراستنا السابقة 9، وجدنا أن إعادة التركيب يميل إلى أن يحدث في كثير من الأحيان أقل بين الجينات في غضون 30 KBP عن بعضها البعض. لذلك، لتحليل المصب، بعد التطبيع وتوليد نقاط، ونحن إزالة التفاعلات بين الجينات في غضون 30 KBP عن بعضها البعض. بالإضافة إلى الجنود أنفسهم، ويمكن تحقيق العلاقات الوظيفية بين أزواج من الجينات من خلال النظر في كيفية مشابهة لمحات GI من الجينات هما. الملف الشخصى GI من الجين هو مجموعة من التفاعلات كل ذلك الجين مع جميع الجينات الأخرى في الجينوم خارجالجين منطقة الربط. الجينات مماثلة وظيفيا تميل إلى أن تكون أعلى من الارتباطات الجينية ملامح التفاعل 12 و 25. وهكذا، عن طريق حساب معاملات الارتباط لجميع الجينات في مجموعة البيانات التجريبية يمكن للمرء استخدام eSGA للتحقيق العلاقات الوظيفية بين الجينات حتى الكذب على مقربة من بعضها البعض على الكروموسوم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تكشف التفاعلات الجينية (GIs) عن العلاقات الوظيفية بين الجينات. وبالمثل، بما أن الجينات في المسار نفسه تظهر أنماط GI متشابهة، وبما أن تشابه ملف GI يمثل تطابق الأنماط الظاهرية، يمكننا تجميع الجينات ذات الصلة وظيفياً في مسارات عن طريق تجميع ملفات GI الخاصة بها. كما يمكن لدمج شبكات GI وارتباطات GI مع معلومات التفاعل الفيزيائي أو بيانات الارتباط الأخرى، مثل علاقات السياق الجينومي (GC)، أن يكشف عن تنظيم الوحدات الوظيفية من الرتب العليا التي تحدد الأنظمة البيولوجية الأساسية (والتداخل بين الأنظمة) في البكتيريا. على سبيل المثال، ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد أوجزنا بروتوكول تدريجي لاستخدام الروبوتية eSGA الفحص الجيني للتحقيق في وظائف البكتيرية على مستوى المسار من خلال استجواب GI. ويمكن استخدام هذا النهج لدراسة الجينات الفردية وكذلك في النظم البيولوجية بأكمله E. القولونية. تنفيذ الخطوات بعناية التجريبية المذكورة أعلاه، بما في ذلك جميع الضوابط المناسبة، وتحليل دقيق والتحقق من صحة البيانات بشكل مستقل GI هي الجوانب الرئيسية لنجاح eSGA في تحقيق اكتشافات جديدة وظيفية. بالإضافة إلى eSGA، وهي طريقة مشابهة لدراسة المفهوم GI في

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من جانب صناديق من كندا الجينوم، ومعهد أونتاريو علم الجينوم، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة لمنح JG وAG AE هي المستفيدة من منحة الدراسات العليا فانييه كندا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
١. المضادات الحيوية
كلورامفينيكولمتجر المستلزمات الحيوية#CLR201
كاناميسين#KAN201
أمبيسيلين# AMP201
٢. وسط لوريا-برتاني (Luria-Bertani medium)
مسحوق LBمتجر الأدوات الحيوية#LBL405
آجارمتجر المستلزمات الحيوية#AGR003
3. السلالات البكتيرية والبلازميدات
سلالة Hfr Cavalli λأحمر نظام (JL238)بابو وآخرون.14.
pKD3إيكولاي (E. coli) مركز المخزون الجيني، جامعة ييل
Keio بكتيريا الإشريكية القولونية (E. coli) مجموعة السلالات المستقبلة F-المشروع الوطني للموارد الحيوية (NBRP) في اليابان11
ناقصة الوظيفة بكتيريا الإشريكية القولونية (*E. coli*) سلالات F- الموسومة بـ SPA-tagالأنظمة الحيوية المفتوحة؛ بابو وآخرون.14
٤. البادئات
بادئات ثابتة منزوعة الأملاح تعتمد على pKD3F1: 5'-GGCTGACATGGGAATTAGC-3''
R1: 5'-AGATTGCAGCATTACACGTCTT-3'
بادئات مخصصة منزوعة الأملاحCm-R: 5'-TTATACGCAAGGCGACAAGG-3''
Cm-F: 5'- GATCTTCCGTCACAGGTAGG-3'
بادئات مخصصة منزوعة الأملاحF2 وR2: منطقتان ثابتتان بطول 20 نيوكليوتيد بناءً على تسلسل pKD3، ومنطقتان تماثل مخصصتان بطول 45 نيوكليوتيد
المنطقة الثابتة F2:
5'-CATATGAATATCCTCCTTA-3''
المنطقة الثابتة R2:<تتحدد الأنماط الظاهرية من خلال سلسلة معقدة من التفاعلات الفيزيائية (مثل تفاعلات بروتين-بروتين) والوظيفية (مثل تفاعلات جين-جين أو تفاعلات جينية) (GI). وبينما يمكن للتفاعلات الفيزيائية أن تشير إلى البروتينات البكتيرية المرتبطة كمعقدات، فإنها لا تكشف بالضرورة عن العلاقات الوظيفية على مستوى المسار. ويمكن لعمليات فحص التفاعلات الجينية (GI screens)، التي يتم فيها قياس نمو الطفرات المزدوجة التي تحمل جينين محذوفين أو غير نشطين ومقارنتها بالطفرات المفردة المقابلة، أن تسلط الضوء على التبعيات الرعوية (epistatic dependencies) بين المواقع الجينية، وبالتالي توفر وسيلة لاستقصاء واكتشاف علاقات وظيفية جديدة. وقد تم تسجيل خرائط تفاعلات جينية واسعة النطاق للكائنات حقيقية النواة مثل الخميرة، لكن المعلومات المتعلقة بالتفاعلات الجينية لا تزال شحيحة بالنسبة لبدائيات النوى، مما يعيق التوصيف الوظيفي للجينومات البكتيرية. وتحقيقاً لهذه الغاية، قمنا نحن وآخرون بتطوير طرق فحص كمية عالية الإنتاجية للتفاعلات الجينية البكتيرية. ونقدم هنا الخطوات الرئيسية المطلوبة لإجراء عملية فحص المصفوفة الجينية الاصطناعية لبكتيريا الإشريكية القولونية (eSGA) الكمية على نطاق الجينوم، باستخدام الاقتران البكتيري الطبيعي وإعادة التركيب المتماثل لتوليد وقياس لياقة أعداد كبيرة من الطفرات المزدوجة بشكل منهجي في تنسيق مصفوفة مستعمرات. وباختصار، يُستخدم روبوت لنقل أليلات طافرة موسومة بالكلورامفينيكول (Cm)، عن طريق الاقتران، من "سلالات مانحة" مهندسة من نوع Hfr (عالية تردد إعادة التركيب) إلى مصفوفة مرتبة من السلالات المستقبلة F- الموسومة بالكانامايسين (Kan). وعادةً ما نستخدم طفرات مفردة فقدانية للوظيفة تحمل حذفاً لجينات غير أساسية (مثل مجموعة "Keio") وطفرات نقص تزيحي (hypomorphic mutations) لجينات أساسية (أي أليلات تمنح تعبيراً بروتينياً أو استقراراً أو نشاطاً منخفضاً) لاستقصاء الارتباطات الوظيفية للجينات غير الأساسية والأساسية، على التوالي. وبعد الاقتران والتبادل الجيني اللاحق بوساطة إعادة التركيب المتماثل، يتم اختيار الطفرات المزدوجة الناتجة على وسط صلب يحتوي على كلا المضادين الحيويين. وبعد النمو، يتم تصوير الأطباق رقمياً وتُسجل أحجام المستعمرات كمياً باستخدام نظام آلي لمعالجة الصور مطور داخلياً. وتنكشف التفاعلات الجينية عندما يكون معدل نمو الطفرة المزدوجة أفضل أو أسوأ بكثير مما هو متوقع. وغالباً ما تنتج التفاعلات الجينية المفاقِمة (أو السلبية) بين طفرات فقدان الوظيفة في أزواج من الجينات من مسارات تعويضية تؤثر على العملية الأساسية نفسها؛ حيث يتم تعويض فقدان جين واحد هنا، بحيث تظل أي من الطفرتين المفردتين قابلة للحياة. ومع ذلك، فإن فقدان كلا المسارين يكون ضاراً ويؤدي إلى فتك اصطناعي أو اعتلال (أي نمو بطيء). وعلى العكس من ذلك، يمكن أن تحدث تفاعلات مخففة (أو إيجابية) بين الجينات في المسار نفسه أو المعقد البروتيني نفسه، حيث يكون حذف أي من الجينين بمفرده كافياً غالباً لتعطيل الوظيفة الطبيعية للمسار أو المعقد، بحيث لا تؤدي الاضطرابات الإضافية إلى تقليل النشاط، وبالتالي النمو، بشكل أكبر. وبشكل عام، يمكن أن يوفر التحديد والتحليل المنهجي لشبكات التفاعلات الجينية خرائط عالمية غير متحيزة للعلاقات الوظيفية بين أعداد كبيرة من الجينات، والتي يمكن من خلالها استنتاج معلومات على مستوى المسار قد تغفل عنها النهج الأخرى.> 5'-TGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3' S1 و S2: مناطق ثابتة بطول 27 نيوكليوتيد لبدء تضخيم كاسيت SPA-Cm، ومناطق تماثل مخصصة بطول 45 نيوكليوتيد
المنطقة الثابتة S1:<تتحدد الأنماط الظاهرية من خلال سلسلة معقدة من التفاعلات الفيزيائية (مثل تفاعلات البروتين-بروتين) والتفاعلات الوظيفية (مثل تفاعلات جين-جين أو التفاعلات الجينية) (GI). وبينما يمكن للتفاعلات الفيزيائية أن تشير إلى البروتينات البكتيرية المرتبطة في شكل معقدات، فإنها لا تكشف بالضرورة عن العلاقات الوظيفية على مستوى المسارات. ويمكن لعمليات فحص التفاعلات الجينية (GI screens)، التي يتم فيها قياس نمو الطفرات المزدوجة التي تحمل جينين محذوفين أو غير نشطين ومقارنتها بالطفرات الفردية المقابلة، أن تسلط الضوء على الاعتمادات الإبيستاتيكية (epistatic dependencies) بين المواقع الجينية، وبالتالي توفر وسيلة لاستكشاف واكتشاف علاقات وظيفية جديدة. وقد تم الإبلاغ عن خرائط تفاعلات جينية واسعة النطاق للكائنات حقيقية النواة مثل الخميرة، ولكن تظل المعلومات المتعلقة بالتفاعلات الجينية شحيحة بالنسبة لـ بدائيات النوى، مما يعيق التوصيف الوظيفي للجينومات البكتيرية. وتحقيقاً لهذه الغاية، قمنا نحن وآخرون بتطوير طرق فحص كمية عالية الإنتاجية للتفاعلات الجينية البكتيرية. ونقدم هنا الخطوات الرئيسية المطلوبة لإجراء عملية فحص المصفوفة الجينية الاصطناعية لبكتيريا E. coli (eSGA) الكمية على نطاق الجينوم، باستخدام الاقتران البكتيري الطبيعي وإعادة الاندماج المتماثل لتوليد وقياس لياقة أعداد كبيرة من الطفرات المزدوجة بشكل منهجي في تنسيق مصفوفة مستعمرات. وباختصار، يتم استخدام روبوت لنقل أليلات طافرة موسومة بالكلورامفينيكول (Cm)، عبر الاقتران، من "سلالات مانحة" مهندسة من نوع Hfr (تردد إعادة اندماج عالٍ) إلى مصفوفة مرتبة من سلالات مستقبلة F- موسومة بالكاناميسين (Kan). وعادةً ما نستخدم طفرات فردية فقدانية الوظيفة تحمل عمليات حذف لجينات غير أساسية (مثل مجموعة "Keio") وطفرات نقص تخصصية (hypomorphic mutations) لجينات أساسية (أي أليلات تؤدي إلى تقليل تعبير البروتين أو استقراره أو نشاطه) لاستقصاء الارتباطات الوظيفية للجينات غير الأساسية والأساسية، على التوالي. وبعد الاقتران والتبادل الجيني اللاحق الذي يتم بواسطة إعادة الاندماج المتماثل، يتم اختيار الطفرات المزدوجة الناتجة على وسط صلب يحتوي على كلا المضادين الحيويين. وبعد مرحلة النمو، يتم تصوير الأطباق رقمياً وتقدير أحجام المستعمرات كمياً باستخدام نظام آلي لمعالجة الصور مطور داخلياً. وتنكشف التفاعلات الجينية عندما يكون معدل نمو الطفرة المزدوجة أفضل أو أسوأ بكثير مما هو متوقع. وغالباً ما تنتج التفاعلات الجينية المفاقمة (أو السلبية) بين طفرات فقدان الوظيفة في أزواج من الجينات من مسارات تعويضية تؤثر على نفس العملية الأساسية. وفي هذه الحالة، يتم تخفيف أثر فقدان جين واحد، بحيث تظل أي من الطفرات الفردية قابلة للحياة. ومع ذلك، فإن فقدان كلا المسارين يكون ضاراً ويؤدي إلى aletality اصطناعية (فتك اصطناعي) أو اعتلال (أي نمو بطيء). وعلى العكس من ذلك، يمكن أن تحدث تفاعلات تخفيفية (أو إيجابية) بين الجينات في نفس المسار أو المعقد البروتيني، حيث يكون حذف أي من الجينين بمفرده كافياً في كثير من الأحيان لاضطراب الوظيفة الطبيعية للمسار أو المعقد، بحيث لا تؤدي الاضطرابات الإضافية إلى تقليل النشاط، وبالتالي النمو، بشكل أكبر. وبشكل عام، يمكن أن يوفر التحديد والتحليل المنهجي لشبكات التفاعلات الجينية خرائط عالمية غير متحيزة للعلاقات الوظيفية بين أعداد كبيرة من الجينات، والتي يمكن من خلالها استنتاج معلومات على مستوى المسارات قد تغفل عنها المنهجيات الأخرى.> 5'AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3'
المنطقة الثابتة S2:<تتحدد الأنماط الظاهرية من خلال سلسلة معقدة من التفاعلات الفيزيائية (مثل تفاعلات بروتين-بروتين) والتفاعلات الوظيفية (مثل تفاعلات جين-جين أو التفاعلات الجينية) (GI)1. وبينما يمكن للتفاعلات الفيزيائية أن تشير إلى البروتينات البكتيرية المرتبطة في شكل معقدات، إلا أنها لا تكشف بالضرورة عن العلاقات الوظيفية على مستوى المسار1. ويمكن لعمليات فحص التفاعلات الجينية (GI screens)، التي يتم فيها قياس نمو الطفرات المزدوجة التي تحمل جينين محذوفين أو غير نشطين ومقارنتها بالطفرات المفردة المقابلة، أن تسلط الضوء على الاعتمادات الوراثية (epistatic dependencies) بين المواقع الجينية، وبالتالي توفر وسيلة لاستقصاء واكتشاف علاقات وظيفية جديدة2. وقد تم تسجيل خرائط تفاعلات جينية واسعة النطاق للكائنات حقيقية النواة مثل الخميرة3-7، ولكن المعلومات المتعلقة بالتفاعلات الجينية لا تزال شحيحة بالنسبة لبدائيات النواة8، مما يعيق التعليق الوظيفي (functional annotation) للجينومات البكتيرية. وتحقيقاً لهذه الغاية، قمنا نحن وآخرون بتطوير طرق فحص كمية عالية الإنتاجية للتفاعلات الجينية البكتيرية9، 10. نقدم هنا الخطوات الرئيسية المطلوبة لإجراء عملية فحص مصفوفة الجينات الاصطناعية في بكتيريا E. coli (eSGA) الكمية على نطاق الجينوم9، باستخدام الاقتران البكتيري الطبيعي وإعادة التركيب المتماثل لتوليد وقياس لياقة (fitness) أعداد كبيرة من الطفرات المزدوجة بشكل منهجي في تنسيق مصفوفة مستعمرات. وباختصار، يتم استخدام روبوت لنقل أليلات طافرة مميزة بالكلورامفينيكول (Cm)، عن طريق الاقتران، من "سلالات مانحة" مهندسة ذات تردد إعادة تركيب عالٍ (Hfr) إلى مصفوفة مرتبة من السلالات المستقبلة (F-) المميزة بالكاناميسين (Kan). وعادةً ما نستخدم طفرات مفردة فقدانية للوظيفة تحمل حذف جينات غير أساسية (مثل مجموعة "Keio"11) وطفرات نقص وظيفي (hypomorphic mutations) في جينات أساسية (أي أليلات تمنح تعبيراً بروتينياً أو استقراراً أو نشاطاً منخفضاً9، 12, 13) لاستقصاء الارتباطات الوظيفية للجينات غير الأساسية والأساسية، على التوالي. وبعد الاقتران والتبادل الجيني اللاحق الذي يتم بواسطة إعادة التركيب المتماثل، يتم اختيار الطفرات المزدوجة الناتجة على وسط صلب يحتوي على كلا المضادين الحيويين. وبعد النمو، يتم تصوير الأطباق رقمياً وتُسجل أحجام المستعمرات كمياً باستخدام نظام مؤتمت لمعالجة الصور مطور داخلياً14. وتنكشف التفاعلات الجينية عندما يكون معدل نمو الطفرة المزدوجة أفضل أو أسوأ بكثير مما هو متوقع9. وغالباً ما تنتج تفاعلات جينية مفاقمة (أو سلبية) بين طفرات فقدان الوظيفة في أزواج من الجينات من مسارات تعويضية تؤثر على العملية الأساسية نفسها2. وفي هذه الحالة، يتم تخفيف أثر فقدان جين واحد، بحيث تظل أي من الطفرات المفردة قابلة للحياة. ومع ذلك، فإن فقدان كلا المسارين يكون ضاراً ويؤدي إلى فتك اصطناعي (synthetic lethality) أو اعتلال (أي نمو بطيء). وعلى العكس من ذلك، يمكن أن تحدث تفاعلات تخفيفية (أو إيجابية) بين الجينات في المسار نفسه أو المعقد البروتيني نفسه2، حيث يكون حذف أي من الجينين بمفرده كافياً غالباً لإرباك الوظيفة الطبيعية للمسار أو المعقد، بحيث لا تؤدي الاضطرابات الإضافية إلى تقليل النشاط، وبالتالي النمو، بشكل أكبر. وبشكل عام، يمكن أن يوفر التحديد والتحليل المنهجي لشبكات التفاعلات الجينية خرائط عالمية غير متحيزة للعلاقات الوظيفية بين أعداد كبيرة من الجينات، والتي يمكن من خلالها استنتاج معلومات على مستوى المسار قد تغفل عنها المناهج الأخرى9.> 5'- GGCCCCATATGAATATCCTCCTTAGTT -3'

KOCO-F وKOCO-C: بادئات بطول 20 نيوكليوتيد تبتعد بمقدار 200 زوج قاعدي عن موقع حذف الجين غير الأساسي أو الجين الأساسي
موقع إدراج وسم SPA للجين
5. كواشف تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والترحيل الكهربائي
إنزيم Taq DNA polymeraseFermentas# EP0281
محلول منظم لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بتركيز 10XFermentas# EP0281
10 ميلي مولار من ديوكسي نيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs)Fermentas# EP0281
٢٥ ملي مولار من كلوريد المغنيسيوم (MgCl2)2Fermentas# EP0281
أجاروزمتجر المستلزمات الحيوية# AGA002
صبغة التحميلNEB#B7021S
بروميد الإيثيديوممتجر الأدوات الحيوية# ETB444
محلول TBE المنظم بتركيز 10Xمتجر المستلزمات الحيوية# ETB444.10
تريس قاعدي (Tris Base)المتجر الحيوي# TRS001
حمض البوريكسيجما# T1503-1KG
إيديتات (EDTA) بتركيز 0.5 مولار (الرقم الهيدروجيني 8.0)سيجما# B6768-500G
سلم الحمض النووي (DNA ladder)NEB#N3232L
6. أطقم عزل وتنقية الحمض النووي (DNA)
طقم عزل وتنقية الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينومي (gDNA)Promega#A1120
طقم استخلاص البلازميد بكمية متوسطة (Plasmid Midi kit)Qiagen# 12143
طقم تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل QIAquickQiagen#28104
7. معدات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والتحول الجيني، والنقل بطريقة التثبيت المتكرر (Replica-pinning)
جهاز الدورات الحراريةBioRad, iCycler
الفصل الكهربائي لهلام الأغاروزBioRad
جهاز التثقيب الكهربائيBio-Rad GenePulser II
كوفيت ترحيل كهربائي سعة 0.2 سمBio-Rad
42 °جهاز هزاز في حمام مائيInnova 3100
جهاز طرد مركزي Beckman Coulter TJ-25Beckman Coulter
32 °هزاز Cنيو برونزويك ساينتيفيك، الولايات المتحدة الأمريكية
32 °حضّانة أطباق CFisher Scientific
روبوت المختبر RoToR-HDASinger Instruments
منصات بكثافة دبابيس تبلغ 96 و384 و1,536 دبوساًSinger Instruments
96 أو 384 دبوساً طويلاًSinger Instruments
8. أجهزة التصوير
حامل الكاميراكايزر
كاميرا رقمية، 10 ميجابكسلأي مورد
صناديق إضاءة، Testrite 16" ٢٤ x" الوحداتتسترايت (Testrite)
9. إعادة تدوير الوسادات أو الأطباق
مبيض بتركيز 10%أي مورد
إيثانول بتركيز 70%أي مورد
ماء مقطر معقمأي مورد
خزانة التدفق الصفحيأي مورد
مصباح الأشعة فوق البنفسجيةأي مورد
10. الأدوات المخبرية
أنابيب بولي بروبيلين سعة 50 ملأي مورد
أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مللأي مورد
دوارق مخروطية سعة 250 ملVWR# 29140-045
أنابيب زراعة معقمة سعة 15 ملThermo Scientific# 366052
أنابيب حفظ مبردةVWR# 479-3221
أطباق مستطيلةSinger Instruments
أطباق معايرة دقيقة ذات 96 بئراً و384 بئراًSinger Instrumentsنص مفقود أو غير مكتمل. يرجى تقديم النص المراد ترجمته.
أسطوانة لف الأطباق لإحكام غلق الأطباق متعددة الآبارسيجما#R1275
الأطباقABgene# AB-0580
سدادات الأطباق اللاصقةفيشر ساينتيفيك (Fisher Scientific)# 13-990-14
-80 °مجمد (C)أي مورد

المراجع

  1. Bandyopadhyay, S., Kelley, R., Krogan, N. J., Ideker, T. Functional maps of protein complexes from quantitative genetic interaction data. PLoS Comput. Biol. 4, e1000065(2008).
  2. Costanzo, M., Baryshnikova, A., Myers, C. L., Andrews, B., Boone, C. Charting the genetic interaction map of a cell. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 66-74 (2011).
  3. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-4231 (2010).
  4. Fiedler, D., et al. Functional organization of the S. cerevisiae phosphorylation network. Cell. 136, 952-963 (2009).
  5. Roguev, A., et al. Conservation and rewiring of functional modules revealed by an epistasis map in fission yeast. Science. 322, 405-4010 (2008).
  6. Schuldiner, M., et al. Exploration of the function and organization of the yeast early secretory pathway through an epistatic miniarray profile. Cell. 123, 507-519 (2005).
  7. Wilmes, G. M., et al. A genetic interaction map of RNA-processing factors reveals links between Sem1/Dss1-containing complexes and mRNA export and splicing. Mol. Cell. 32, 735-746 (2008).
  8. Babu, M., et al. Systems-level approaches for identifying and analyzing genetic interaction networks in Escherichia coli and extensions to other prokaryotes. Mol. Biosyst. 12, 1439-1455 (2009).
  9. Butland, G., et al. coli synthetic genetic array analysis. Nat. Methods. 5, 789-7895 (2008).
  10. Typas, A., et al. Regulation of peptidoglycan synthesis by outer-membrane proteins. Cell. 143, 1097-10109 (2010).
  11. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 2006-200008 (2006).
  12. Babu, M., et al. Genetic interaction maps in Escherichia coli reveal functional crosstalk among cell envelope biogenesis pathways. PLoS Genet. 7, e1002377(2011).
  13. Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
  14. Babu, M., Gagarinova, A., Greenblatt, J., Emili, A. Array-based synthetic genetic screens to map bacterial pathways and functional networks in Escherichia coli. Methods Mol Biol. 765, 125-153 (2011).
  15. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-665 (2000).
  16. Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5978-5983 (2000).
  17. Typas, A., et al. quantitative analyses of genetic interactions in. E. coli. Nat. Methods. 5, 781-787 (2008).
  18. Zeghouf, M., et al. Sequential Peptide Affinity (SPA) system for the identification of mammalian and bacterial protein complexes. J. Proteome Res. 3, 463-468 (2004).
  19. Davierwala, A. P., et al. , 1147-1152 (2005).
  20. Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat. Methods. 5, 711-718 (2008).
  21. Babu, M., et al. Sequential peptide affinity purification system for the systematic isolation and identification of protein complexes from Escherichia coli. Methods Mol. Biol. 564, 373-400 (2009).
  22. Butland, G., et al. Interaction network containing conserved and essential protein complexes in Escherichia coli. Nature. 433, 531-537 (2005).
  23. Hu, P., Janga, S. C., Babu, M., Diaz-Mejia, J. J., Butland, G., et al. Global functional atlas of Escherichia coli encompassing previously uncharacterized proteins. PLoS Biol. 7, (2009).
  24. Anderson, R. P., Roth, J. R. Tandem genetic duplications in phage and bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 31, 473-505 (1977).
  25. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nat. Rev. Genet. 8, 437-449 (2007).
  26. Collins, S. R., et al. Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map. Nature. 446, 806-8010 (2007).
  27. Le Meur, N., Gentleman, R. Modeling synthetic lethality. Genome Biol. 9, R135(2008).
  28. Tong, A. H., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science. 294, 2364-2368 (2001).
  29. Tong, A. H., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303, 808-813 (2004).
  30. Wong, S. L., et al. Combining biological networks to predict genetic interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15682-15687 (2004).
  31. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat. Methods. 6, 767-772 (2009).
  32. Gagarinova, A., Emili, A. Genome-scale genetic manipulation methods for exploring bacterial molecular biology. Mol. Biosyst. 8, 1626-1638 (2012).
  33. Dewey, C. N., et al. Positional orthology: putting genomic evolutionary relationships into context. Brief Bioinform. 12, 401-412 (2011).
  34. St Onge, R. P., et al. Systematic pathway analysis using high-resolution fitness profiling of combinatorial gene deletions. Nat. Genet. 39, 199-206 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

المصفوفة الجينية الاصطناعيةفحص التفاعل الجينيتنسيق مصفوفة المستعمراتتحليل الطفرات المزدوجةالمعالجة الآلية للصورالانتقاء بالكلورامفينيكولالانتقاء بالكاناميسينإعادة الاندماج المتماثلالتكميم الكمي للياقة البدنية
رسم خرائط الشبكات الوظيفية البكتيرية والممرات في
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.