نحن في هذا الفيديو لشرح كيفية استخدام الجهاز بدون ارتباط الخلايا العصبية ميكروفلويديك البلازما.
مقالة منهجية
غير البلازما من الربط PDMS للصناعات رخيصة من أجهزة ميكروفلويديك
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في هذا الفيديو ، ونحن لشرح كيفية استخدام الجهاز بدون ارتباط الخلايا العصبية ميكروفلويديك البلازما. في بعض الحالات قد يكون من المرغوب فيه الأجهزة السندات عكسية على الزجاج رقم كورنينج تغطية 1. قد يكون هذا الواجب ، ربما ، إلى نظافة البلازما والتي لا تتوفر. في حالات أخرى ، قد يكون من المستحسن إزالة الجهاز من الزجاج بعد زراعة الخلايا العصبية لأنواع معينة من المجهري أو immunostaining ، على الرغم من أنه ليس من الضروري إزالة الجهاز لimmunostaining حيث يمكن ملطخة الخلايا العصبية في الجهاز. بعض الباحثين ، ومع ذلك ، لا تزال تفضل لإزالة الجهاز. في هذه الحالة ، والترابط عكسها الجهاز على الزجاج غطاء يجعل ذلك ممكنا. هناك بعض العيوب لغير البلازما الرابطة من الأجهزة التي يتم تشكيلها ليس ضيقا كما من الختم. في بعض الحالات قد المحاور تنمو تحت الأخاديد بدلا من خلالهم. أيضا ، لأن الزجاج وPDMS هي مسعور ، والسوائل لا تدخل بسهولة في الجهاز مما يجعل من الضروري في بعض الأحيان لقوة وسائل الإعلام والكواشف الأخرى في الجهاز. وسوف تدخل سوائل الجهاز عبر عمل شعري ، لكنه يأخذ فترة أطول كثيرا بالمقارنة مع الأجهزة التي تم البلازما المستعبدين. نظافة البلازما المائية يخلق رسوم مؤقتة على الزجاج والأجهزة التي تسهل تدفق السوائل عن طريق الجهاز بعد الربط في غضون ثوان. لغير ملزمة أجهزة البلازما ، وتدفق السائل من خلال أجهزة تستغرق عدة دقائق. من المهم أيضا أن نلاحظ أن ليتم استخدامها مع أجهزة البلازما عدم الربط يجب أن يتم تعقيمها الأولى ، في حين أن أجهزة البلازما المعالجة لا بد من تعقيمها قبل استخدامها لأن نظافة البلازما وتعقيم لهم.
البروتوكول
إعداد أجهزة ميكروفلويديك للثقافة الخلية العصبية
1) النظافة كورنينج NO.1 24 مم X 40 مم الشرائح الزجاجية
- يصوتن الشرائح الزجاجية في المياه sonicator حمام لمدة 30 دقيقة
- شطف شرائح الزجاج مع EtOH 70 ٪
- يغسل ثلاث مرات مع الشرائح درهم 2 O
- الجافة الشرائح في نسيج الثقافة غطاء لعدة ساعات ، ويفضل بين عشية وضحاها
ملاحظة : لقد صواني معدنية خاصة أننا مع تحميل الشرائح. يتم فصل على حدة وتوضع الشرائح في فتحات في هذا رف معدني. يمكن أن نضع هذه الصواني ثم تحميل المعدنية في طبق زجاج أننا مع ملء مكان ، والماء في الماء sonicator الحمام ، ويصوتن لمدة 30 دقيقة. وتنفذ يغسل اللاحقة في هذا الطبق.
2) إعداد الأجهزة PDMS
- قطع القالب PDMS من رقاقة السيليكون ، والثقوب لكمة في المدلى بها والربع PDSM أنها
- تنظيف الأجهزة التي تهب PDMS أول شحنة من الغاز الخامل (الأرجون أو النيتروجين) عبرها. ثم استخدام العلامة التجارية 3M سكوتش 471 الشريط لرفع الحطام قبالة أي المتبقية
ملاحظة : من المهم للحفاظ على مواجهة الأجهزة. في البداية ، ونحن عندما قطع PDMS بعيدا عن رقاقة السيليكون ، وجنبا إلى جنب في اتصال مع رقاقة هو الجانب نظيف : أنه يحتوي على قنوات ميكروفلويديك. ونحن نحاول أن نكون حذرين ما في وسعنا حتى لا يسبب ضررا للجهاز ، والحفاظ على وجهه الجانب نظيفة حتى أننا مستعدون للارتباط البلازما.
- الأوتوكلاف الأجهزة في حاويات من البلاستيك
- بعد التعقيم ونظيفة رقم (1) والشرائح الزجاجية كورنينج البلازما أجهزة علاج باستخدام العلامة التجارية Harrick البلازما الأنظف ، www.harrickplasma.com
- وضع أجهزة تنظيف الجانب السلبي على شريحة زجاجية.
الجهاز الآن البلازما المستعبدين إلى الشريحة الزجاجية.
3) الأجهزة مع طلاء بولي L - يسين (PLL)
- يضاف إلى PLL جيدا على كل جانب من الجهاز ، ويسمح لتدفق في البئر خلال المقبل
=> 150 ميكرولتر من PLL لآبار كبيرة و 30 μ ل PLL لأصغر الآبار. فإنه ليس من الضروري أن يكون بالضبط ما دامت هي آبار كاملة.
ملاحظة : اذا نظرتم الى جهاز سترى 4 آبار : يتم توصيل كل اثنين. تريد وضع PLL في واحدة حتى جيدا أنه سوف تتدفق من خلال الجهاز في البئر المقبل.
- السماح لتدفق PLL من خلال الجهاز لمدة 10 دقائق ثم إضافة المزيد من PLL إلى الآبار لملء لهم حتى
- وضع الأجهزة التي تحتوي على PLL في حاضنة على 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعات (يتم بين عشية وضحاها من الأفضل)
- فراغ خارج PLL الزائدة بعد العلاج ، ولكن يجب الحرص على عدم تمتص جميع السائل خارج الجهاز
ملاحظة : لا أريد أن أعرض فقاعات الهواء إلى قنوات أو الغرفة. مجرد فراغ خارج PLL الزائدة في الآبار.
- إضافة تعقيمها درهم 2 O إلى كل بئر على جانبي الجهاز ، والسماح لتدفق البئر غيرها من عمل شعري
الرقم 1 هو رسم تخطيطي لجهاز ميكروفلويديك. لاحظ كيف يتم توصيل الأزرق (سوما الجانب) ، وترتبط الأحمر (الجانب محواري). عندما نقول وضع PLL ، أو المياه أو وسائل الإعلام ، على بئر واحدة على كل جانب من الجهاز ، ما نقصده ، على سبيل المثال ، هو : 150 مكان المجاهدين من 2 تعقيمها O درهم في أحد الأزرق ميكرولتر حسنا 150 درهم من المكان ثم تعقيمها 2 0 في واحدة الأحمر حسنا. فإن الماء (أو PLL ، أو وسائل الإعلام ، أو خلايا) تتدفق من خلال الجهاز إلى جانب المقابلة الأخرى.
الشكل 1
ملاحظة : يرجى ملاحظة أنه سيتم من الآن فصاعدا ، عندما أقول "وسائل الاعلام مكان ، والخلايا ، والمياه أو الآبار PLL في القمة" ، وأنا أشير إلى الرسم البياني أعلاه حيث سوما سيكون على اليسار وعلى محاور عصبية تنمو إلى الحق.
- نضح المياه قبالة (مرة أخرى والحرص على عدم إزالة الكامل لجميع السائل من الجهاز) ، ثم إضافة أخرى ميكرولتر 150 من تعقيمها O 2 درهم واحد لكل اتصال جيد والسماح لها بالتدفق من خلال المقابلة الى جيدا.
- وضع الجهاز يحتوي درهم 2 O في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ، ثم كرر الخطوة يغسل مرة أخرى. يغسل ثلاث مرات مع الأجهزة درهم 2 O لمدة ساعة واحدة لكل منهما ، والذي هو مجموع.
ملاحظة : نظرا لاحتمال أن بورات من PLL يمكن أن تمتص في PDMS ، وبعض في مختبر جون يوصي تفرخ بين عشية وضحاها مع الأجهزة تعقيمها O 2 درهم بعد بضع طيشطف nitial سريعة. وهذا التأكد من أن جميع بورات الإرادة الحرة ليتش من PDMS قبل التحميل من الخلايا. إذا لم يتم ذلك ، قد يكون هناك اطلاق سراح بورات في وسائل الإعلام على مر الزمن ، والتي يمكن أن تؤدي إلى السمسة.
- إضافة الوسائط العصبية القاعدية (NBM) مع العوامل الضرورية (glutamax ، B27 ، PenStrep) إلى أعلى الآبار
ملاحظة : يمكن المحتضنة الأجهزة بين عشية وضحاها ، ومطلي مع الخلايا في اليوم التالي ، أو المحتضنة لا تقل عن 3 ساعات مع عوامل + NMB الطلاء قبل الخلايا.
إعداد الخلايا العصبية للتحميل في أجهزة
نحن نستخدم 18 يوما القديمة القشرة الفئران الجنينية التي نشتريها إما من شركة تدعى بت الدماغ أو مستعدة ذلك هنا في الحرم الجامعي بالنسبة لنا. نحن نفضل الحصول على أنسجة جديدة.
- 1 الحصول على الجنين قشرة الدماغ (2 قطعة من النسيج) المخزنة في البريد إسبات
- يستغرق 3 ماصات زجاجية طويلة واطلاق النار عليهم في كل الأحجام الصغيرة تباعا باستخدام مصباح الكحول
- إزالة الأنسجة من E إسبات مع ماصة الزجاج ومكان في 2 مل من العوامل + NMB في أنبوب 15 مل العقيمة.
- سحن : استخدام ماصة لمبة زجاجية ويتم تمرير القشرة صعودا ونزولا حوالي 5 إلى 10 مرات. ثم ، يتم استخدام ماصة صغيرة بجوار ماصة صعودا وهبوطا في الأنسجة. أخيرا ، يتم استخدام أصغر ماصة للماصة صعودا وهبوطا في الأنسجة. نود أن نتأكد من عدم وجود قطع مرئية.
ملاحظة : في الآونة الأخيرة ، وبدأت المقارنة بين جيون مختبر الخلايا من الأنسجة المخزنة في البريد إسبات إلى الخلايا التي تم إعدادها من الأنسجة في البداية تعامل مع التربسين 0.125 ٪ في 50 ٪ كا + + مجانا + + والمغنيسيوم العازلة تشريح الحرة. تجمع الآراء على أن نسيج المعدة باستخدام الخلايا التربسين الغلة أكثر قدرة على البقاء من الأنسجة وضعت في البداية E. إسبات إذا كنت لا تنوي استخدام الأنسجة على الفور ، ثم أنت بحاجة لتخزين الأنسجة في إسبات E.
إذا كنت تنوي استخدام الأنسجة على الفور ، وأود البقاء زيادة ، ثم التعامل النسيج مع التربسين قبل سحن الميكانيكية على النحو التالي : 1) تمييع 1 مل التربسين 0.25 ٪ (Gibco ، Invitrogen) مع 1 مل من + كا + مجانا ميغاغرام مجانا + + تشريح العازلة (التربسين النهائي = 0.125 ٪) في أنبوب 15 مل (حفاظ على برودة الثلج) ، 2) مكان في الأنسجة العازلة واحتضان فورا عند 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق ، 3) إضافة 10 مل DMEM/10 ٪ لوقف FBS التربسين تفاعل وتواصل بروتوكول أدناه. - الخلايا في جهاز الطرد المركزي 1100 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة
- يستنشق وسائل الإعلام بعناية قبالة الخلية بيليه
- إضافة 1 مل من العوامل + NMB لبيليه وإعادة علقت عليه ، pipetting صعودا وهبوطا
- تمر الخلايا إعادة علقتها تدفق الجاذبية من خلال مرشح لإزالة أي تكتلات دينار بحريني (فالكون 40 مصفاة الخلية النايلون أم)
- والخلايا لوحة العد :
- في أنبوب microfuge ، إضافة NMB 60 ميكرولتر + العوامل ، 20 ميكرولتر من التعليق الخلية ، و 20 ميكرو لتر من اللون الأزرق ثم مزيج التريبان
- إضافة حوالي 10 ميكرولتر من هذا الحل لعدادة الكريات وعد الخلايا الحية (وليس الأزرق)
- ضبط تركيز على 2،5-4،5 X10 6 خلية / مل
ملاحظة : نحن عموما الحصول على تركيز من حوالي 2،5-4،5 X 106 خلية / مل. اعتمادا على حجم ومعلق الخلايا في (عادة 1 مل + NBM B27/Glutamax/PenStrep percortex). إذا كان على استعداد للنسيج التربسين مع ذلك ، من المحتمل أن تكون زيادة الغلة.
الطلاء وأجهزة
- تحميل الخلايا (الخلايا العصبية الأولية) في واحدة من جانب الجهاز
- لوحة 5 ميكرولتر في جهاز صغير و 20 ميكرولتر لكل جهاز كبير
ملاحظة : يمكنك تحميل 10 ميكرولتر من الخلايا في الجزء العلوي من الجهاز و 10 ميكرولتر على الجزء السفلي من الجهاز (إجمالي حجم نصف) ، أو مباشرة عن 20 ميكرولتر من الخلايا في أعلى جسدي جيدا (5 ميكرولتر في جسدي جيدا الأعلى للأجهزة الصغيرة). - احتضان لمدة 10 دقيقة في الحاضنة 37 درجة مئوية بحيث تبدأ الخلايا لإرفاق
- إضافة ميكرولتر 150/30 تقريبا من العوامل + NMB لكل اعتمادا على حجم الجهاز جيدا
ملاحظة : وحدات التخزين قد تختلف تبعا لسمك PDMS. كل ما يهم هو أن تمتلئ الآبار.
تكميلية على استخدام الأجهزة وبدون الربط البلازما
من دون علاج البلازما ، وكريستينا تو ، فني ، الذي لا بنجاح كل أسبوع دون البلازما ، ويقول لتحميل فقط على الخلايا على الفور.
تذكر لإزالة وسائل الإعلام من كل من الآبار على الجانب سوما (محوار الجانب لن يهم إذا تركت وسائل الإعلام في). انها تدفق السائل الذي يسمح للخلايا لدخول القناة الرئيسية. إذا كان لديك وسائل الاعلام في الآبار ، وأنك لن تحصل على تدفق السوائل.
المناقشة
تظاهر نحن هنا كيفية استخدام الجهاز عصبون ميكروفلويديك دون الحاجة إلى نظافة البلازما. نشير إلى هذه الرابطة وغير البلازما.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تعارض في المصالح للإفصاح عنه.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |
|---|---|---|---|---|
| PDMS | كاشف | Dow Corning | Sylgard 184 مع عامل المعالجة يرجى مراجعة Dow Corning للعثور على مورد قريب منك | |
| Cornig No. 1 Cover Glass | غطاء زجاجي | Corning | Corning No. X2935 244 | متوفر من خلال Fisher Scientific، رقم كتالوج Fish 12-531D |
| B27 | كاشف | Invitrogen | 17504-044 | B27 هو مكمل مملوك متوفر من خلال Invitrogen ضمن خط Gibco لكواشف زراعة الخلايا. |
| Glutamax | كاشف | Invitrogen | 35050-061 | Glutamax متوفر من خلال Invitrogen ضمن خط Gibco لكواشف زراعة الخلايا. |
| 60 mm Petri Dish | أداة | Fisher Scientific | 08-757-13A | تُستخدم أطباق بتري معقمة من البوليسترين بحجم 60 mm لاحتواء الجهاز المرتبط بالزجاج. |
| Poly-L-Lysine | كاشف | Sigma-Aldrich | P-1274 | |
| BD Falcon 50 ml Tube | أداة | BD Biosciences | Falcon No. 352098 | متوفر من خلال رقم كتالوج Fisher Scientific 14-959-49A |
| BD Falcon 15 ml tube | أداة | BD Biosciences | Falcon No. 352097 | متوفر من خلال رقم كتالوج Fisher Scientific 14-959-70C |
المراجع
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nat Protoc. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nat Methods. 2 (8), 599-605 (2005).
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن