يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تلوين المناعى من H1-B7 (PD-L1) على البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج الشرائح غدية البنكرياس

22.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/4059

⸱

يناير 3, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Dermatology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 5The Sol Goldman Pancreatic Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, 7The Skip Viragh Center for Pancreatic Cancer, The Johns Hopkins University School of Medicine, 8Department of Pathology, The Johns Hopkins University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

B7-H1 (PD-L1) وملزمة لPD-1 توفير الرئيسية الورم الناجم عن مناعة في إشارة المكروية الورم. يوصف تلطيخ المناعى تقنية لتوصيف التعبير وتوطين H1-B7 غدية البنكرياس في هنا.

الملخص

B7-H1/PD-L1، وهو عضو في عائلة من البروتينات B7 سطح الخلية المناعية التنظيمية، ويلعب دورا هاما في تنظيم السلبية للخلية بوساطة الاستجابات المناعية من خلال تفاعلها مع مستقبلات لها، برمجة موت-1 (PD -1) 1،2. وقد لوحظ overexpression من H1-B7 من قبل الخلايا السرطانية في عدد من السرطانات البشرية، بما في ذلك سرطان الجلد، ورم أرومي دبقي، وسرطان في الرئة، وسرطان الثدي والمبيض والقولون والكلى والخلايا، وتبين أنها لإضعاف المضادة للورم T- الحصانة الخلية 3-8.

مؤخرا، تم التعرف B7-H1 أنسجة غدية التعبير البنكرياس كعلامة النذير المحتملة 9،10. بالإضافة إلى ذلك، وقد تبين من الحصار H1-B7 في نموذج الفأر من سرطان البنكرياس لإنتاج استجابة المضادة للورم 11. هذه البيانات تشير إلى أهمية H1-B7 كهدف العلاجية المحتملة. ولذلك فإن الأجسام المضادة لمكافحة الحصار B7-H1 التي يجري اختبارها في التجارب السريرية لمولtiple الأورام الصلبة بما في ذلك سرطان الجلد البشري وسرطان والرئة والقولون، والمعدة والكلى والبنكرياس 12.

من أجل أن تكون في نهاية المطاف قادرا على تحديد المرضى الذين سيستفيدون من H1-B7 استهداف العلاجات، فمن الأهمية بمكان للتحقيق في العلاقة بين التعبير وتوطين H1-B7 واستجابة المريض للعلاج الأجسام المضادة مع الحصار B7-H1. ودراسة التعبير عن H1-B7 في الأنسجة البشرية غدية البنكرياس من خلال المناعية إعطاء فهم أفضل لكيفية هذا الجزيء يشير شارك في المثبطة يسهم في قمع الحصانة انتيتومور في المكروية الورم. وقد تبين أن الأجسام المضادة لمكافحة B7-H1 وحيدة النسيلة (استنساخ 5H1) التي وضعها تشن وزملاء العمل لتحقيق نتائج يمكن الاعتماد عليها في تلطيخ cryosections من أنواع متعددة من الأورام الأنسجة البشرية 4،8، ولكن تلطيخ على شرائح-البارافين جزءا لا يتجزأ من كان تحديا حتى مؤخرا 13-18. لدينا ديفهربت بروتوكول B7-H1 تلطيخ للشرائح البارافين، جزءا لا يتجزأ من أنسجة غدية البنكرياس. بروتوكول B7-H1 تلطيخ الموصوفة هنا تنتج متسقة تلطيخ الغشائي وحشوية من H1-B7 مع الخلفية قليلا.

البروتوكول

B7-H1/PD-L1، وهو عضو في عائلة من البروتينات B7 سطح الخلية المناعية التنظيمية، ويلعب دورا هاما في تنظيم السلبية للخلية بوساطة الاستجابات المناعية من خلال تفاعلها مع مستقبلات لها، برمجة موت-1 (PD -1) 1،2. وقد لوحظ overexpression من H1-B7 من قبل الخلايا السرطانية في عدد من السرطانات البشرية، بما في ذلك سرطان الجلد، ورم أرومي دبقي، وسرطان في الرئة، وسرطان الثدي والمبيض والقولون والكلى والخلايا، وتبين أنها لإضعاف المضادة للورم T- الحصانة الخلية 3-8.

مؤخرا، تم التعرف B7-H1 أنسجة غدية التعبير البنكرياس كعلامة النذير المحتملة 9،10. بالإضافة إلى ذلك، وقد تبين من الحصار H1-B7 في نموذج الفأر من سرطان البنكرياس لإنتاج استجابة المضادة للورم 11. هذه البيانات تشير إلى أهمية H1-B7 كهدف العلاجية المحتملة. ولذلك فإن الأجسام المضادة لمكافحة الحصار B7-H1 التي يجري اختبارها في التجارب السريرية لالإنسان متعددةالأورام الصلبة بما في ذلك سرطان الجلد وسرطان والرئة والقولون، والمعدة والكلى والبنكرياس 12.

من أجل أن تكون في نهاية المطاف قادرا على تحديد المرضى الذين سيستفيدون من H1-B7 استهداف العلاجات، فمن الأهمية بمكان للتحقيق في العلاقة بين التعبير وتوطين H1-B7 واستجابة المريض للعلاج الأجسام المضادة مع الحصار B7-H1. ودراسة التعبير عن H1-B7 في الأنسجة البشرية غدية البنكرياس من خلال المناعية إعطاء فهم أفضل لكيفية هذا الجزيء يشير شارك في المثبطة يسهم في قمع الحصانة انتيتومور في المكروية الورم. وقد تبين أن الأجسام المضادة لمكافحة B7-H1 وحيدة النسيلة (استنساخ 5H1) التي وضعها تشن وزملاء العمل لتحقيق نتائج يمكن الاعتماد عليها في تلطيخ cryosections من أنواع متعددة من الأورام الأنسجة البشرية 4،8، ولكن تلطيخ على شرائح-البارافين جزءا لا يتجزأ من كان تحديا حتى مؤخرا 13-18. لقد قمنا بتطوير staini B7-H1نانوغرام بروتوكول للشرائح البارافين، جزءا لا يتجزأ من أنسجة غدية البنكرياس. بروتوكول B7-H1 تلطيخ الموصوفة هنا تنتج متسقة تلطيخ الغشائي وحشوية من H1-B7 مع الخلفية قليلا.

1. دي parafinization

  1. خبز الشرائح في C ° 55 لمدة 20 دقيقة.
  2. في غطاء محرك السيارة الكيميائية، والشرائح تزج في الزيلين لمدة 10 دقيقة.
  3. الشرائح تزج في الزيلين الطازجة لمدة 10 دقيقة.
  4. تزج الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق.
  5. تزج في الشرائح الطازجة الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق.
  6. تزج الشرائح في الإيثانول 95٪ لمدة 5 دقائق.
  7. تزج الشرائح في الإيثانول 80٪ لمدة 5 دقائق.
  8. تزج في الماء منزوع الأيونات الشرائح لمدة 5 دقائق.

2. مستضد استرجاع

  1. الشرائح تزج في تريس العازلة EDTA (درجة الحموضة 9.0) والحرارة في طنجرة الضغط إلى 125 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ثم 90 درجة مئوية لمدة 10 ثانية.
  2. اسمحوا الشرائح بارد لمدة 60 دقيقة.
  3. تزج الشرائح في TBST لمدة 5 دقائق؛ repeفي مرتين.

3. تلطيخ

  1. تمحو حلول حول النسيج على الشرائح. بمناسبة دائرة حول الأنسجة باستخدام قلم مسعور.
  2. ضع الشرائح في غرفة الرطوبة وتجنب تجفيف النسيج على الشريحة في جميع مراحل عملية تلطيخ بأكمله. مكان قطرة واحدة (حوالي 200 ميكرولتر أو أكثر لتغطية المنطقة بالكامل الأنسجة) من كتلة البيروكسيديز ضمن دائرة مسعور على الشريحة والشرائح في احتضان كتلة البيروكسيديز لمدة 5 دقائق.
  3. شطف مع الشرائح TBST، ثم في مكان TBST لمدة 5 دقائق.
  4. مكان قطرة واحدة من ACE BLOCK حظر العازلة على كل شريحة واحتضان لمدة 15 دقيقة.
  5. شطف مع الشرائح TBST، ثم في مكان TBST لمدة 5 دقائق.
  6. مكان قطرة واحدة من الحل أفيدين على كل شريحة واحتضان لمدة 15 دقيقة.
  7. شطف مع الشرائح TBST، ثم في مكان TBST لمدة 5 دقائق.
  8. مكان قطرة واحدة من الحل البيوتين على كل شريحة واحتضان لمدة 15 دقيقة.
  9. شطف سليقصر مع TBST، ثم ضع في TBST لمدة 5 دقائق.
  10. احتضان الشرائح مع 1:1،000 التخفيف من الأجسام المضادة لمكافحة B7-H1 الماوس وحيدة النسيلة (استنساخ 5H1) أو ماوس IgG1 κ نمط إسوي التحكم في 200 ميكرولتر TBST في 4 درجات مئوية لمدة 22 ساعة خلال الليل + / - الموارد البشرية 1. تركيز الأجسام المضادة في النهائي TBST هو 2،57 ميكروغرام / مل.
  11. شطف مع الشرائح TBST، ثم في مكان TBST لمدة 5 دقائق. كرر مرتين.
  12. احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة البيوتين الفئران مترافق المضادة للIgG1 الماوس الثانوي بتركيز 1:500 (في 200 ميكرولتر حل الماعز 2٪ مصل) لمدة 30 دقيقة.
  13. شطف مع الشرائح TBST، ثم في مكان TBST لمدة 5 دقائق. كرر مرتين.
  14. (يجب أن يكون مستعدا على الأقل 30 دقيقة قبل الاستخدام) مكان قطرة واحدة من Streptavidin-البيوتين مجمع على كل شريحة واحتضان لمدة 15 دقيقة.
  15. شطف مع الشرائح TBST، ثم في مكان TBST لمدة 5 دقائق. كرر مرتين.
  16. مكان قطرة واحدة من تضخيم الكاشف (02:01 المخفف مع TBST) على كل شريحة واحتضان لمدة 4 دقائق.
  17. شطف مع الشرائح TBST، ثم ضع في TBST لمدة 5 دقائق. كرر مرتين.
  18. مكان قطرة واحدة من Streptavidin-HRP على كل شريحة واحتضان لمدة 15 دقيقة.
  19. شطف مع الشرائح TBST، ثم في مكان TBST لمدة 5 دقائق. كرر مرتين.
  20. وضع قطرة واحدة من Diaminobenzidine-3،3 (DAB) والركيزة مولد اللون على كل شريحة وتطوير اللون لمدة 2 دقيقة.
  21. مباشرة بعد وضع اللون، وغسل الشرائح مع DDH 2 O لمدة 1-2 دقيقة.
  22. احتضان الشرائح مع قطرة واحدة من الهيماتوكسيلين لمدة 90 ثانية.
  23. يغسل مع DDH 2 O لمدة 1-2 دقيقة.
  24. يغسل بماء الصنبور والصابون لمدة 1-2 دقيقة.
  25. يغسل مع DDH 2 O لمدة 1-2 دقيقة.

4. الجفاف وتصاعد

  1. تزج الشرائح في الإيثانول 80٪ لمدة 3 دقائق.
  2. تزج الشرائح في الإيثانول 95٪ لمدة 3 دقائق.
  3. تزج الشرائح في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 5 دقائق. تكرار.
  4. تزج الشرائح في الزيلين لمدة 5 دقائق. تكرار.
  5. إضافة قطرة واحدة منCytoseal 60 إلى الشريحة والمكان ساترة.

الجدول 1 يسرد الكواشف المستخدمة في الإجراءات المذكورة أعلاه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وهناك تلطيخ المناعى ناجحة من H1-B7 إظهار التعبير غير متجانسة من H1-B7 (DAB بني لون إشارات التنمية) في غدية البنكرياس. بعض الخلايا غدية البنكرياس يكون التعبير الغشائي في الغالب من H1-B7 (الشكل 1A) في حين البعض الآخر إما حشوية التعبير في الغالب من H1-B7 أو التعبير قليلا من H1-B7 (أرقام 2 و 3). ظهارة القناة الطبيعية البنكرياس عن القليل B7-H1 (الشكل 4). تلطيخ مع الأجسام المضادة IgG1 الماوس κ تحكم نمط إسوي بدلا من الأجسام المضادة لمكاف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم إبلاغ الإدارة عن تلطيخ المناعى من H1-B7 على cryosections في الدراسات السابقة لمجموعة متنوعة من أنواع السرطان 3،4. ومع ذلك، وعينات الورم السريرية عادة ما تكون متاحة فقط في شكل كتل البارافين، جزءا لا يتجزأ من. وقد تم في الآونة الأخيرة على الأجسام المضادة وحيدة النسيلة 5H1 تطبيقها بنجاح في تلطيخ من أنسجة الورم جزءا لا يتجزأ من البارافين بما في ذلك سرطان الخلايا الكلوية، وسرطان عنق الرحم، وسرطان المثانة وسرطان الجلد 13-18. كما تم B7-H1-جزءا لا يتجزأ من تلطيخ ع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

EB، KMB، وHX المساهمة على قدم المساواة. وأيد هذه الدراسة من قبل لجنة التحقيق الوطنية SPORE في سرطانات الجهاز الهضمي P50 CA062924، NIH K23 CA148964، ومؤسسة Lustgarten، مؤسسة Viragh، ASCO جائزة الباحث الشاب، NIH-28 5T32 CA0090701 التدريب غرانت، سول سرطان البنكرياس مركز جولدمان، والمؤسسة الوطنية للبنكرياس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم تعليقات
CSA النظام داكو K1500 يتضمن الكواشف التالية المذكورة في البروتوكول: كتلة البيروكسيديز ومعقدة streptavidin-البيوتين، كاشف التضخيم، streptavidin HRP، والركيزة DAB ومولد اللون
أفيدين / البيوتين الحظر كيت ناقلات SP-2001
كتلة ACE Serotec BUF029
البيوتين المضادة للماوس IgG1 BD 553441
الماوس IgG1 K نمط إسوي التحكم eBioscience 14-4714-85
TBS (تريس مخزنة المالحة)، 10X Cellgro 46-012-CM 10xTBS يحتوي على 80 جم / L كلوريد الصوديوم و 24.2 Tirs ز / L؛
المخفف ل1X مع ddH2O ليغسل؛
توين 20 سيغما الدريخ P1379 وأضاف 1 مل إلى 1 L من TBS 1X لجعل TBST
الهدف استرجاع، 20X Celerus الموج 014-3000-000 المخفف ل1X مع DDH 2 O
190 الكحول الإيثيلي والدليل Pharmco-Aaper 111000190
200 الكحول الإيثيلي والدليل Pharmo-Aaper 111000200
الزيلين VWR 95057-827
الهيماتوكسيلين ريتشارد ألان-العلمية 72804
Cytoseal 60 ريتشارد ألان-العلمية 8310-4
Coverslips كورنينج 2940-245
الرطوبة الغرفة سيجما H6644
الجدول 1. الكواشف والمعدات.

المراجع

  1. Flies, D. B., Chen, L. The new B7s: playing a pivotal role in tumor immunity. J. Immunother. 30, 251-260 (2007).
  2. Dong, H., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. B7-H1, a third member of the B7 family, co-stimulates T-cell proliferation and interleukin-10 secretion. Nat. Med. 5, 1365-1369 (1999).
  3. Curiel, T. J., Wei, S., Dong, H., Alvarez, X., Cheng, P., Mottram, P., Krzysiek, R., Knutson, K. L., et al. Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated antitumor immunity. Nat. Med. 9, 562-567 (2003).
  4. Dong, H., Strome, S. E., Salomao, D. R., Tamura, H., Hirano, F., Flies, D. B., Roche, P. C., Lu, J., Zhu, G. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nat. Med. 8, 793-800 (2002).
  5. Dong, H., Chen, L. B7-H1 pathway and its role in the evasion of tumor immunity. J. Mol. Med. (Berl). 81, 281-287 (2003).
  6. Strome, S. E., Dong, H., Tamura, H., Voss, S. G., Flies, D. B., Tamada, K., Salomao, D., Cheville, J., Hirano, F., Lin, W., Kasperbauer, J. L., Ballman, K. V., Chen, L. B7-H1 blockade augments adoptive T-cell immunotherapy for squamous cell carcinoma. Cancer Res. 63, 6501-6505 (2003).
  7. Hirano, F., Kaneko, K., Tamura, H., Dong, H., Wang, S., Ichikawa, M., Rietz, C., Flies, D. B., Lau, J. S., Zhu, G., Tamada, K., Chen, L. Blockade of B7-H1 and PD-1 by monoclonal antibodies potentiates cancer therapeutic immunity. Cancer Res. 65, 1089-1096 (2005).
  8. Thompson, R. H., Gillett, M. D., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Webster, W. S., Krejci, K. G., Lobo, J. R., Sengupta, S., Chen, L., Zincke, H., Blute, M. L., Strome, S. E., Leibovich, B. C., Kwon, E. D. Costimulatory B7-H1 in renal cell carcinoma patients: Indicator of tumor aggressiveness and potential therapeutic target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17174-17179 (2004).
  9. Geng, L., Huang, D., Liu, J., Qian, Y., Deng, J., Li, D., Hu, Z., Zhang, J., Jiang, G., Zheng, S. B7-H1 up-regulated expression in human pancreatic carcinoma tissue associates with tumor progression. J. Cancer Res. Clin. Oncol. 134, 1021-1027 (2008).
  10. Loos, M., Giese, N. A., Kleeff, J., Giese, T., Gaida, M. M., Bergmann, F., Laschinger, M., WB, M., Friess, H. Clinical significance and regulation of the costimulatory molecule B7-H1 in pancreatic cancer. Cancer Lett. 268, 98-109 (2008).
  11. Okudaira, K., Hokari, R., Tsuzuki, Y., Okada, Y., Komoto, S., Watanabe, C., Kurihara, C., Kawaguchi, A., Nagao, S., Azuma, M., Yagita, H., Miura, S. Blockade of B7-H1 or B7-DC induces an anti-tumor effect in a mouse pancreatic cancer model. Int. J. Oncol. 35, 741-749 (2009).
  12. Wang, S., Chen, L. Immunobiology of cancer therapies targeting CD137 and B7-H1/PD-1 cosignal pathways. Curr. Top Microbiol. Immunol. 344, 245-267 (2011).
  13. Thompson, R. H., Webster, W. S., Cheville, J. C., Lohse, C. M., Dong, H., Leibovich, B. C., Kuntz, S. M., Sengupta, S., Kwon, E. D., Blute, M. L. B7-H1 glycoprotein blockade: a novel strategy to enhance immunotherapy in patients with renal cell carcinoma. Urology. 66, 10-14 (2005).
  14. Thompson, R. H., Kuntz, S. M., Leibovich, B. C., Dong, H., Lohse, C. M., Webster, W. S., Sengupta, S., Frank, I., Parker, A. S., Zincke, H., Blute, M. L., Sebo, T. J., Cheville, J. C., Kwon, E. D. Tumor B7-H1 is associated with poor prognosis in renal cell carcinoma patients with long-term follow-up. Cancer Res. 66, 3381-3385 (2006).
  15. Thompson, R. H., Dong, H., Kwon, E. D. Implications of B7-H1 expression in clear cell carcinoma of the kidney for prognostication and therapy. Clin. Cancer Res. 13, 709s-715s (2007).
  16. Karim, R., Jordanova, E. S., Piersma, S. J., Kenter, G. G., Chen, L., Boer, J. M., Melief, C. J., vander Burg, S. H. Tumor-expressed B7-H1 and B7-DC in relation to PD-1+ T-cell infiltration and survival of patients with cervical carcinoma. Clin. Cancer Res. 15, 6341-6347 (2009).
  17. Inman, B. A., Sebo, T. J., Frigola, X., Dong, H., Bergstralh, E. J., Frank, I., Fradet, Y., Lacombe, L., Kwon, E. D. PD-L1 (B7-H1) expression by urothelial carcinoma of the bladder and BCG-induced granulomata: associations with localized stage progression. Cancer. 109, 1499-1505 (2007).
  18. Brahmer, J. R., Drake, C. G., Wollner, I., Powderly, J. D., Picus, J., Sharfman, W. H., Stankevich, E., Pons, A., Salay, T. M., McMiller, T. L., Gilson, M. M., Wang, C., Selby, M., Taube, J. M., Anders, R., Chen, L., Korman, A. J., Pardoll, D. M., Lowy, I., Topalian, S. L. Phase I study of single-agent anti-programmed death-1 (MDX-1106) in refractory solid tumors: safety, clinical activity, pharmacodynamics, and immunologic correlates. J. Clin. Oncol. 28, 3167-3175 (2010).
  19. Wang, L., Ma, Q., Chen, X., Guo, K., Li, J., Zhang, M. Clinical significance of B7-H1 and B7-1 expressions in pancreatic carcinoma. World J. Surg. 34, 1059-1065 (2010).
  20. Nomi, T., Sho, M., Akahori, T., Hamada, K., Kubo, A., Kanehiro, H., Nakamura, S., Enomoto, K., Yagita, H., Azuma, M., Nakajima, Y. Clinical significance and therapeutic potential of the programmed death-1 ligand/programmed death-1 pathway in human pancreatic cancer. Clin. Cancer Res. 13, 2151-2157 (2007).
  21. Taube, J. M., Anders, R. A., Young, G. D., Xu, H., Sharma, R., McMiller, T. L., Chen, S., Klein, A. P., Pardoll, D. M., Topalian, S. L., Chen, L. Colocalization of inflammatory response with B7-h1 expression in human melanocytic lesions supports an adaptive resistance mechanism of immune escape. Sci. Transl. Med. 4, 127ra37(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

DAB
تلوين المناعى من H1-B7 (PD-L1) على البارافين جزءا لا يتجزأ من النسيج الشرائح غدية البنكرياس
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.