مقالة منهجية

عملية الوحش الأخضر لتوليد سلالات الخميرة حمل حذوفات متعددة الجينات

13.9K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/4072

⸱

ديسمبر 15, 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Synthetic Biology and Bioenergy, J. Craig Venter Institute, 2Department of Microbial and Environmental Genomics, J. Craig Venter Institute, 3Donnelly Centre & Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 4Lunenfeld Research Institute, Mt Sinai Hospital

في هذه المقالة

ملخص

طريقة الوحش الأخضر تمكن الجمعية من الحذف السريع متعددة ملحوظ مع بروتين الجين الترميز مراسل الخضراء الفلورية. ويستند هذا الأسلوب على القيادة سلالات الخميرة من خلال دورات متكررة من تشكيلة الجنسي للالحذف ومضان على أساس تخصيب الخلايا تحمل أكثر الحذف.

الملخص

غالبا ما يتم الكشف عن الظواهر لحذف الجينات فقط عندما يتم اختبار الطفرة الوراثية في خلفية معينة أو البيئية 1،2 الشرط. هناك أمثلة حيث العديد من الجينات تحتاج إلى حذف وظائف الجينات لكشف المخفي 3،4. على الرغم من إمكانية الاكتشافات الهامة، لم تستكشف بعد بشكل كبير التفاعلات الوراثية التي تنطوي على ثلاثة أو أكثر من الجينات. والبحث حصرية متعددة متحولة التفاعلات غير عملي نظرا للعدد الهائل من التوليفات الممكنة من الحذف. ومع ذلك، فإن الدراسات من مجموعات مختارة من الجينات، مثل مجموعات من paralogs مع فرصة أكبر مسبق من أشكال تقاسم وظيفة مشتركة، تكون غنية بالمعلومات.

في الخميرة خميرة الخباز، ويتم إنجاز خروج المغلوب من خلال استبدال الجينات الجين مع علامة اختيار إعادة التركيب مثلي عبر. لأن عدد علامات محدودة، وقد وضعت طرق لإزالة وإعادة استخدام سام ه علامة 5،6،7،8،9،10. ومع ذلك، والطفرات الهندسة بالتسلسل متعددة باستخدام هذه الأساليب وقتا طويلا لأن الوقت اللازم جداول خطيا مع عدد من الحذف يمكن إنشاء.

نحن هنا وصف الأسلوب الوحش الأخضر للهندسة بشكل روتيني الحذف متعددة في الخميرة 11. في هذه الطريقة، يتم استخدام البروتين الأخضر نيون (GFP) مراسل دمجها في الحذف لسلالات التسمية من الناحية الكمية وفقا لعدد من الحذف الواردة في كل سلالة (الشكل 1). جولات متكررة من مجموعة متنوعة من GFP وضع علامات الحذف عن طريق التزاوج الخميرة والانقسام الاختزالي إلى جانب تدفق cytometric تخصيب سلالات تحمل أكثر من هذه الحذف يؤدي إلى تراكم الضغوط في الحذف (الشكل 2). أداء عدة عمليات في نفس الوقت، مع كل عملية دمج واحدة أو أكثر الحذف لكل جولة، ويقلل من الوقت اللازم للبناء سلالة. المحتوى "> الخطوة الأولى هي إعداد فرداني واحد يسمى طفرات 'ProMonsters،' كل منها يحمل مراسل GFP في موضع حذف واحد من" مجموعة أدوات "مواضع، إما GMToolkit-A الوحش الأخضر أو GMToolkit α-في . can1Δ مكان (الشكل 3) باستخدام سلالات من الخميرة جمع حذف 12، يمكن GFP بعلامات الحذف ولدت مريح عن طريق استبدال مشتركة KanMX4 الكاسيت الموجودة في هذه السلالات مع GFP عالمية - جزء يحتوي على كل URA3 GMToolkit: إما أ - أو α-التزاوج من نوع خاص علامة اختيار فرداني 1 و بالضبط واحدة من علامات اللذين عند كل GMToolkits موجودة، تسمح بشكل جماعي لاختيار diploids.

والخطوة الثانية هي لتنفيذ ركوب الدراجات من خلال الجنسي التي يمكن دمجها ضمن مواضع الحذف خلية واحدة من تشكيلة عشوائية و / أو recomb الانتصافيination التي ترافق كل دورة من التزاوج وتبوغ.

البروتوكول

1. جيل من ProMonsters

  1. إعداد استبدال GFP العالمية الكاسيت عن طريق تضخيم وتيتو 2-GFP علامة وعلامة URA3 من pYOGM012 بلازميد (الأمبيسلين المقاومة) باستخدام الاشعال مع تسلسل:
    GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG وGTACCGGGTAATAACTGATATAAT GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC (المناطق الغامق توفير التماثل إلى المناطق المحيطة من الكاسيت KanMX4 السماح استبدال المستهدفة). وينبغي إجراء رد فعل البلمرة PCR خارجا مع Phusion، HF العازلة، وثنائي ميثيل سلفوكسيد 3٪ (نيو انغلاند Biolabs) بدءا من قالب تركيز الحمض النووي من 0.5 نانوغرام / ميكرولتر. برنامج PCR هو 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 35 ° C دورات 98 ل 10 ثانية و 49 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة. يجب أن يكون حجم رد الفعل> 50 ميكرولتر لتوفير ما يكفي من الحمض النووي لكل تجربة التحول. نحن تنقيةقد المنتج باستخدام PCR تنقية QIAquick مجموعة (QIAGEN) مع 50 ميكرولتر من رد فعل ~ PCR معالجتها لكل عمود، ولكن تخطي الخطوة تنقية زيادة الغلة من transformants.
    بدلا من ذلك، الإفراج عن جزء يحتوي على تيتو 2-GFP وURA3 علامات، فضلا عن مثلي المناطق لاستهداف KanMX4، من خلال هضم البلازميد pYOGM057 (الأمبيسلين المقاومة) باستخدام انزيم تقييد EcoRI (نيو انغلاند Biolabs). وينبغي تركيز الحمض النووي في رد الفعل هذا يكون ~ 30 نانوغرام / ميكرولتر. يجب أن يكون حجم رد الفعل> 34 ميكرولتر.
    لإدماج كاسيت GFP إلى منطقة أخرى من KanMX4، وضبط منطقة تماثل للالاشعال PCR أعلاه إلى متواليات مثلي المناسبة.
  2. تحويل سلالة A-فرداني من مجموعة الخميرة خروج المغلوب KanMX4 12 مع حذف كاسيت GFP عالمية. بعد بروتوكول ميكرولتر من قبل بريتون وGietz 0.34 13 منعينة DNA ينبغي (PCR تنقية المنتج أو تقييد غير المنقى هضم) يمكن أن تستخدم لكل تجربة التحول. لوحة الخامس من الخليط التحول واحدة على لوحة CAA-أورا (0.67٪ قاعدة النيتروجين الخميرة والجلوكوز 2٪، 0.6٪ حمض casamino، hemisulfate الأدينين 0.0025٪، 0.005٪ التربتوفان، وأجار 2٪).
  3. خط خارج transformants على طبق من CAA-أورا جديدة للحصول على مستعمرات معزولة.
  4. نقل الخلايا من مستعمرة إلى لوحة تحتوي على 200 ميكروغرام YPDA / مل G418 لتأكيد عدم وجود نمو. لتأكيد نجاح التكامل GFP، اتبع الخطوات التالية (1.5) - (1.9) لأداء PCR مستعمرة.
  5. إضافة خلايا مأخوذة من مستعمرة الى 2 ميكرولتر من العازلة تحلل (0.1 فوسفات الصوديوم M، درجة الحموضة 7.4، 1 وحدة من zymolyase ZymoResearch) في أنبوب PCR 0.2 مل أو بئر لوحة 96-أيضا. مزيج من pipetting الحل والخروج من تلميح ماصة.
  6. تراكب مع قطرة واحدة (حوالي 20 ميكرولتر) من الزيوت المعدنية باستخدام Pipetman P200 (جيلسون).
  7. احتضان عند 37 درجة خليطC لمدة 20 دقيقة، ثم في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  8. تمييع المحللة مع 50 ميكرولتر المياه. مزيج من pipetting الحل داخل وخارج عشر مرات.
  9. تحليل 1 ميكرولتر من استخدام المحللة 10-PCR ميكرولتر ردود الفعل مع التمهيدي ل(A) إلى الأمام أن anneals إلى المنطقة المحيطة المنبع يقترن التمهيدي للCCTGAGAAAGCAACCTGACC تسلسل (285 بي بي من بداية كاسيت)، (B) عكس أن anneals التمهيدي للمنطقة المصب يقترن التمهيدي للGCATTGGGTCAACAGTATAG تسلسل (375 BP من نهاية)، (C) اثنان الاشعال أن يصلب لKanMX4 مع تسلسل CGTACTCCTGATGATGCATG وGACGAAATACGCGATCGCTG (181 BP)، و (D) اثنان الاشعال أن يصلب إلى تسلسل من النوع البري من الجين المستهدفة (الشكل 4). (D) مهم جدا لأنه من المعروف عن 8٪ من سلالات في مجموعات الحذف لاحتواء اختلال الصيغة الصبغية 14. وينبغي أن يكون الصحيح transformant تكون إيجابية مع (A) ومع (B)، وسلبية (C) و (D)
  10. لإدخالGMToolkit في transformant، إضافة ما يقرب من 250،000 من سلالة خلايا تحول الخلايا و 250،000 من RY0146 إما (التي تحتوي على GMToolkit-A) أو RY0148 (التي تحتوي على GMToolkit-α) في أنبوب إيبندورف 1.6 مل. دوامة. الطرز الوراثية من RY0146 وRY0148 هي MATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-A [CMVpr-rtTA KanMX4 STE2pr-SP-his5] وMATα lyp1Δ his3Δ1 leu2Δ0 ura3Δ0 met15Δ0 can1Δ :: GMToolkit-α [CMVpr-rtTA NatMX4 STE3pr- LEU2]، على التوالي. العلاقات العامة يدل على المروج. وينبغي تقدير عدد الخلايا من الكثافة الضوئية للثقافة السابقة.
  11. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 2 دقيقة.
  12. إزالة طاف.
  13. للسماح لتبادل الهواء، وجعل ثقب في الغطاء باستخدام الدبوس تعامل مع الايثانول 70٪.
  14. إضافة 50 ميكرولتر من YPDA المتوسطة (1٪ خلاصة الخميرة، ببتون 2٪، الجلوكوز 2٪، وhemisulfat الأدينين 0.003٪ه). دوامة.
  15. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 5 دقائق.
  16. وضع أنبوب في مربع رطبة. يمكن إنشاء هذا مع تلميح مربع فارغ، موقفا تلميح صغيرة، ومنشفة ورقية رطبة.
  17. احتضان بين عشية وضحاها مربع في 30 ° C.
  18. حدد diploids تزاوج معها أولا streaking على خلايا الجهاز المركزي للمحاسبات على طبق من ذهب، أورا. احتضان لوحة في C ° 30 ليوم واحد.
  19. أخذ الخلايا من خط السائبة، ومنطقة بها لجعل المستعمرات المعزولة على لوحات YPDA (1٪ خلاصة الخميرة، ببتون 2٪، الجلوكوز 2٪، 0.003٪ hemisulfate الأدينين، وأجار 2٪) تحتوي على 200 ميكروغرام / مل G418 لاختيار diploids تحتوي على واحد أو GMToolkit 100 ميكروغرام / مل nourseothricin (NAT) 15 لاختيار diploids تحتوي على GMToolkit-α.
  20. احتضان لوحة في C ° 30 لمدة 3 أيام.
  21. بدءا من مستعمرة معزولة، ونقل معظم الخلايا إلى 500 ميكرولتر من دون المتوسطة GNA أجار (1 خلاصة الخميرة٪، 3٪ Difco المرق المغذي، والجلوكوز 5٪؛ الجلوكوز الأوتوكلاف وبقية رانه المكونات بشكل منفصل كما خففت حلول × 2 لتجنب انتاج الكراميل) في أنبوب مل ثقافة 5-مع الغطاء.
  22. تدوير أنبوب أفقيا لمدة خمس ساعات في 30 ° C. محور دوران يجب أن يكون موازيا لمحور الطولي للأنبوب.
  23. تأكد من أن تستخدم في المستعمرات (1.21) + هي أورا بواسطة streaking بها على لوحة CAA-أورا.
  24. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب في 800 x ج لمدة 2 دقيقة. تجاهل طاف.
  25. إضافة 500 ميكرولتر من تبوغ الحد الأدنى المتوسطة (1٪ خلات البوتاسيوم، الزنك خلات 0.005٪؛ فلتر تعقيم). دوامة.
  26. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب في 800 x ج لمدة 2 دقيقة. تجاهل طاف.
  27. كرر (1.25) - (1.26) مرتين.
  28. إضافة 1 مل من المتوسط ​​تبوغ الحد الأدنى تستكمل مع 7.5 ميكروغرام / مل يسين، ميكروغرام 7.5 / مل يسين، 5 ميكروغرام / مل الحامض الاميني، 5 ميكروغرام / مل ميثيونين، و 1.25 ميكروغرام / مل اليوراسيل (لتعزيز قيم تبوغ من سلالات العوز الغذائي) . دوامة.
  29. تدوير أنبوب في درجة حرارة الغرفة ليوم واحد.
  30. تدوير أنبوب في C ° 30 ل 2 أيام.
  31. أجهزة الطرد المركزي 125 ميكرولتر من هذا الخليط في أنبوب إيبندورف 1.6 مل في 800 x ج لمدة 2 دقيقة. تجاهل طاف.
  32. إضافة 50 ميكرولتر من حل zymolyase (100 ملي فوسفات الصوديوم العازلة، ودرجة الحموضة 7.4، 1 M السوربيتول، و2 وحدة من zymolyase ZymoResearch). مزيج من pipetting الحل والخروج من تلميح ماصة.
  33. احتضان في C ° 30 لمدة 1 ساعة.
  34. إضافة 50 ميكرولتر من 0.02٪ NP-40. مزيج من pipetting الحل والخروج من تلميح ماصة.
  35. ترك الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق.
  36. إضافة 500 ميكرولتر من الماء.
  37. وضع أنبوب على الجليد.
  38. يصوتن هذا الخليط مرتين في إعداد خرج من 1 (أضعف الإعداد) لمدة 15 ثانية باستخدام 3.2 مم microtip مع 450 Sonifier (برانسون). بين جولتي صوتنة، وضع أنبوب على الجليد للعودة درجة الحرارة إلى C. ~ ° 0
  39. أجهزة الطرد المركزي أنابيب في 800 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف.
  40. أضف 200 ميكرولتر من صاحب-SC-أورا(أ) أو SC-أورا-ليو (α) المتوسطة، وهذا يتوقف على ما إذا كان الصليب هو لدمج GMToolkit-A أو GMToolkit α. لإعداد وسائل الإعلام، وجعل SC-أورا-ليو صاحب-المتوسطة (0.67٪ قاعدة النيتروجين الخميرة والجلوكوز 2٪، 0.01٪ أرجينين، حمض الأسبارتيك 0.01٪، 0.01٪ حمض الجلوتاميك، آيسولوسين 0.01٪، 0.01٪ ليسين، 0.01٪ ميثيونين ، 0.01٪ فينيل ألانين، سيرين 0.08٪، 0.04٪ ثريونين، التيروزين 0.002٪، 0.03٪ حمض أميني أساسي، الأدينين 0.0025٪، 0.005٪ التربتوفان، الأدينين 0.003٪، 0.005٪ والتربتوفان) وتكملة مع الحامض الاميني ليسين أو معقمة قبل استخدامها لل النهائي تركيز 0.01٪.
  41. جعل ثقب في الغطاء باستخدام الدبوس تعامل مع الايثانول 70٪.
  42. تدوير أنبوب أفقيا في C ° 30 ل 2 أيام. محور دوران يجب أن يكون موازيا لمحور الطولي للأنبوب.
  43. يجب إضافة حمض الأسبارتيك وثريونين بعد؛ متتالية من الخلايا على طبق أجار-SC-أورا أو صاحب SC-أورا ليو-(نفس المكونات على النحو الوارد أعلاه بالإضافة إلى أجار 2٪utoclaving؛ إضافة الحامض الاميني ليسين أو قبل صب) لجعل المستعمرات المعزولة للسلالات ProMonster.

2. ركوب الدراجات الجنسي

  1. تدوير ثقافة عبئا GFP حذف أنشئت في 100 ميكرولتر من صاحب SC-(أ) أو SC-ليو (α) اعتمادا على نوع التزاوج في 30 ° C باستخدام أنبوب إيبندورف بين عشية وضحاها 1.6 مل. لتبادل الهواء، وجعل حفرة باستخدام الدبوس تعامل مع الايثانول 70٪. تدوير أنبوب أفقيا. محور دوران يجب أن يكون موازيا لمحور الطولي للأنبوب. فمن الممكن لعبور سلالات متعددة عبر التزاوج بأعداد كبيرة. عند استخدام عينة تم الفرز مباشرة لهذا الغرض، والثقافة الخلايا في 200 ميكرولتر في C ° 30 ل 2 أيام. لإعداد المتوسطة، إضافة اليوراسيل (تركيز النهائي: 0.0025٪) والحامض الاميني (0.01٪) أو ليسين (0.01٪) لSC-أورا-ليو صاحب-المتوسطة.
  2. مزيج 250،000 A-فرداني الخلايا α و 250،000-فرداني خلايا سلالات حذف GFP في EPPE 1.6 ملndorf الأنبوب. دوامة.
  3. تتزاوج هذه الخلايا عن طريق الخطوات التالية (1.11) - (1.17).
  4. نقل 10 ميكرولتر من خليط التزاوج إلى 500 ميكرولتر المتوسطة GNA تحتوي على 200 ميكروغرام / مل وG418 ميكروغرام 100 / مل نات في أنبوب مل ثقافة 5-مع غطاء خففت. وتبدأ OD 600 هو 0.1 تقريبا.
  5. تدوير الثقافة في C ° 30 لمدة 24 ساعة. وهذا يسمح لاختيار diploids لأن diploids فقط تحتوي على كل KanMX4 في GMToolkit واحد وNatMX4 في GMToolkit-α يمكن أن تنمو في وجود G418 ونات (الشكل 3).
  6. نقل 20 ميكرولتر من الثقافة ليوم واحد إلى 500 ميكرولتر من GNA الطازجة التي تحتوي على G418 ونات. وتبدأ OD 600 هو تقريبا 0.2.
  7. تدوير أنبوب في C ° 30 ساعة لمدة 5 لجلب الخلايا إلى مرحلة دخول (OD 600 من ~ 1).
  8. اتبع الخطوات (1.24) - (1.38) إلى بذرت في diploids وعزل الجراثيم.
  9. تقسيم الخلايا تعليق sporulated إلى قسمين ميكرولتر-300أجزاء ووضع كل في أنبوب إيبندورف منفصلة 1.5 مل.
  10. أجهزة الطرد المركزي أنابيب في 800 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف.
  11. لبيليه من أنبوب واحد، إضافة 100 ميكرولتر من SC-المتوسطة لتحديد صاحب النباتات الاحاديه. لبيليه من الأنبوب أخرى، إضافة 100 ميكرولتر من SC-ليو المتوسطة لتحديد α-النباتات الاحاديه.
  12. تدوير أنابيب في 30 درجة مئوية خلال الليل. ينبغي أن تكون 600 OD النهائي أقل من 0.5. إذا OD 600 تميل إلى أن تكون عالية جدا، حاول زراعة في درجة حرارة الغرفة.
  13. للحث على GFP، إضافة 100 ميكرولتر من جديد SC-صاحب (أ) أو SC-ليو (α) المتوسط ​​تحتوي على 20 ميكروغرام / مل الدوكسيسيكلين. تركيز النهائي من الدوكسيسيكلين هو 10 ميكروغرام / مل. دوامة.
  14. تدوير أنابيب في C ° 30 ل 2 أيام.

3. تدفق الخلوي

  1. تبادلت إضافة 900 ميكرولتر من العازلة TE قبل تصفيتها (الرقم الهيدروجيني 7.5) تحتوي على 10 ميكروغرام / مل الدوكسيسيكلين لأنبوب البولي بروبلين 5-مل (BD الصقر # 352063) مع غطاء مع الخلايامصفاة غطاء من أنبوب البوليسترين 5-مل (BD الصقر # 352235). أنابيب البولي بروبلين هي مناسبة لقياس التدفق الخلوي. هو المطلوب الغطاء مصفاة لإزالة الجزيئات الكبيرة.
  2. وضع بلطف 75 ميكرولتر من العازلة TE مع الدوكسيسيكلين على الغطاء الخلية مصفاة.
  3. إضافة 25 ميكرولتر من الخلايا المستحثة في حل على الغطاء.
  4. أثناء الضغط على طرف Pipetman ضد شبكة، واطلاق النار على كل من الحل المشترك من خلال مصفاة.
  5. اضغط لأسفل الغطاء مصفاة ودوامة الأنبوب.
  6. إعداد أنابيب جمع (1.6 مل أنابيب إيبندورف) شغلها مع 200 ميكرولتر من SC-SC أو صاحب ليو.
  7. بدء فارز الخلية وضبط إعدادات وفقا لدليل الشركة المصنعة.
  8. دوامة أنبوب جمع كلا من (لطلاء الجدار مع متوسطة) والتي تحتوي على الخلايا أنبوب قبل تحميلها على فارز الخلية.
  9. الحصول على بيانات التدفق الخلوي من العينة. ويمكن لسلالة لا تحتوي على عنصر تحكم GFP تكون سلبية.
  10. رسم بوابات للفرز. (A)لتجنب المجاميع الخلية، والتي يمكن أن تظهر ارتفاع كثافة GFP، ونبذ القيم المتطرفة مع عرض النبض كبيرة بشكل غير متناسب لمبعثر إلى الأمام (FSC) باستخدام قطعة عرض النبض وارتفاع النبض لفارز MoFlo أو ارتفاع FSC الصغيرة بصورة غير متناسبة باستخدام قطعة ارتفاع FSC وFSC منطقة لفارز FACSAria (الشكل 5، العلوية اليسرى لوحة). (B) حيث من المتوقع FSC كبيرة (منطقة) بالنسبة للمجاميع الخلية، تأخذ فقط الخلايا في 20 في٪ أقل FSC، مع تجنب المناطق التي شهدت أدنى مبعثر FSC والجانب (SSC) حيث القيم كثيرا ما وجدت الحطام الخلية (الشكل 5، العلوية اليمنى لوحة). (C) SSC (منطقة) وإشارة GFP (منطقة) وغالبا ما تكون ارتباطا إيجابيا. لأن مجرد اتخاذ ألمع الخلايا نظرا لبوابات أعلاه من شأنه أن يثري أيضا لخلايا بقيمة عالية SSC، رسم بوابة على طول محيط السكان الذين يستخدمون قطعة كثافة GFP وSSC لاتخاذ نفس النسبة تقريبا من ألمع الخلايا من كل نقطة المحور SSC (الشكل 5، بوتام يسار الرسم البياني). يجب أن السكان في اختيار (C) يكون 0،1-1٪ من السكان في اختيار (B).
  11. فرز 200 خلية في أنبوب جمع بالنظر إلى المعايير الواردة في (3.10). لعملية بأعداد كبيرة أو لمشاريع أخرى تتطلب السكان أكثر تعقيدا، فرز أكثر من الخلايا حسب الحاجة.
  12. دوامة أنبوب جمع لتغطية الخلايا مصنفة مع المتوسط.
  13. لوحة مجموعة فرعية من الخلايا (على سبيل المثال، 50 خلية) على طبق من ذهب لYPDA التنميط الجيني.
  14. احتضان لوحة في C ° 30 ل 2 أيام.
  15. جعل المحللة للمستعمرات 12 ~ اتباع الخطوات (1.5) - (1.8).
  16. نقل الخلايا المتبقية على الطرف المستخدمة في (1.5) إلى بقعة على لوحة تحتوي على YPDA G418 ونات عن طريق لمس برفق لوحة مع طرف. يجب أن لا تنمو النباتات الاحاديه المحددة في هذه اللوحة. قد Diploids على نسخ أكثر GFP، ولذلك يجوز إشراقا. هذا الاختبار يمكن أن تظهر كفاءة اختيار فرداني.
  17. لالتنميط الجيني وتحليل 1 ميكرولتر من المحللة باستخدام PCR ميكرولتر 10-Reaction مع التمهيدي إلى الأمام أن anneals إلى المنطقة المحيطة المنبع من كل جين حذف يقترن التمهيدي للCCTGAGAAAGCAACCTGACC التسلسل.
    ردود فعل متعددة PCR إذا كان ذلك ممكنا (يمكن تحديد الظروف باستخدام لست] واحدة من المسوخ). ويمكن أن يتم PCR في 96 - أو 384 حسنة الشكل. شكل هذا الأخير هو مناسبة لحجم رد فعل اقل من 5 ميكرولتر. Arraying ماجستير PCR يمزج مختلفة في الاشعال وبالإضافة إلى ذلك يمكن أن يتم من الخلية لست] إلى هذه الخلائط من استخدام ماصة متعدد القنوات أو حتى إنسان التعامل مع السائل. التغييرات تلميح اختيارية عند إضافة المحللة نفسها ليمزج PCR مختلفة.
  18. تحليل المنتجات PCR. النظام جل الترا XL V-2 الكهربائي (Labnet) متوافق مع تحميل العينة باستخدام ماصات متعدد القنوات.
  19. بناء على معلومات من (3.16) و(3.18)، وتحديد النباتات الاحاديه المرجح أن المطلوب الأنماط الجينية.
  20. إنشاء هذه السلالات على لوحة جديدة (YPDA، CAA-أورا، أو SC-Ura-His/Leu). أيضا، في تجميدها25٪ الجلسرين في -80 ° C. وأوصت بإجراء اختبارات إضافية مثل التأكيد على عدم وجود من النوع البري تسلسل الجينات لحذف ونابض الميدان الكهربائي للهلام.
  21. تكرار الدراجات الجنسي من (2.1) مع سلالات مفيدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عندما يتقاطع سلالة A-فرداني تقل أربعة الحذف GFP بعلامات (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) مع سلالة α-فرداني تقل أربعة الحذف (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ)، مع اثنين من الحذف (ycl033cΔ yer042wΔ) المشتركة من قبل اثنين من سلالات، وممثل تم الحصول على نتيجة. كان مثقف الخليط التزاوج في المتوسط ​​تحتوي على YPDA G418 ونات لتحديد diploids. تم تربيتها في diploids المتوسطة مما أدى إلى تبوغ. وفرقت الجراثيم عن طريق العلاج zymolyase وصوتنة،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

كما قمنا بتطوير النهج الوحش الأخضر، ونشعر بالقلق مع إمكانية إعادة التركيب بين مختلف الأشرطة استبدال GFP، مما يؤدي إلى إعادة ترتيب الجينوم. تخفيف من هذا الاحتمال هو اختيارنا للخلايا التي خضعت بنجاح جولات متعددة من التزاوج والانقسام الاختزالي. ومن المتوقع أن الخلايا التي تحمل العوامل الوراثية ترتيبها لتكون أقل ملاءمة بعد التزاوج إلى الخلايا دون إعادة ترتيب متطابقة. في الواقع، لم نكن نلاحظ أي عدم الاستقرار الناتجة عن إعادة التركيب الجينوم بين أشرطة GFP 11. ومع ذلك، لا يمكن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل الولايات المتحدة للبحث المتقدم الدفاع كالة مشاريع العقد N66001-12-C-4039 إلى YS، على منحة من مؤسسة ألفرد سلون P. لRSL، والمعاهد الامريكية الوطنية للصحة منح R01 R21 HG003224 وCA130266 لFPRFPR كان كما دعمت من قبل الزمالة من المعهد الكندي للأبحاث المتقدمة والتميز من قبل برنامج كراسي البحث كندا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف أو صك شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
G418 سيغما الدريخ A1720 تذوب في الماء وفلتر تعقيم-(0.2 ميكرون فلتر). تركيز المخزون: 200 ملغ / مل. تخزين في C. ° 4
ClonNAT (nourseothricin) WERNER BioAgents 5001000 تذوب في الماء وفلتر تعقيم-(0.2 ميكرون فلتر). تركيز المخزون: 100 ملغ / مل. تخزين في C. ° 4
الدوكسيسيكلين سيغما الدريخ D9891 تذوب في الايثانول 50٪ وتصفية تعقيم-(0.2 ميكرون فلتر). تركيز المخزون: 10 ملغ / مل. جعل جديدة كل أربعة أسابيع. درع من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم وتخزينها في 4 درجات مئوية.
Zymolyase ZymoResearch E1005
Difco قاعدة النيتروجين الخميرة ث / س الأحماض الأمينية BD 291940
مسدس (المدورة للأنابيب) Labnet H5600
ENDURO الكهربائي XL جل وحدة Labnet E0160
Sonifier 450 برانسون 101-063-198
Microtip لSonifier 450 برانسون 101-148-062
FACSAria الخلية فارز BD
MoFlo الخلية فارز بيكمان كولتر،
Biomek FX أو ما يعادلها الروبوت بيكمان كولتر اختيارية. لإنشاء تقارير إتمام المشروعات التنميط الجيني.

المراجع

  1. Tong, A. H., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science's STKE. 294, 2364-23 (2001).
  2. Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
  3. Beh, C. T., Cool, L., Phillips, J., Rine, J. Overlapping functions of the yeast oxysterol-binding protein homologues. Genetics. 157, 1117(2001).
  4. Wieczorke, R., et al. Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae. FEBS letters. 464, 123-128 (1999).
  5. Alani, E., Cao, L., Kleckner, N. A method for gene disruption that allows repeated use of URA3 selection in the construction of multiply disrupted yeast strains. Genetics. 116, 541-545 (1987).
  6. Akada, R., et al. PCR-mediated seamless gene deletion and marker recycling in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 399-405 (2006).
  7. Guldener, U., Heck, S., Fielder, T., Beinhauer, J., Hegemann, J. H. A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast. Nucleic acids research. 24, 2519(1996).
  8. Delneri, D., et al. Exploring redundancy in the yeast genome: an improved strategy for use of the cre-loxP system. Gene. 252, 127-135 (2000).
  9. Storici, F., Lewis, L. K., Resnick, M. A. In vivo site-directed mutagenesis using oligonucleotides. Nat. Biotech. 19, 773-776 (2001).
  10. Noskov, V. N., Segall-Shapiro, T. H., Chuang, R. Tandem repeat coupled with endonuclease cleavage (TREC): a seamless modification tool for genome engineering in yeast. Nucl. Acids Res. 38, 2570-2576 (2010).
  11. Suzuki, Y., et al. Knocking out multigene redundancies via cycles of sexual assortment and fluorescence selection. Nat. Methods. 8, 159-164 (2011).
  12. Winzeler, E. A. Functional Characterization of the S. Genome by Gene Deletion and Parallel Analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
  13. Woods, R. A., Gietz, R. D. High-efficiency transformation of plasmid DNA into yeast. Methods Mol. Biol. 177, 85-97 (2001).
  14. Hughes, T. R., et al. Widespread aneuploidy revealed by DNA microarray expression profiling. Nature. 25, 333-337 (2000).
  15. Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15, 1541-1553 (1999).
  16. Newman, J. R. S., et al. Single-cell proteomic analysis of S. cerevisiae reveals the architecture of biological noise. Nature. 441, 840-846 (2006).
  17. Rosenfeld, N., Young, J. W., Alon, U., Swain, P. S., Elowitz, M. B. Gene regulation at the single-cell level. Science. 307, 1962(2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GFP

مقالات ذات صلة