مقالة منهجية

الإجراء لانتاج ألياف النانو Biofunctional

DOI:

10.3791/4135

⸱

سبتمبر 10, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Clark Atlanta University, 2Department of Physics, Clark Atlanta University, 3Department of Chemistry and Chemical Biology, Cornell University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوصف هذا النهج فعالة لإعداد ألياف النانو مزينة المجموعات الوظيفية قادرة على التفاعل مع البروتينات على وجه التحديد. النهج يتطلب أولا إعداد البوليمر functionalized مع مجموعة وظيفية مناسبة. وملفقة البوليمر وظيفية في ألياف النانو التي كتبها electrospinning. يتم دراسة فعالية الربط للألياف النانو مع بروتين متحد البؤر المجهر من قبل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Electrospinning وسيلة فعالة لمعالجة ألياف النانو إعداد مزينة المجموعات الوظيفية. يمكن استخدام ألياف النانو مزينة المجموعات الوظيفية لدراسة المواد، العلامات البيولوجية التفاعلات أي بمثابة أجهزة استشعار العوامل البيولوجية المحتملة مع أجهزة الكشف عن جزيء واحد و. وقد وضعنا نهجا فعالا لإعداد البوليمرات الوظيفية حيث وظيفة لديه القدرة على الربط تحديدا مع بروتين النموذج. في نظام نموذجنا، ومجموعة وظيفية هي 2،4-dinitrophenyl (DNP) والبروتين هو مكافحة DNP فريق الخبراء الحكومي الدولي (E المناعي). البوليمر وظيفية، α، ω ثنائية [2،4-dinitrophenyl الكابرويك] [بولي (أكسيد الإثيلين)-B-بولي (2-methoxystyrene)-B-بولي (أكسيد الإثيلين)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO- ويتم إعداد CDNP)، عن طريق البلمرة الأنيونية المعيشة. وقد أعد البادئ difunctional المستخدمة في البلمرة عن طريق تفاعل نقل الإلكترون من α-methylstyrene والبوتاسيوم معدن (مرآة). تم إضافة مونومر 2-methoxystyreneأول من البادئ، تليها إضافة لمونومر الثاني، أكسيد الإثيلين، وأخيرا تم إنهاء البوليمر العيش من خلال الميثانول. وα، ω-dihydroxyl البوليمر [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] وكان رد فعل مع حمض الكابرويك N-2 ،4-DNP-∈ الأمينية، وذلك بربط DCC، مما أدى إلى تشكيل α، ω ثنائية [ 2،4-dinitrophenylcaproic] [بولي (الإيثيلين أكسيد)-B-بولي (2-methoxystyrene)-B-بولي (أكسيد الإثيلين)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). وتميزت البوليمرات التي كتبها FT-IR، 1 H NMR والههلامي (GPC). كانت توزيعات الوزن الجزيئي للبوليمرات الضيقة (1،1-1،2)، وكان يستخدم البوليمرات مع الأوزان الجزيئية أكبر من 50،000 في هذه الدراسة. كانت البوليمرات مساحيق قابلة للذوبان في الصفراء ورباعي هيدرو الفوران. A-للذوبان في الماء CDNP PEO-P2MS-PEO-CDNP / DMEG (جليكول dimethoxyethylene) معقدة تربط ويحقق ثابت ملزم الدولة مع فريق الخبراء الحكومي الدولي حل في غضون ثوان قليلة. الوزن الجزيئي العالي (أي غير قابلة للذوبان المياه حوالي 50،000) CDNتم تجهيز-P-PEO P2MS-PEO-CDNP البوليمرات، التي تحتوي على 1٪ الكربون نانوتيوب جدار واحد (SWCNT) في ألياف النانو electroactive (100 نانومتر إلى 500 نانومتر في القطر) على الركيزة السيليكون. مضان الطيفي يدل على أن فريق الخبراء الحكومي الدولي لمكافحة DNP يتفاعل مع ألياف النانو عن طريق الربط مع المجموعات الوظيفية DNP تزيين الألياف. هذه الملاحظات تشير إلى أن ألياف النانو تبشر functionalized مناسب لتطوير جهاز كشف العلامات البيولوجية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. توليف α، ω-dihydroxyl بوليمر [HO-PEO-P2MS-PEO-OH]

  1. تجميع مفاعل البلمرة كما هو مبين في الشكل 1. المفاعل لهذه التجربة تتكون من 100 مل أسفل الجولة 2-قارورة الرقبة وجود معيار مشترك تفتق الخارجي (Chemglass)، محولين التحكم في التدفق مع stopcocks (Chemglass)، واحد تفلون قضيب التحريك. تم استخدام محول (الشكل 1) للحفاظ على الترا عالية النقاء (UHP) النيتروجين التي تتدفق من خلال النظام من أجل منع الهواء والرطوبة من الدخول إلى النظام خامل. محول B (الشكل 1) كانت تستخدم لحقن المذيب، مونومر، والبادئ في دورق التفاعل.
  2. تجف 200 مل من رباعي هيدرو الفوران (THF) على المعادن نا، وذلك باستخدام بينزفينون كمؤشر، لمدة لا تقل من 6 ساعة تحت غاز النيتروجين الجاف.
  3. تجفيف 10 مل من methoxystyrene-2 ​​على هيدريد الكالسيوم لمدة 24 ساعة.
  4. إعداد حمام درجات الحرارة الباردة الحفاظ على -78 درجة مئوية باستخدام الطين من على الأيزوبروبانولالنيتروجين السائل الثانية.
  5. إضافة 25 مل من THF في دورق التفاعل البلمرة (انظر الشكل 1) تحت غاز النيتروجين والحفاظ على المفاعل تحت غاز النيتروجين من خلال البلمرة جميع.
  6. 100 مل قارورة مكان أسفل جولة في الطين.
  7. إضافة 2 مل (0.27 مليمول / لتر) من الحل البادئ في دورق التفاعل.
  8. حقن مونومر الأولى، 2-methoxystyrene (4 مل) في دورق التفاعل.
  9. السماح للرد فعل على المضي قدما لمدة 40 دقيقة.
  10. إضافة 1 مل من مونومر الثاني، أكسيد الإثيلين.
  11. السماح للبلمرة أن تواصل في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين.
  12. إنهاء البوليمر مع حمض الهيدروكلوريك (6 M) / الميثانول (1/20، المجلد / المجلد).
  13. تنقية البوليمر بواسطة عجل في hexanes والبوليمر الجاف في فرن الفراغ.
  14. تميز باستخدام البوليمر NMR.

2. Functionalization من α، ω-dihydroxyl البوليمر مع حمض الكابرويك N-2 ،4-DNP-Ε الأمينية الحصول على وظيفية Polymإيه، CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP

  1. في قارورة الرقبة الثلاث، وضع α، ω-dihydroxyl البوليمر (0.05 ملمول)، وحمض N-2 ،4-DNP-E-الأمينية الكابرويك (0.25 ملمول)، DCC (0.15 ملمول) وDMAP (0.005 ملمول) و تجف على خط فراغ لمدة 4 ساعة.
  2. تقطير ثنائي كلورو ميثان الجافة (10 مل) في قارورة.
  3. الإفراج عن الفراغ تحت النيتروجين ويقلب لمدة 12 ساعة رد فعل في درجة حرارة الغرفة.
  4. تصفية خليط التفاعل واستعادة البوليمر عن طريق عجل مرتين في hexanes والميثانول.
  5. عجلت الجافة البوليمر في فرن الفراغ في C. ° 40
  6. تحديد هيكل البوليمر وظائف من FT-IR NMR H و 1.

3. تحضير محلول CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/SWCNT لElectrospinning

  1. حل 20 W-CDNP٪ من PEO-P2MS-PEO-CDNP في كلوروبنزين.
  2. حل 20 واط و 40٪ ث٪ من البوليستيرين (MW 800،000) في كلوروبنزين لإعداد حلين. يتم استخدام أعلى البوليسترين الجزيئية في الزيادهه البوليمر سلسلة سلسلة تشابك والحصول على اللزوجة المثلى المطلوبة لelectrospinning.
  3. خلط حلول البوليمر أعد في 3.1 و 3.2 معا لتشكيل 1:1 و 1:02 نسب من البوليمرات وإضافة 1٪ ث واحدة أنابيب الكربون النانوية الجدران (SWCNT) إلى الخليط ويقلب بين عشية وضحاها للتوزيع حتى تشارك المركز الوطني.

4. Electrospinning من البوليمر المركب CNT

  1. تجميع electrospinning إعداد كما هو مبين في الشكل 2. على الجانب الأيمن من الشكل هو مصدر غلاسمان الجهد العالي. لأنها المقبل هو موقف معوجة التي يتم إرفاق رقاقة السيليكون. إلى اليسار هو آخر موقف معوجة على الحقنة التي هي التي شنت وراء ذلك هو مصباح لتصور إجراء كلما تقدمت.
  2. حقنة تحت الجلد باستخدام وسحب كمية صغيرة من الخليط CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/polystyrene/SWCNT (حوالي 1 مل) وجبل الحقنة تحت الجلد على الوقوف معوجة.
  3. A رقاقة السيليكون هو جبلويرد على الجانب الآخر من إد الحقنة بشكل آمن على مسافة 10 سم، ومقطع الأرضي من مصدر الجهد العالي لذلك.
  4. إرفاق كليب تحمل الجهد العالي ليتم تطبيقها على الإبرة على حقنة، خفض المكبس قليلا (تعليق قطرة على طرف إبرة) وعند هذه النقطة، electrospinning جاهزة.
  5. السلطة على مصدر الجهد العالي والجهد ضبط متر إلى 10 كيلو فولت. اعتمادا على طبيعة البوليمرات في مركب، قد يكون مطلوبا ارتفاع الفولتية، وخاصة إذا المطلوب ألياف النانو تحت نانومتر مائة في القطر.
  6. إلغاء تحميل رقاقة السيليكون ومكان في dessicator بين عشية وضحاها حتى يجف تماما.

5. توصيف ألياف النانو

  1. ويتم التصوير الأولي من ألياف النانو مع المجهر الضوئي لمراقبة منظور شامل من الألياف.
  2. استخدام المجهر الإلكتروني لمراقبة التفاصيل الدقيقة مثل، مورفولوجيا قطر، متوسط ​​حجم المسام، الخ.
  3. حملمن التصوير مع مزيد من مجهر القوة الذرية لمراقبة التضاريس 3-D من الألياف، الخ.

6. خصوصية ملزمة البروتين ألياف النانو مع فريق الخبراء الحكومي الدولي لمكافحة DNP

  1. إعداد الحل من 4 ميكروغرام / لتر fluorescently المسمى، FITC-إيج (فلوريسئين Isothio-سيانات-الغلوبولين المناعي E) في PBS-BSA (الفوسفات مخزنة المالحة-الأبقار مصل الزلال) الحل.
  2. ضع قطعة صغيرة من رقاقة السيليكون التي فيها ألياف النانو على ساترة جيدا ماتيك. احتضان ألياف النانو في هذا الحل لمدة ساعة. ويتم ذلك عن طريق الحضانة pipetting بلطف من، 10 أيار حل فريق الخبراء الحكومي الدولي على رقاقة السيليكون.
  3. بعد الحضانة، وإزالة غير منضم فريق الخبراء الحكومي الدولي عن طريق الغسيل ثلاث مرات مع عينة الحل العازلة PBS-BSA. والاستغناء عن حل PBS بلطف على جدار الطبق ماتيك، من أجل تجنب التدفق المخزن المؤقت مباشرة على ألياف النانو. دوامة الطبق برفق من جهة، وتوزيع الحل عازلة على ألياف النانو. إزالة بعناية العازلة مع ماصة وإعادةالخث هذه الأوقات أكثر اثنين.
  4. للتحكم، في احتضان ألياف النانو مفتش fluorescently المسمى (غير محددة لDNP) في ظل نفس الظروف.
  5. تصور محدد الألياف تحت المجهر متحد البؤر لمراقبة ملزم مع فريق الخبراء الحكومي الدولي. لدراستنا، كان يستخدم المجهر مبائر ايكا TCS مع SP2 63x العدسة.

7. الجاري الجهد سلوك ألياف النانو

  1. توصيل جهازي محكمات وضع الدقيقة لمصدر تيار منخفض جدا مثل sourcemeter 6430 شنيعة الحساسة. يظهر إعداد لتحديد السلوك الجهد الحالي في الشكل 3. هذا الرقم يدل على محطة دقق المستخدمة لتحديد الخصائص الأولية الرابع من ألياف النانو. وهي مكونة من باوش ومب ومجهر MicroZoom، مرحلة فراغ تشاك، وأربعة Micropositioners المستخدمة في التحقيق. في أعلى يمين هو 34405A اجيلنت الرقمية آفومتر المستخدمة في قياس الجهد وأقل من أن شنيعة 6430 متر الفرعية Femtoamp المصدر البعيد يستخدم لمصدر التيارات المنخفضة التي كانت مساهمة في الألياف.
  2. تحميل التحقيق الأسلحة الصغيرة من خلال محكمات وضع حصيرة الألياف على طرفي نقيض مع نصائح لمس الألياف.
  3. الاتصال محكمات وضع آخر 2 الدقيقة إلى رقمي متعدد، تحميل الأسلحة التحقيق في الفترات الفاصلة بين الاثنان الآخران والأراضي النصائح على حصيرة من الألياف. تأكد من أن نصائح الأربع هي خط واحد قدر الإمكان.
  4. إدخال كميات مختلفة من الحالية من شنيعة (عادة في نطاق nanoamps).
  5. قياس انخفاض الجهد عبر نصائح الخارجي، لكل حجم من مصادر الحالية.
  6. وتشير هذه القيم بالتآمر نوع الجهاز حصيرة الألياف تعمل مثل.

8. ممثل النتائج

البوليمرات الوظيفية

"> طريقة لتركيب α، ω ثنائية [2،4-dinitrophenyl الكابرويك] [بولي (أكسيد الإثيلين)-B-بولي (2-methoxystyrene)-B-بولي (أكسيد الإثيلين)] (CDNP-PEO- P2MS-PEO-CDNP) ويرد في الشكل 4. 1 وهيكل البوليمر وظيفية ما أكدته FT-IR (الشكل 5) و 500 ميغاهرتز 1 H NMR الطيفي (الشكل 6). وFT-IR يظهر اختفاء كامل لل و-OH امتصاص واسع ما يقرب من 3،500 سم -1 تشير functionalization الكمية مع المجموعة CDNP. ويؤكد ذلك أيضا الطيف NMR هو موضح في الشكل 6. عن طريق دمج القمم في الطيف NMR، تقرر أن CDNP-PEO وfunctionalized كميا-P2MS-PEO-CDNP البوليمرات.

ألياف النانو

في الشكل 7، حصيرة من ألياف النانو موصل حصلت عليها electrospinning CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / البوليسترين / SWCNT من كلوروبنزين هو SHالخاصة. وأظهرت لقطات تم الحصول عليها مبائر أن فريق الخبراء الحكومي الدولي البروتين يربط مع DNP على سطح الألياف. 3 هذا هو إشارة إلى خصوصية ملزمة من البوليمرات-DNP electrospun نحو فريق الخبراء الحكومي الدولي الأجسام المضادة. شدة الضوء هو مؤشر على وجود فريق الخبراء الحكومي الدولي على ألياف النانو كما هو الموسومة fluorescently البروتين.

الرقم هو 8A (مجهر القوة الذرية) AFM صورة واحدة من ألياف النانو التي حصلت عليها هذه العملية ويوضح الشكل 8B البعد من هذا nanofiber خاص هو حوالي 150 نانومتر في القطر. بواسطة هذه العملية يتم الحصول على ألياف بين 100-700 نانومتر. في هذا الوقت الحالي فإنه يمثل تحديا لإعداد الألياف ذات البعد محددة. وهذا يتفق مع ما لوحظ من قبل مجموعات أخرى .. 4 يظهر الشكل 9 SEM صور CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / البوليسترين / SWCNT ألياف النانو وألياف النانو قطر كانت بين 200 نانومتر إلى 300 نانومتر. هناك ثلاثة SEM صور nanofibeRS أظهرت في تكبير مختلفة. دراسة الصور الثلاث ويبين الأشكال التضاريسية من الألياف هي الخطية والخرز. والهدف العام هو إعداد الألياف التي هي الخطية في الغالب. الشكل 10 يظهر المؤامرة الرابع من الحصير من ألياف النانو المحضر من CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / البوليسترين / SWCNT. المؤامرة يظهر سلوك المقاوم (أومية). عندما يرتبط المستضد إلى ألياف النانو، ونحن نتوقع أن نرى تغييرا في السلوك الرابع من الألياف حصيرة وهذا التغيير في المقاومة هو سمة التي تشير إلى أن الألياف لها إمكانية تطبيقها وظيفية كما العنصر النشط في أجهزة الاستشعار للكشف عن جزيء واحد .

figure-protocol-1
الشكل 1. مفاعل البلمرة لتوليف وα، ω-dihydroxyl البوليمر. A) والنقطة حقن غاز النيتروجين لتدفق UHP. B.) نقطة حقن للمذيب، والبادئ مونومر. C) رد فعل السفينة.

figure-protocol-2
الشكل 2. تستخدم لإعداد electrospinning باستخدام مصدر غلاسمان الجهد العالي.

figure-protocol-3
الشكل 3. إعداد المخططات المستخدمة لقياس IV باستخدام الفرعية femtoamp البعيد Sourcemeter (شنيعة).

figure-protocol-4
الشكل 4. نهج). الاصطناعية لإعداد OH-PEO-P2MS-PEO-OH البوليمرات. B) من Functionalization α، ω-ثنائي هيدروكسي [بولي (الإيثيلين أكسيد)-B-بولي (2-methoxystyrene)-B-بولي (الإيثيلين أكسيد)].

figure-protocol-5
الشكل 5. FT-IR أطياف (A)-OH-PEO P2MS-PEO-OH، تمهيدا لCDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP و(B) CDNP-PEO-P2MS-PEO CDNP.

figure-protocol-6 الشكل 6. 500 ميغاهيرتز بروتون NMR-CDNP من PEO-P2MS-PEO-CDNP.

figure-protocol-7
الشكل 7. صورة) ملزم من FITC-إيج مع electrospun الألياف CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP من كلوروبنزين. B) الصورة المجهر متحد البؤر لعنصر التحكم (ألياف النانو مع مفتش).

figure-protocol-8
الشكل 8. صورة AFM) من ألياف electrospun CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP من كلوروبنزين وB) AFM البعد الشخصي أي واحد من الألياف هو مبين في الشكل 5A.

figure-protocol-9
الشكل 9. الصور SEM-CDNP من PEO-P2MS-PEO-CDNP / البوليسترين / SWCNT ألياف النانو.

figure-protocol-10 الشكل 10. IV قطعة الحصير من ألياف النانو المحضر من CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP / البوليسترين / SWCNT.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا التقرير، وقد قدمنا ​​طريقة فعالة لإعداد ألياف النانو biofunctional. زينت ألياف النانو إلى مجموعة وظيفية معينة وهو بروتين لنموذج. للإجراءات ونهج ذكرت في هذه الرسالة هي عامة في طبيعتها، ويمكن استخدامه لإعداد ألياف النانو مزينة أي جماعة وظيفية المطلوب. البلمرة الأنيونية المعيشة هي طريقة قوية لتجميع الهياكل البوليمر للرقابة متصلة تساهميا إلى أي عدد من المجموعات الوظيفية للاهتمام أو الفنية التي تخص المؤشرات الحيوية خاصة في المصالح. وأنيوني البلمرة المعيشة راسخة لمونومر 2-methoxy...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل NSF HRD-0630456، وهو CREST NSF البرنامج وNSF هو DMR-0934142.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم
الصوديوم المعادن سيغما الدريخ 282065
بينزفينون سيغما الدريخ 239852
2-methoxystyrene سيغما الدريخ 563064
رباعي هيدرو الفوران سيغما الدريخ 178810
كلوروبنزين سيغما الدريخ 319996
تشارك المركز الوطني الجدران واحد سيغما الدريخ 704113
البوليسترين سيغما الدريخ 81416
السيليكون يفر السيليكون كويست الدولي 720200
زايس FESEM شركة كارل زايس 60 المتطرف
Probestation مع بوش ولومب MicroZoom II عالي الأداء مجهر باوش والصغرىMB
لايكا نظام المسح الضوئي متحد البؤر لايكا مايكروسيستمز TCS SP2
شبه femtoamp Sourcemeter البعيد شنيعة الآلات 6430
Autoranging الرقمية آفومتر شنيعة الآلات 175A
حقنة مضخة شركة Chemyx الانصهار 200
زايس المجهر الضوئي شركة كارل زايس زايس / Axiotech

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sannigrahi, B., Sil, D. Synthesis and Characterization of α,ω-bi[2,4-dinitrophenyl (DNP)] poly(2-methoxystyrene) Functional Polymers. Preliminary Evaluation of the Interaction of the Functional Polymers with RBL Mast Cells. Journal of Macromolecular Science, Part A. 45, 664-671 (2008).
  2. Gordon, K., Sannigrahi, B. Synthesis of Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene). Enhancement of HeLa and Osteoblast Cell Growth on Optically Active Helical Poly(2-methoxystyrene) Surfaces. Journal of Biomaterials Science. 2, 2055-2072 (2009).
  3. Baird, E. J., Holowka, D. Highly Effective Poly(Ethylene Glycol) Architectures for Specific Inhibition of Immune Receptor Activation. Biochemistry. 2, 12739-12748 (2003).
  4. Ramakrisna, S., Fugihara, K., Lim, W. -E., Ma, Z. Introductions to Electrospinning and Nanofibers. , World Sceintific. (2005).
  5. Kameoka, J., Craighead, H. G. Fabrication of Oriented Polymeric Nanofibers on Planar Surfaces by Electrospinning. Applied Physics Letters. 83, 371-3773 (2003).
  6. Ramakrishna, S., Lala, N. L. Polymer Nanofibers for Biosensor Applications. Topics in Applied Physics. 109, 377-392 (2007).
  7. Reuven, D., Sil, D. Archetypical Conductive Polymer Structure for Specific Interaction with Proteins. Journal of Macromolecular Science Part A: Pure and Applied Chemistry. , Forthcoming (2012).
  8. Ogunro, O., Karunwi, K. Chiral Asymmetry of Helical Polymer Nanowire. The Journal of Physical Chemistry Letters. 1, 704-707 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة