طريقة الوحش الأخضر تمكن الجمعية من الحذف السريع متعددة ملحوظ مع بروتين الجين الترميز مراسل الخضراء الفلورية. ويستند هذا الأسلوب على القيادة سلالات الخميرة من خلال دورات متكررة من تشكيلة الجنسي للالحذف ومضان على أساس تخصيب الخلايا تحمل أكثر الحذف.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
عملية الوحش الأخضر لتوليد سلالات الخميرة حمل حذوفات متعددة الجينات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
غالبا ما يتم الكشف عن الظواهر لحذف الجينات فقط عندما يتم اختبار الطفرة الوراثية في خلفية معينة أو البيئية 1،2 الشرط. هناك أمثلة حيث العديد من الجينات تحتاج إلى حذف وظائف الجينات لكشف المخفي 3،4. على الرغم من إمكانية الاكتشافات الهامة، لم تستكشف بعد بشكل كبير التفاعلات الوراثية التي تنطوي على ثلاثة أو أكثر من الجينات. والبحث حصرية متعددة متحولة التفاعلات غير عملي نظرا للعدد الهائل من التوليفات الممكنة من الحذف. ومع ذلك، فإن الدراسات من مجموعات مختارة من الجينات، مثل مجموعات من paralogs مع فرصة أكبر مسبق من أشكال تقاسم وظيفة مشتركة، تكون غنية بالمعلومات.
في الخميرة خميرة الخباز، ويتم إنجاز خروج المغلوب من خلال استبدال الجينات الجين مع علامة اختيار إعادة التركيب مثلي عبر. لأن عدد علامات محدودة، وقد وضعت طرق لإزالة وإعادة استخدام سام ه علامة 5،6،7،8،9،10. ومع ذلك، والطفرات الهندسة بالتسلسل متعددة باستخدام هذه الأساليب وقتا طويلا لأن الوقت اللازم جداول خطيا مع عدد من الحذف يمكن إنشاء.
نحن هنا وصف الأسلوب الوحش الأخضر للهندسة بشكل روتيني الحذف متعددة في الخميرة 11. في هذه الطريقة، يتم استخدام البروتين الأخضر نيون (GFP) مراسل دمجها في الحذف لسلالات التسمية من الناحية الكمية وفقا لعدد من الحذف الواردة في كل سلالة (الشكل 1). جولات متكررة من مجموعة متنوعة من GFP وضع علامات الحذف عن طريق التزاوج الخميرة والانقسام الاختزالي إلى جانب تدفق cytometric تخصيب سلالات تحمل أكثر من هذه الحذف يؤدي إلى تراكم الضغوط في الحذف (الشكل 2). أداء عدة عمليات في نفس الوقت، مع كل عملية دمج واحدة أو أكثر الحذف لكل جولة، ويقلل من الوقت اللازم للبناء سلالة. المحتوى "> الخطوة الأولى هي إعداد فرداني واحد يسمى طفرات 'ProMonsters،' كل منها يحمل مراسل GFP في موضع حذف واحد من" مجموعة أدوات "مواضع، إما GMToolkit-A الوحش الأخضر أو GMToolkit α-في . can1Δ مكان (الشكل 3) باستخدام سلالات من الخميرة جمع حذف 12، يمكن GFP بعلامات الحذف ولدت مريح عن طريق استبدال مشتركة KanMX4 الكاسيت الموجودة في هذه السلالات مع GFP عالمية - جزء يحتوي على كل URA3 GMToolkit: إما أ - أو α-التزاوج من نوع خاص علامة اختيار فرداني 1 و بالضبط واحدة من علامات اللذين عند كل GMToolkits موجودة، تسمح بشكل جماعي لاختيار diploids.
والخطوة الثانية هي لتنفيذ ركوب الدراجات من خلال الجنسي التي يمكن دمجها ضمن مواضع الحذف خلية واحدة من تشكيلة عشوائية و / أو recomb الانتصافيination التي ترافق كل دورة من التزاوج وتبوغ.
البروتوكول
1. جيل من ProMonsters
- إعداد استبدال GFP العالمية الكاسيت عن طريق تضخيم وتيتو 2-GFP علامة وعلامة URA3 من pYOGM012 بلازميد (الأمبيسلين المقاومة) باستخدام الاشعال مع تسلسل:
GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCG وGTACCGGGTAATAACTGATATAAT GGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC (المناطق الغامق توفير التماثل إلى المناطق المحيطة من الكاسيت KanMX4 السماح استبدال المستهدفة). وينبغي إجراء رد فعل البلمرة PCR خارجا مع Phusion، HF العازلة، ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عندما يتقاطع سلالة A-فرداني تقل أربعة الحذف GFP بعلامات (ycl033cΔ yer042wΔ ykl069wΔ yol118cΔ) مع سلالة α-فرداني تقل أربعة الحذف (ycl033cΔ ydl242wΔ ydl227cΔ yer042wΔ)، مع اثنين من الحذف (ycl033cΔ yer042wΔ) المشتركة من قبل اثنين من سلالات، وممثل تم الحصول على نتيجة. كان مثقف الخليط التزاوج في المتوسط تحتوي على YPDA G418 ونات لتحديد diploids. تم تربيتها في diploids المتوسطة مما أدى إلى تبوغ. وفرقت الجراثيم عن طريق العلاج zymolyase وصوتنة،.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كما قمنا بتطوير النهج الوحش الأخضر، ونشعر بالقلق مع إمكانية إعادة التركيب بين مختلف الأشرطة استبدال GFP، مما يؤدي إلى إعادة ترتيب الجينوم. تخفيف من هذا الاحتمال هو اختيارنا للخلايا التي خضعت بنجاح جولات متعددة من التزاوج والانقسام الاختزالي. ومن المتوقع أن الخلايا التي تحمل العوامل الوراثية ترتيبها لتكون أقل ملاءمة بعد التزاوج إلى الخلايا دون إعادة ترتيب متطابقة. في الواقع، لم نكن نلاحظ أي عدم الاستقرار الناتجة عن إعادة التركيب الجينوم بين أشرطة GFP 11. ومع ذلك، لا يمكن.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل الولايات المتحدة للبحث المتقدم الدفاع كالة مشاريع العقد N66001-12-C-4039 إلى YS، على منحة من مؤسسة ألفرد سلون P. لRSL، والمعاهد الامريكية الوطنية للصحة منح R01 R21 HG003224 وCA130266 لFPRFPR كان كما دعمت من قبل الزمالة من المعهد الكندي للأبحاث المتقدمة والتميز من قبل برنامج كراسي البحث كندا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف أو صك | شركة | كتالوج رقم | التعليقات (اختياري) |
| G418 | سيغما الدريخ | A1720 | تذوب في الماء وفلتر تعقيم-(0.2 ميكرون فلتر). تركيز المخزون: 200 ملغ / مل. تخزين في C. ° 4 |
| ClonNAT (nourseothricin) | WERNER BioAgents | 5001000 | تذوب في الماء وفلتر تعقيم-(0.2 ميكرون فلتر). تركيز المخزون: 100 ملغ / مل. تخزين في C. ° 4 |
| الدوكسيسيكلين | سيغما الدريخ | D9891 | تذوب في الايثانول 50٪ وتصفية تعقيم-(0.2 ميكرون فلتر). تركيز المخزون: 10 ملغ / مل. جعل جديدة كل أربعة أسابيع. درع من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم وتخزينها في 4 درجات مئوية. |
| Zymolyase | ZymoResearch | E1005 | |
| Difco قاعدة النيتروجين الخميرة ث / س الأحماض الأمينية | BD | 291940 | |
| مسدس (المدورة للأنابيب) | Labnet | H5600 | |
| ENDURO الكهربائي XL جل وحدة | Labnet | E0160 | |
| Sonifier 450 | برانسون | 101-063-198 | |
| Microtip لSonifier 450 | برانسون | 101-148-062 | |
| FACSAria الخلية فارز | BD | ||
| MoFlo الخلية فارز | بيكمان كولتر، | ||
| Biomek FX أو ما يعادلها الروبوت | بيكمان كولتر | اختيارية. لإنشاء تقارير إتمام المشروعات التنميط الجيني. |
المراجع
- Tong, A. H., et al. Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. Science's STKE. 294, 2364-23 (2001).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Scie....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
