يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

A التقييم الكمي للهجرة الخليوي من قبل مصلحة دمغ المصوغات المسار على الحركة Phagokinetic

13.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/4165

⸱

ديسمبر 4, 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Center for Molecular and Tumor Virology, Louisiana State University Health Sciences Center, 3Department of Microbiology and Immunology, SUNY Upstate Medical University, 4Feist-Weiller Cancer Center, Louisiana State University Health Sciences Center

في هذه المقالة

ملخص

يُعد اختبار مسار الحركة البلعومية طريقة تُستخدم لتقييم حركة الخلايا. وبشكل محدد، يقيس هذا الاختبار الحركة الكيميائية (حركية الخلايا العشوائية) بمرور الوقت بطريقة كمية. ويستفيد الاختبار من قدرة الخلايا على تكوين مسار قابل للقياس لحركتها على شرائح تغطية مطلية بالذهب الغروي.

الملخص

تُعد الحركية الخلوية عملية بيولوجية مهمة لكل من الكائنات وحيدة الخلية ومتعددة الخلايا. فهي ضرورية لحركة الكائنات وحيدة الخلية نحو مصدر للمغذيات أو بعيداً عن الظروف غير المناسبة، كما أنها أساسية في الكائنات متعددة الخلايا من أجل تطور الأنسجة، والترصد المناعي، والتئام الجروح، على سبيل المثال لا الحصر1,2,3. ويمكن أن يؤدي خلل تنظيم هذه العملية إلى أمراض عصبية وقلبية وعائية ومناعية خطيرة، فضلاً عن تفاقم تكوين الأورام وانتشارها4,5. ومن الناحية الجزيئية، ثبت أن بلمرة الأكتين وإعادة تدوير المستقبلات يلعبان أدواراً مهمة في تكوين الامتدادات الخلوية (الأقدام الصفائحية)، التي تدفع الحركة الأمامية للخلية6,7,8. ومع ذلك، لا تزال هناك العديد من التساؤلات البيولوجية حول هجرة الخلايا دون إجابات.

يؤكد الدور المركزي للحركية الخلوية في صحة الإنسان وأمراضه على أهمية فهم الآليات المحددة المشاركة في هذه العملية، ويجعل من الطرق الدقيقة لتقييم حركية الخلايا أمراً بالغ الأهمية بشكل خاص. تُستخدم المجاهر عادةً لتصوير حركة الخلايا، ومع ذلك، تتحرك الخلايا ببطء شديد، مما يجعل القياس الكمي لهجرة الخلايا عملية تستهلك الكثير من الموارد وتتطلب كاميرات وبرامج باهظة الثمن لإنشاء أفلام فاصلة زمنياً كمية للخلايا المتحركة. وبناءً على ذلك، فإن القدرة على إجراء قياس كمي لهجرة الخلايا يكون فعالاً من حيث التكلفة، وغير مجهد، ويستخدم معدات مختبرية شائعة، تمثل حاجة ماسة للعديد من الباحثين.

يستخدم مقايسة حركة مسار البلعمة (phagokinetic track motility assay) قدرة الخلية المتحركة على إزالة جزيئات الذهب من مسارها لإنشاء مسار قابل للقياس على شريحة زجاجية مغطاة بالذهب الغروي9,10. وباستخدام برمجيات متاحة مجانًا، يمكن تقييم مسارات متعددة لكل معاملة لتحقيق المتطلبات الإحصائية. ويمكن استخدام هذه المقايسة لتقييم حركة العديد من أنواع الخلايا، مثل الخلايا السرطانية11,12، والأرومات الليفية (fibroblasts)9، والخلايا المتعادلة (neutrophils)13، وخلايا العضلات الهيكلية14، والخلايا الكيراتينية (keratinocytes)15، والأرومات الغاذية (trophoblasts)16، والخلايا البطانية (endothelial cells)17، والخلايا الوحيدة (monocytes)10,18-22. يتضمن البروتوكول إنشاء شرائح مغطاة بجسيمات الذهب النانوية (Au°) التي يتم توليدها عن طريق اختزال حمض الكلوروأوريك (Au3+) بواسطة سترات الصوديوم. طور Turkevich et al. هذه الطريقة في عام 195123 ثم قام Frens et al. بتحسينها في السبعينيات24,25. ونتيجة لخطوة الاختزال الكيميائي هذه، تترسب جزيئات الذهب (بقطر 10-20 nm) من خليط التفاعل ويمكن تطبيقها على الشرائح الزجاجية، التي تصبح جاهزة بعد ذلك للاستخدام في تحليلات الهجرة الخلوية9,26,27.

بشكل عام، يُعد مقايسة حركية المسار البلعومية طريقة سريعة وكمية وسهلة لقياس الحركية الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدامها كمقايسة بسيطة عالية الإنتاجية، لاستخدامها مع أنواع الخلايا التي لا تسمح بالتصوير المتقطع (time-lapsed imaging)، فضلاً عن استخدامات أخرى تعتمد على احتياجات الباحث. إن القدرة على قياس الحركية الخلوية لأنواع متعددة من الخلايا كمياً دون الحاجة إلى مجاهر وبرمجيات باهظة الثمن، إلى جانب استخدام المعدات والمواد الكيميائية المختبرية الشائعة، تجعل من مقايسة حركية المسار البلعومية خياراً قوياً للعلماء المهتمين بفهم الحركية الخلوية.

البروتوكول

1. تحضير شرائح التغطية المطلية بالجيلاتين

  1. ضع شرائح غطاء زجاجية مغسولة بالحمض (بقطر 15 mm) في طبق (أو أطباق) بلاستيكية معقمة بحجم 100 mm. ضع من 8-9 شرائح في كل طبق وتأكد من عدم تلامسها مع بعضها البعض أو مع جوانب الطبق.

ملاحظة: يجب أن تكون أغطية الشرائح والإبر والملاقط معقمة للقضاء على الكائنات الدقيقة الملوثة المحتملة، وكذلك الذيفانات الداخلية التي ستؤثر على الوظائف الخلوية، بما في ذلك الحركة.

  1. قم بوزن مسحوق الجيلاتين ثم أعد تعليقه في ماء منزوع الأيونات لتحضير محلول جيلاتين بتركيز نهائي قدره 0.5 g/300 ml. بعد ذلك، يجب تعقيم محلول الجيلاتين بجهاز الأوتوكلاف.
  2. باستخدام الماصة، ضع 2-3 قطرات من الجيلاتين (~100-150 ml) على كل غطاء شريحة.

ملاحظة: كن حريصاً على عدم السماح للجيلاتين بلمس الطبق، وإلا فلن تتمكن من إزالة شرائح الغطاء من الطبق.

  1. قم بخبز شرائح الغطاء المطلية بالجيلاتين في طبق سعة 100 mm في فرن عند درجة حرارة 90 °C لمدة 10 min.
  2. أزل الجيلاتين الزائد عن طريق السحب اللطيف باستخدام الماصة.
  3. جفف شرائح الغطاء في طبق سعة 100 mm في الفرن عند درجة حرارة 70 °C لمدة 45 min.
  4. بمجرد الجفاف، أخرج شرائح الغطاء من طبق سعة 100 mm باستخدام إبرة وملقط معقمين وخاليين من السموم الداخلية (تُستخدم الإبرة لدفع شريحة الغطاء للأعلى برفق لتسهيل التقاطها وإزالتها بلطف بواسطة الملقط).
  5. ضع كل شريحة غطاء مطلية بالجيلاتين في عين منفصلة من طبق يحتوي على 24-well.

2. تحضير شرائح التغطية المطلية بالذهب الغروي

  1. قم بوزن كمية مناسبة من حمض الكلوروأوريك (ثلاثي هيدرات حمض رباعي كلورو الأوريك؛ HAuCl4·3H2O)، ثم أعد تعليقه في ماء منزوع الأيونات ومعقم لتحضير محلول نهائي بتركيز 14.5 mM (مادة سامة). حضّر 1.5 ml من المحلول لكل 8-9 شرائح غطاء (coverslips).

تحذير: حمض الكلوروأوريك ضار في حالة بلعه، ويسبب حروقاً جلدية شديدة وتلفاً في العين وقد يسبب تفاعلاً جلدياً تحسسياً. كما أنه سام في حالة بلعه.

  1. قم بوزن كمية مناسبة من سترات الصوديوم (trisodium dihydrogen 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate; Na3C6H5O7)، ثم أعد تعليق المسحوق في ماء منزوع الأيونات لتحضير محلول نهائي بتركيز 0.5%. جهز 1 ml من المحلول لكل 8-9 غطاء شريحة.

تحذير: قد يسبب سترات الصوديوم تهيجاً في العين والجلد، كما قد يسبب تهيجاً في الجهازين التنفسي والهضمي.

  1. في دورق معقم وخالٍ من الذيفانات الداخلية، اخلط 1.5 ml من محلول HAuCl4 المعقم بتركيز 14.5 mM مع 13.5 ml من الماء منزوع الأيونات المعقم؛ ويجب أن ينتج عن ذلك محلول أصفر باهت. وتكفي الأحجام المذكورة لتحضير 8-9 شرائح غطاء من الذهب الغروي.
  2. سخن المحلول على لوح تسخين مع التحريك المستمر حتى يبدأ في الغليان.

تحذير: يجب إجراء عملية تسخين المحلول داخل خزانة استخلاص الغازات (fume hood)، حيث يمكن أن تكون الأبخرة ضارة/سامة. وتؤدي هذه الأبخرات إلى تدمير أنسجة الأغشية المخاطية والجهاز التنفسي العلوي.

  1. ارفع البيكر من على لوح التسخين.
  2. أضف 0.7 ml من محلول سترات الصوديوم بتركيز 0.5% مع الاستمرار في التقليب. تتيح الكمية المذكورة تحضير 8-9 شرائح تغطية من الذهب الغروي.
  3. استمر في تقليب هذا المحلول المزيج لمدة دقيقتين تقريبًا (ملاحظة: سيتغير لون المحلول تدريجيًا من الأصفر الشاحب، إلى الشفاف، ثم الرمادي، ثم الأرجواني، ثم الأرجواني الداكن، قبل أن يصل في النهاية إلى لون النبيذ الأحمر، أو يفضل لون الصدأ). هذا الناتج هو محلول الذهب الغروي الخاص بك.
  4. برد محلول الذهب الغروي في ماصة سعة 10 ml لمدة 1-2 min (وذلك لمنع ذوبان طبقة الجيلاتين الموجودة على شريحة التغطية عند إضافة محلول الذهب الغروي)، ثم أضف 1.0-2.0 ml من محلول الذهب الغروي على كل شريحة تغطية مطلية بالجيلاتين سبق وضعها في طبق (أطباق) يحتوي على 24 بئرًا (تعتمد كمية محلول الذهب الغروي التي تضيفها إلى الشرائح المطلية بالجيلاتين على مدى ترسب جزيئات الذهب في المحلول - انظر الملاحظات أدناه).

ملاحظة: نظرًا لاحتمال وجود تفاوتات في كفاءة ترسيب جزيئات الذهب، يُنصح أولاً بإضافة 0.5-1 ml من محلول الذهب الغروي إلى شرائح التغطية المطلية بالجيلاتين، ثم وضع الطبق ذي الـ 24 بئرًا في الحاضنة لمدة 0.5 hr. وبعد انتهاء وقت الحضانة هذا، يجب فحص شرائح التغطية تحت المجهر الضوئي للتأكد من الكثافة المناسبة لجزيئات الذهب على الشرائح. انظر الشكل 1 لمشاهدة صور مجهرية بتكبير 20x لأمثلة على تركيزات منخفضة جدًا ومرتفعة جدًا من جزيئات الذهب. وانظر الشكل 2 لمشاهدة صور مجهرية بتكبير 40x لتركيز مثالي من جزيئات الذهب (على الأقل للاستخدام مع الخلايا الوحيدة). يجب تحديد الكثافة المثلى لجسيمات الذهب النانوية على الشريحة تجريبيًا لكل نوع من الخلايا المستخدمة، حيث أن خصائص الخلايا المختلفة ستحدد قوة حركتها على شرائح التغطية. وإذا كان تركيز جزيئات الذهب غير كافٍ، أضف 0.5-1 ml إضافية من محلول الذهب الغروي إلى شرائح التغطية المطلية بالجيلاتين.

يمكن أن يختلف التركيز المناسب لجزيئات الذهب اعتماداً على حجم الخلية، وبالتالي سيعتمد ذلك في النهاية على حجم الخلية التي يتم فحص حركيتها. فعلى سبيل المثال، تطلبت تحليلاتنا تركيزاً أعلى من جزيئات الذهب مع الخلايا الوحيدة البشرية (human monocytes) كونها خلايا صغيرة الحجم (~10-20 μm28). ويوفر التوزيع المناسب لجزيئات الذهب النانوية للباحث القدرة على تمييز حواف المسارات الخلوية بسهولة وكفاءة. إن التركيز المرتفع جداً لجزيئات الذهب يعيق قدرة الخلايا على الحركة، وبالتالي يعيق قياس حركيتها بدقة، بينما يحد التركيز المنخفض جداً من القدرة على رسم مسار دقيق للحركية.

ملاحظة هامة: إذا كانت عملية تخليق جسيمات الذهب النانوية تسبب مشكلات، فإن جسيمات الذهب النانوية المُخلقة متوفرة تجارياً بأحجام تتراوح من 5 nm إلى 400 nm. بالإضافة إلى ذلك، استُخدمت الكرات المجهرية الفلورية أيضاً في دراسات حركية الخلايا29. ومع ذلك، فإن استخدام هذه الكرات المجهرية يتطلب مجهراً فلورياً لتحليل هجرة الخلايا.

  1. ضع الطبق ذو الـ 24 بئراً الذي يحتوي على شرائح التغطية المغطاة بالذهب الغروي في حاضنة عند 37 °C واتركها لمدة تتراوح من ساعة واحدة إلى ليلة كاملة.
  2. بعد الحضن، قم بشطف/إزالة الذهب غير المرتبط عن طريق غمر شرائح التغطية (3 مرات) في محلول ملحي منظم بالفوسفات معقم (PBS; pH 7.4).
  3. ضع شرائح التغطية المطلية بالذهب الغروي هذه في طبق (أو أطباق) نظيفة ذات 12 بئراً تحتوي على PBS.
  4. تُخزن شرائح التغطية هذه عند 4 °C حتى وقت الاستخدام (يُغلف الطبق بفيلم البارافيلم قبل وضعه في الثلاجة).

ملاحظة هامة: يجب الحفاظ دائمًا على شرائح التغطية المطلية بالذهب الغروي مغمورة في نوع من السوائل/الأوساط، لأن جزيئات الذهب قد تتقشر من شرائح التغطية إذا تُرِكت لتجف. ويجب استخدام شرائح التغطية المطلية بالذهب الغروي خلال 2-3 أشهر من تاريخ تحضيرها.

ضبط الجودة: في مقايسة حركية المسار البلعمي الواحدة، من الضروري استخدام شرائح غطاء تتميز بتركيز مماثل من جزيئات الذهب. ستسمح هذه النقطة البسيطة بأن تكون الاختلافات الكمية في الحركية الخلوية بين العينات ناتجة فقط عن طبيعة المعالجة وليس عن الخصائص الفيزيائية لشرائح الغطاء المطلية بالذهب الغروي. ونحن نفضل استخدام شرائح الغطاء المصنوعة في الوقت نفسه فقط في التجارب الفردية، رغم أننا أثبتنا أنه طالما كانت كثافة جزيئات الذهب النانوية متساوية، فإن استخدام شرائح غطاء من تحضيرات مختلفة يعد أمراً مناسباً.

3. تحليل الحركية الخلوية

  1. ضع شرائح التغطية المطلية بالذهب الغروي في الوسط الخلوي المناسب للخلايا المستهدفة.
  2. انقل الخلايا المعالجة بشكل مناسب إلى شرائح التغطية المطلية بالذهب الغروي والموضوعة في طبق (أو أطباق) مكون من 24 بئراً.

ملاحظة: يجب تحديد عدد الخلايا التي يتم نقلها إلى البئر الواحد لكل نوع من الخلايا المدروسة. ومن الناحية المثالية، يجب توزيع الخلايا بالتساوي على غطاء الشريحة المطلي بالذهب الغروي، مما يسمح بدورها بإجراء التحليل الإحصائي للمسارات التي أنشأتها خلية واحدة فقط. وإذا تم زرع الخلايا بتركيز مرتفع للغاية، يصبح من المحتمل جداً رؤية مسارات متداخلة لخلايا متعددة. ولا يمكن تقدير المسارات المتداخلة كمياً بدقة، وبالتالي لا يمكن أخذها في الاعتبار في التحليلات النهائية لحركة الخلايا المختبرة. وعادة ما يتم ملاحظة المسارات المتداخلة الناتجة عن مشاركة خلايا متعددة بسهولة، حيث تظهر كمسارات مدمجة أو متقاطعة (في مجال التحليل) والتي يمكن من خلالها ملاحظة خليتين أو أكثر في نفس المنطقة الصافية المتصلة.

  1. يُحضن المزيج عند 37 °C/5% CO2 لمدة 24 hr (أو لأي وقت مناسب؛ على سبيل المثال، قمنا بتحليل حركية الخلايا الوحيدة بين 6 hr و24 hr بعد المعالجة، والخلايا البطانية عند 12 hr بعد المعالجة). يختلف الإطار الزمني الأمثل لتحديد وقياس الحركية الخلوية حسب نوع الخلايا المدروسة، وبالتالي يجب تحديده تجريبياً لكل نوع من الخلايا (ومع ذلك، فإن 6 - 12 hr بعد المعالجة تُعد نقطة بداية جيدة).

ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة لتخزين الشريحات الزجاجية المغطاة بالذهب الغروي التجريبية و/أو تحليلها في وقت لاحق، فيجب تثبيت الخلايا وجسيمات الذهب النانوية على الشريحات الزجاجية. ولإتمام خطوة التثبيت هذه؛ بعد الخطوة 3.3، يتم أولاً غسل الشريحات الزجاجية بعناية مرتين باستخدام 1x PBS (ويفضل غمر الشريحات الزجاجية، حيث يجب تجنب إزالة جسيمات الذهب النانوية من الشريحات)، ثم تُستخدم طريقة قياسية لتثبيت الخلايا، مثل الحضن في 3% paraformaldehyde في درجة حرارة الغرفة. وبعد الحضن لمدة 15-min، يجب إزالة 3% paraformaldehyde وغسل الشريحات الزجاجية بعناية 3 مرات باستخدام 1x PBS. ويمكن تخزين الشريحات الزجاجية المثبتة في الثلاجة.

  1. باستخدام مجهر ضوئي، قم بالتقاط صور للمسارات التي خلفتها خلية واحدة متحركة (ملاحظة: ستختلف قوة التكبير المستخدمة لتصوير المسارات الخلوية بالتأكيد بناءً على نوع الخلية قيد الدراسة). تظهر أمثلة للمسارات الخلوية التي خلفتها خلايا غير متحركة وخلايا متحركة على شرائح غطاء مغطاة بالذهب الغروي في الشكل 2.

ملاحظة: تبيّن أن جسيمات الذهب النانوية بالحجم المستخدم في مقايسة حركية المسار البلعومية غير سامة تماماً للخلايا30. وإذا لزم الأمر، يمكن تقييم حيوية الخلايا المفحوصة عن طريق الصبغ بصبغة trypan blue أو فحص مؤشرات أخرى للحيوية الخلوية. ويجب مراعاة الحاجة إلى التثبيت ونوعه وما إلى ذلك في حال تطلب الأمر القيام بهذه الخطوة.

  1. باستخدام برمجيات متاحة مجانًا، مثل برنامج ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) أو NIH Image (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/)، وكلاهما تم تطويرهما في المعاهد الوطنية للصحة (National Institutes of Health)، أو برنامج ImageTool (http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.htmlتم تطوير هذه الطريقة في المركز الصحي لعلوم جامعة تكساس في سان أنطونيو، حيث يتم تحديد متوسط المساحة (بوحدات اعتبارية) للذهب الغروي التي قامت بتطهيرها 10-20 خلية أو أكثر (لكل عينة) لكل ذراع تجريبي من الصور الملتقطة. ويمكن بعد ذلك إجراء التحليلات الإحصائية على النتائج التي تم جمعها؛ فعلى سبيل المثال، يمكن رسم النتائج كمتوسطات ± الأخطاء المعيارية للمتوسطات (SEM) باستخدام اختبار Student's ت الاختبارات التي أُجريت، و P قيمة <استُخدمت القيمة 0.05 كمقياس للدلالة الإحصائية بين العينات. الشكلان 3 و4 توضيح خطوات تحليل مساحة الذهب الغروي التي قامت الخلية بإزالتها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يظهر هنا مثال لصور تم التقاطها باستخدام مجهر ضوئي توضح منطقة مسار أخلاها خلية واحدة (يظهر مونوسايت من تجاربنا في الشكل 2)). وتنشئ الخلايا غير المتحركة مسارات مميزة صغيرة بيضاوية أو دائرية الشكل حول نفسها، مما يشير إلى مستوى أساسي منخفض من الحركة لهذه الخلايا غير المحفزة (الشكلان 2A و2B). وفي المقابل، تتميز الخلايا عالية الحركة [في نظامنا، الخلايا المصابة بالفيروس المضخم للخلايا البشري (HCMV)] بحركة توجيهية تظهر في الشكلين 2C و2D على شكل مناطق مسار مستطيلة. وبعد الحصول عل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يُعد مقايسة حركية المسار البلعومي المقدمة في هذا المقال طريقة بسيطة وفعالة للغاية للتحليل الكمي لهجرة الخلايا. ونظراً لإمكانية تحليل أنواع متعددة من الخلايا9-17، فإن هذه الطريقة تمتلك إمكانات استخدام واسعة عبر تخصصات متعددة. ويسمح استخدام أغطية شرائح زجاجية مطلية بالذهب الغروي بقياس مساحة المسار التي خلت منها خلية متحركة. ويمكن لهذه المقايسة قياس تأثير المحفزات المختلفة (أي عوامل النمو، أو ربيطات المصفوفة خارج الخلوية المنقاة، أو الفيروسات، أو البكتيريا) على حركية الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، فإن عدم اش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لم يتم الإفصاح عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منح مقدمة من المعاهد الوطنية للصحة (AI050677، و HD-051998، و GM103433)، وزمالة مالكولم فيست لأبحاث القلب والأوعية الدموية، وزمالة ما قبل الدكتوراه من جمعية القلب الأمريكية (10PRE4200007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أغطية شرائح زجاجية (15mm)Fisher Scientific12-545-83
جيلاتين 300 BloomSigma-AldrichG-1890
حمض رباعي كلورو الذهبيك ثلاثي الهيدراتFisher ChemicalG54-114.5 mM (محلول عمل نهائي)
سترات الصوديومFisher ScientificBP327-5000.5% (محلول عمل نهائي)
بارافورمالدهيدFisher ScientificO40423% (محلول عمل نهائي)
أطباق زراعة أنسجة 100 mmSarstedt83.1802
أطباق 12 عينFisher Scientific08-772-29
أطباق 24 عينFisher Scientific07-200-84
جهاز تهجين Techne Oven Hybridiser HB-1DLabPlanet2040500سيكون فرن المختبر القياسي كافياً
ماصات سيرولوجية 10 mlSarstedt86.1254.001
جهاز تعبئة/تفريغ Pipet-AidDrummond13-681-15
ماصة يدوية أحادية القناة P200RaininPR-200
رؤوس ماصات حاجزة 200 mlCLPBT200
برنامج ImageJhttp://rsb.info.nih.gov/ij/الترخيص: ملكية عامة
مجهر Nikon Eclipse TE300 مع كاميرا photometrics CoolSNAPfx أحادية اللون بدقة 12-bit CCDNikonتوقف إنتاجه؛ المواصفات الأكثر قابلية للمقارنة تتوفر في Nikon Eclipse Ti، ولكن Nikon 80i من الفئة الأدنى سيكون مناسباً أيضاً. وتوفر علامات تجارية أخرى مجاهر مماثلة.
ملاحظة: لقد استخدمنا الكواشف والمعدات المدرجة أدناه في دراساتنا المختلفة. ويمكن استخدام لوازم وموردين وكواشف ومعدات أخرى طالما كانت لها مواصفات مماثلة.

المراجع

  1. Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
  2. Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
  3. Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).
  4. Etienne-Manneville, S. Polarity proteins in migration and invasion. Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).
  5. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  6. Mitchison, T. J., Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84, 371-379 (1996).
  7. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
  8. Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell. 87, 601-606 (1996).
  9. Albrecht-Buehler, G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells. Cell. 11, 395-404 (1977).
  10. Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).
  11. Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. Methods in Molecular Biology. 622, Humana Press. 379-392 (2010).
  12. Ohta, H., et al. HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells. Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).
  13. Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate. FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).
  14. Kawamura, K., et al. N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).
  15. Ando, Y., Jensen, P. J. Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration. J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).
  16. Todt, J. C., et al. Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility. Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).
  17. McAuslan, B. R., Reilly, W. Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions. Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).
  18. Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner. J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).
  19. Smith, M. S., et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence. J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).
  20. Bentz, G. L., Yurochko, A. D. Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).
  21. Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).
  22. Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry. J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).
  23. Turkevich, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).
  24. Frens, G. Particle size and sol stability in mental colloids. Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).
  25. Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).
  26. Zetter, B. R. Assay of capillary endothelial cell migration. Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).
  27. Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility. Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).
  28. Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions. Immunology. 77, 298-303 (1992).
  29. Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC Cell Biol. 6, 14(2005).
  30. Pan, Y., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 3, 1941-1949 (2007).
  31. Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound-healing assay. Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).
  32. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  33. Brooks, D. M., Brooks, S. A. In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R). Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).
  34. Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway. J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).
  35. Benazeraf, B., et al. A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo. Nature. 466, 248-252 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

قياس الحركية الخلويةطلاء الجسيمات النانوية الذهبيةاختزال حمض كلورو الذهبيكشرائح غطاء مطلية بالجيلاتينتحليل المجهر الضوئيبرنامج Image Jقياس هجرة الخلاياتحضير الذهب الغرويتحليل مسارات الحركية
A التقييم الكمي للهجرة الخليوي من قبل مصلحة دمغ المصوغات المسار على الحركة Phagokinetic
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.