مقالة منهجية

A التقييم الكمي للهجرة الخليوي من قبل مصلحة دمغ المصوغات المسار على الحركة Phagokinetic

DOI:

10.3791/4165

⸱

ديسمبر 4, 2012

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Louisiana State University Health Sciences Center, 2Center for Molecular and Tumor Virology, Louisiana State University Health Sciences Center, 3Department of Microbiology and Immunology, SUNY Upstate Medical University, 4Feist-Weiller Cancer Center, Louisiana State University Health Sciences Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مقايسة مسار الحركة البلعمية هي طريقة تستخدم لتقييم حركة الخلايا. على وجه التحديد ، يقيس الاختبار الكيموكينز (حركة الخلايا العشوائية) بمرور الوقت بطريقة كمية. يستفيد الاختبار من قدرة الخلايا على إنشاء مسار قابل للقياس لحركتها على أغطية غروية مطلية بالذهب.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحركة الخلوية هي عملية بيولوجية مهمة لكل من الكائنات أحادية الخلية ومتعددة الخلايا. إنه ضروري لحركة الكائنات أحادية الخلية نحو مصدر للعناصر الغذائية أو بعيدا عن الظروف غير المناسبة ، وكذلك في الكائنات متعددة الخلايا لنمو الأنسجة والمراقبة المناعية والتئام الجروح ، على سبيل المثال لا الحصر بعض الأدوار1،2،3. يمكن أن يؤدي تحرير هذه العملية إلى أمراض عصبية وقلبية وعائية ومناعية خطيرة ، بالإضافة إلى تفاقم تكوين الورموانتشاره 4,5. من الناحية الجزيئية ، ثبت أن بلمرة الأكتين وإعادة تدوير المستقبلات تلعب أدوارا مهمة في إنشاء امتدادات خلوية (صفيحة) ، والتي تدفع الحركة الأمامية للخلية6،7،8. ومع ذلك ، لا تزال العديد من الأسئلة البيولوجية حول هجرة الخلايا دون إجابة.

يؤكد الدور المركزي للحركة الخلوية في صحة الإنسان ومرضه على أهمية فهم الآليات المحددة التي تنطوي عليها هذه العملية ويجعل الطرق الدقيقة لتقييم حركة الخلية مهمة بشكل خاص. عادة ما تستخدم المجاهر لتصور حركة الخلايا. ومع ذلك ، تتحرك الخلايا ببطء إلى حد ما ، مما يجعل القياس الكمي لهجرة الخلايا عملية تستهلك الموارد تتطلب كاميرات وبرامج باهظة الثمن لإنشاء أفلام كمية منقطعة زمنيا للخلايا المتحركة. لذلك ، فإن القدرة على إجراء قياس كمي لهجرة الخلايا تكون فعالة من حيث التكلفة وغير شاقة وتستخدم معدات المختبرات الشائعة هي حاجة كبيرة للعديد من الباحثين.

يستخدم مقايسة حركة المسار البلعمية قدرة الخلية المتحركة على إزالة جزيئات الذهب من مسارها لإنشاء مسار قابل للقياس على غطاء زجاجي غروي مطلي بالذهب9،10. باستخدام البرامج المتاحة مجانا ، يمكن تقييم مسارات متعددة لكل علاج لتحقيق المتطلبات الإحصائية. يمكن استخدام الاختبار لتقييم حركة العديد من أنواع الخلايا ، مثل الخلايا السرطانية11،12 ، والخلايا الليفية9 ، والعدلات13 ، وخلايا العضلات الهيكلية14 ، والخلايا الكيراتينية15 ، والأرومات الغاذية16 ، والخلايا البطانية17 ، والخلايا الوحيدة10،18-22. يتضمن البروتوكول إنشاء شرائح مطلية بجسيمات الذهب النانوية (Au °) التي يتم إنشاؤها عن طريق تقليل حمض الكلورووريك (Au3+) بواسطة سترات الصوديوم. تم تطوير هذه الطريقة بواسطة Turkevich et al. في عام 195123 ثم تم تحسينها في السبعينيات من قبل Frens et al.24،25. نتيجة لخطوة الاختزال الكيميائي هذه ، تترسب جزيئات الذهب (قطرها 10-20 نانومتر) من خليط التفاعل ويمكن تطبيقها على الأغطية الزجاجية ، والتي تكون جاهزة بعد ذلك للاستخدام في تحليلات الهجرة الخلوية9،26،27.

بشكل عام ، يعد مقايسة حركة المسار البلعمية مقياسا سريعا وكميا وسهلا للحركة الخلوية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامه كمقايسة بسيطة عالية الإنتاجية ، للاستخدام مع أنواع الخلايا غير القابلة للتصوير بمرور الوقت ، بالإضافة إلى الاستخدامات الأخرى حسب احتياجات الباحث. معا ، فإن القدرة على قياس الحركة الخلوية لأنواع متعددة من الخلايا كميا دون الحاجة إلى مجاهر وبرامج باهظة الثمن ، إلى جانب استخدام معدات المختبرات والمواد الكيميائية الشائعة ، تجعل مقايسة حركة المسار البلعمية خيارا قويا للعلماء المهتمين بفهم الحركة الخلوية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة < p = "jove_title" >1. تحضير أغطية مغلفة بالجيلاتين

  1. ضع أغطية زجاجية مغسولة بالحمض (قطرها 15 مم) في طبق (أطباق) بلاستيكية معقمة مقاس 100 مم. ضع 8-9 أغطية لكل طبق وتأكد من أنها لا تلامس بعضها البعض أو جوانب الطبق.

ملاحظة: يجب أن تكون الأغطية والإبر والملاقط معقمة للتخلص من الكائنات الحية الدقيقة الملوثة المحتملة ، وكذلك السموم الداخلية التي ستؤثر على الوظائف الخلوية ، بما في ذلك الحركة.

  1. قم بوزن مسحوق الجيلاتين وأعد تعليق المسحوق في ماء منزوع الأيونات لعمل محلول جيلاتين بتركيز نهائي يبلغ 0.5 جم / 300 مل. بعد ذلك ، يجب تعقيم محلول الجيلاتين.
  2. ماصة 2-3 قطرات من الجيلاتين (~ 100-150 مل) على كل غطاء.

ملاحظة: احرص على عدم السماح للجيلاتين بلمس الطبق وإلا فلن تتمكن من إزالة الغطاء من الطبق.

  1. تخبز الغطاء المطلي بالجيلاتين في طبق 100 مم في فرن على حرارة 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  2. قم بإزالة الجيلاتين الزائد عن طريق سحب العينة اللطيف.
  3. جفف الغطاء في طبق 100 مم في الفرن على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
  4. بمجرد أن يجف ، قم بإزالة الغطاء من الطبق مقاس 100 مم باستخدام إبرة وملاقط معقمة وخالية من السموم الداخلية (تستخدم الإبرة لدفع الغطاء برفق لأعلى لجعله في متناول الملقط لإزالته برفق).
  5. ضع أغطية فردية مطلية بالجيلاتين في آبار منفصلة من طبق 24 بئرا.
فئة

2. تحضير أغطية غروية مطلية بالذهب

  1. وزن كمية مناسبة من حمض الكلوروريك (ثلاثي هيدرات حمض رباعي كلورو أوريك; HAuCl4 · 3 ساعات2O) ثم أعيدها في ماء معقم منزوع الأيونات لتحضير محلول نهائي 14.5 ملي مولار (سام). تحضير 1.5 مل من المحلول لكل 8-9 أغطية.

تحذير: حمض الكلوروريك ضار إذا تم ابتلاعه ، ويسبب حروقا شديدة في الجلد وتلف العين وقد يسبب رد فعل تحسسي للجلد. سام إذا ابتلع.

  1. وزن كمية مناسبة من سترات الصوديوم (ثلاثي الهيدروجين 2-هيدروكسي بروبان-1،2،3-ثلاثي كربوكسيلات ؛ Na3C6H5O7) ثم أعد تعليق المسحوق في الماء منزوع الأيونات لعمل محلول نهائي بنسبة 0.5٪. تحضير 1 مل من المحلول لكل 8-9 أغطية.

تحذير: قد تسبب سترات الصوديوم تهيج العين والجلد. قد يسبب أيضا تهيج الجهاز التنفسي والجهاز الهضمي.

  1. في دورق معقم خال من السموم الداخلية ، امزج بين 1.5 مل من محلول HAuCl4 المعقم 14.5 ملي و13.5 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات ؛ يجب أن تنتج النتيجة محلول أصفر باهت. ستسمح المجلدات المذكورة أعلاه بعمل 8-9 أغطية ذهبية غروية.
  2. أثناء التحريك المستمر ، سخني المحلول على طبق ساخن حتى يبدأ في الغليان.

تحذير: يجب إجراء تسخين المحلول في غطاء الدخان ، حيث يمكن أن تكون الأبخرة ضارة / سامة. الأبخرة مدمرة لأنسجة الأغشية المخاطية والجهاز التنفسي العلوي.

  1. أخرج الدورق من الطبق الساخن.
  2. أثناء التقليب ، أضف 0.7 مل من محلول سترات الصوديوم 0.5٪. سيسمح الحجم المذكور أعلاه بعمل 8-9 أغطية ذهبية غروية.
  3. استمر في تقليب هذا المحلول المركب لمدة دقيقتين تقريبا (ملاحظة: سيتغير لون المحلول تدريجيا من الأصفر الباهت ، إلى الصافي ، إلى الرمادي ، إلى الأرجواني ، إلى الأرجواني الغامق ، قبل أن يصل أخيرا إلى نبيذ أحمر أو يفضل لون الصدأ). هذا المنتج هو محلول الذهب الغروي.
  4. قم بتبريد محلول الذهب الغروي في ماصة سعة 10 مل لمدة 1-2 دقيقة (من أجل الحفاظ على طبقة الجيلاتين الموجودة على الغطاء من الذوبان عند إضافة محلول الذهب الغروي) ثم أضف 1.0-2.0 مل من محلول الذهب الغروي على كل غطاء مغلف بالجيلاتين تم وضعه مسبقا في طبق (أطباق) مكون من 24 بئرا (تعتمد كمية محلول الذهب الغروي الذي تضيفه إلى الغطاء المطلي بالجيلاتين على مدى جودة جزيئات الذهب) عجلت في الحل - انظر التعليقات أدناه).

ملاحظة: نظرا لوجود اختلافات في كفاءة ترسيب جزيئات الذهب ، ينصح أولا بإضافة 0.5-1 مل من محلول الذهب الغروي إلى أغطية المغلفة بالجيلاتين ثم وضع الطبق المكون من 24 بئرا في الحاضنة لمدة 0.5 ساعة. بعد وقت الحضانة هذا ، يجب فحص الغطاء تحت المجهر الضوئي لمعرفة الكثافة المناسبة لجزيئات الذهب على الغطاء. انظر الشكل 1 للحصول على صور مجهرية 20x لأمثلة على تركيز منخفض جدا ومرتفع جدا لجزيئات الذهب. انظر الشكل 2 للحصول على صور مجهرية 40x لتركيز مثالي لجزيئات الذهب (على الأقل للاستخدام مع الخلايا الوحيدة). يجب تحديد الكثافة المثلى للجزيئات النانوية الذهبية على الشريحة تجريبيا لكل نوع من أنواع الخلايا المستخدمة ، حيث ستحدد خصائص الخلايا المختلفة قوة حركتها على الغطاء. إذا كان تركيز جزيئات الذهب غير كاف ، أضف 0.5-1 مل إضافي من محلول الذهب الغروي إلى الغطاء المطلي بالجيلاتين.

اعتمادا على حجم الخلية ، يمكن أن يختلف التركيز المناسب لجزيئات الذهب ، وبالتالي سيعتمد في النهاية على حجم الخلية التي تم فحصها بحثا عن الحركة. على سبيل المثال ، مع كون الخلايا الوحيدة البشرية خلايا صغيرة الحجم (~ 10-20 ميكرومتر28) ، كان تركيز أعلى من جزيئات الذهب مطلوبا في تحليلاتنا. يوفر التوزيع المناسب لجزيئات الذهب النانوية للباحث القدرة على تمييز حواف المسارات الخلوية بسهولة وكفاءة. إن تركيز جزيئات الذهب المرتفع جدا يعيق قدرة الخلايا على الحركة وبالتالي قياس حركتها بدقة ، في حين أن تركيز جزيئات الذهب المنخفض جدا يحد من قدرتها على تحديد مسار دقيق للحركة.

ملاحظة مهمة: إذا كان تخليق جزيئات الذهب النانوية يمثل مشكلة ، فإن جزيئات الذهب النانوية المركبة متوفرة تجاريا بأحجام من 5 نانومتر إلى 400 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام الكريات المجهرية الفلورية أيضا في دراسات حركة الخلية29. ومع ذلك ، فإن استخدام هذه الكريات المجهرية يتطلب مجهرا فلوريا لتحليل هجرة الخلايا.

  1. ضع الطبق المكون من 24 بئرا مع أغطية غروية مغطاة بالذهب في حاضنة عند 37 درجة مئوية واحتضنه من ساعة واحدة إلى ليلة كاملة.
  2. بعد الحضانة ، اشطف / قم بإزالة الذهب غير المربوط عن طريق غمس الغطاء (3x) في محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS ؛ درجة الحموضة 7.4).
  3. ضع هذه الطبقات المغلفة بالذهب الغروية في طبق (أطباق) نظيفة مكونة من 12 بئرا تحتوي على PBS.
  4. قم بتخزين هذه الأغطية على حرارة 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام (قم بإعادة إنتاج الطبق قبل وضعها في الثلاجة).

ملاحظة مهمة: احتفظ دائما بالأغطية الغروية المطلية بالذهب في نوع من السوائل / الوسائط حيث يمكن أن تتقشر جزيئات الذهب من الغطاء إذا سمح لها بالجفاف. يجب استخدام أغطية الذهب الغروية في غضون 2-3 أشهر من تاريخ صنعها.

مراقبة الجودة: في مقايسة حركة المسار البلعمية ، من الأهمية بمكان استخدام أغطية تتميز بتركيز مماثل من جزيئات الذهب. ستسمح هذه النقطة البسيطة بأن تكون الاختلافات الكمية في الحركة الخلوية بين العينات ناتجة فقط عن طبيعة العلاج وليس الخصائص الفيزيائية للأغطية الغروية المطلية بالذهب. نحن نفضل استخدام أغطية المصنوعة في نفس الوقت فقط في التجارب الفردية ، على الرغم من أننا أظهرنا أنه طالما أن كثافة جزيئات الذهب النانوية متساوية ، فإن استخدام أغطية من مستحضرات مختلفة مناسب.

< p class = "jove_title" >3. تحليل الحركة الخلوية

  1. ضع الغطاء الغروي المطلي بالذهب في وسط خلوي مناسب للخلايا ذات الأهمية.
  2. نقل الخلايا المعالجة بشكل مناسب إلى أغطية غروية مطلية بالذهب موضوعة في طبق (أطباق) مكون من 24 بئرا

ملاحظة: يجب تحديد عدد الخلايا المنقولة إلى البئر الفردي لكل نوع خلية تمت دراسته. من الناحية المثالية ، يجب توزيع الخلايا بالتساوي على الغطاء الغروي المطلي بالذهب ، والذي بدوره سيسمح بالتحليل الإحصائي للمسارات التي تم إنشاؤها بواسطة خلية واحدة فقط. إذا تم طلاء الخلايا بتركيز عال جدا ، يصبح من المحتمل جدا رؤية مسارات متداخلة لخلايا متعددة. لا يمكن قياس المسارات المتداخلة بدقة ، وبالتالي ، لا يمكن أخذها في الاعتبار في التحليلات النهائية لحركة الخلايا المختبرة. عادة ما يتم ملاحظة المسارات المتداخلة نتيجة لتورط خلايا متعددة بسهولة. كمسارات مدمجة أو متقاطعة (في مجال التحليل) حيث يمكن ملاحظة خليتين أو أكثر في نفس المنطقة المجاورة التي تم تطهيرها.

  1. احتضان عند 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 24 ساعة (أو لأي وقت مناسب ؛ على سبيل المثال ، قمنا بتحليل حركة الخلايا الوحيدة بين 6 ساعات و 24 ساعة بعد العلاج والخلايا البطانية في 12 ساعة بعد العلاج). سيختلف الإطار الزمني الأمثل لتحديد وقياس الحركة الخلوية باختلاف نوع الخلية المدروسة ، وبالتالي يجب تحديده تجريبيا لكل نوع من أنواع الخلايا (ومع ذلك ، فإن نقطة البداية الجيدة هي 6-12 ساعة بعد العلاج).

ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة إلى تخزين و / أو تحليل الأغطية الغروية المغلفة بالذهب في وقت لاحق ، فيجب تثبيت الخلايا وجسيمات الذهب النانوية على الغطاء. لإنجاز خطوة التثبيت هذه ؛ بعد الخطوة 3.3 ، قم أولا بغسل أغطية الغطاء بعناية مرتين باستخدام 1x PBS (يفضل غمس الغطاء ، حيث يجب تجنب إزالة جزيئات الذهب النانوية من الغطاء) ، ثم استخدم طريقة تثبيت الخلايا القياسية ، مثل الحضانة بدرجة حرارة الغرفة 3٪ بارافورمالدهايد. بعد حضانة لمدة 15 دقيقة ، يجب إزالة 3٪ بارافورمالدهيد وغسل الغطاء بعناية 3 مرات باستخدام 1x PBS. يمكن تخزين أغطية التثبيت في الثلاجة.

  1. باستخدام المجهر الضوئي ، التقط صورا للمسارات التي تم إنشاؤها بواسطة خلية متحركة واحدة (ملاحظة: من المؤكد أن التكبير المستخدم لالتقاط صور للمسارات الخلوية سيختلف اعتمادا على نوع الخلية قيد الفحص). تظهر أمثلة على المسارات الخلوية التي تم إنشاؤها بواسطة الخلايا غير المتحركة والمتحركة على أغطية غروية مطلية بالذهب في الشكل 2.

ملاحظة: تم العثور على جزيئات الذهب النانوية بالحجم المستخدم في مقايسة حركة المسار البلعمي غير سامة تماما للخلايا30. إذا لزم الأمر ، يمكن تقييم صلاحية الخلايا التي تم فحصها عن طريق تلطيخ المثقب الأزرق أو فحصه بحثا عن علامات أخرى للبقاء الخلوي. يجب على المرء أن يأخذ في الاعتبار الحاجة إلى التثبيت ونوع التثبيت وما إلى ذلك ، إذا كانت هذه الخطوة بحاجة إلى القيام بها.

  1. استخدام البرامج المتاحة مجانا ، مثل برنامج ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) أو صورة المعاهد الوطنية للصحة (http://rsb.info.nih.gov/nih-image/) ، وكلاهما تم تطويره في المعاهد الوطنية للصحة ، أو ImageTool (http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html) تم تطويره في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في سان أنطونيو ، ويتم تحديد متوسط المساحة (في وحدات تعسفية) من الذهب الغروي الذي تم تطهيره بواسطة 10-20 خلية أو أكثر (لكل عينة) لكل ذراع تجريبية من الصور الملتقطة. يمكن بعد ذلك إجراء إحصائيات على النتائج التي تم جمعها. على سبيل المثال ، يمكن رسم النتائج كوسيلة ± الأخطاء القياسية للوسائل (SEM) مع اختبارات Student's t التي تم إجراؤها ، وتستخدم قيمة P <0.05 كمقياس للدلالة الإحصائية بين العينات. يوضح الشكلان 3 و 4 خطوات في تحليل منطقة الذهب الغروي التي تم تنظيفها بواسطة الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر مثال على الصور التي تم التقاطها تحت المجهر الضوئي تظهر منطقة مسار تم تطهيرها بواسطة خلية واحدة (تظهر خلية وحيدة من تجاربنا في الشكل 2). تخلق الخلايا غير المتحركة مسالك صغيرة مميزة أو بيضاوية أو دائرية الشكل حول نفسها مما يشير إلى انخفاض مستوى الحركة القاعدي لهذه الخلايا غير المحفزة (الشكلان 2 أ و 2 ب). في المقابل ، تتميز الخلايا شديدة الحركة [في نظامنا ، الخلايا المصابة بالفيروس المضخم للخلايا البشرية (HCMV)] بحركة اتجاهية موضحة في الشكلين 2C و 2D كمناطق مسار ممدود...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد اختبار حركة المسار البلعمي المقدم في هذه المقالة طريقة بسيطة وفعالة للغاية للتحليل الكمي لهجرة الخلايا. نظرا لأنه يمكن تحليل أنواع خلايا متعددةمن 9 إلى 17 ، فإن هذه الطريقة لها استخدام واسع محتمل عبر تخصصات متعددة. يسمح استخدام الأغطية الزجاجية المطلية بالذهب الغروي بقياس مساحة الجنزير التي تم تطهيرها بواسطة خلية متحركة. يمكن للمقايسة قياس تأثير المحفزات المختلفة (مثل عوامل النمو ، روابط ECM المنقاة ، الفيروسات ، البكتيريا) على حركة الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عدم وجود متطلبات تثبيت الخلية يسم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (AI050677 ، HD-051998 ، و GM103433) ، وزمالة أبحاث القلب والأوعية الدموية في مالكولم فيست ، وزمالة ما قبل الدكتوراه من جمعية القلب الأمريكية (10PRE4200007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أغطية زجاجية (15 مم)فيشر سيانتيفك12-545-83
جيلاتين 300 بلومسيجما ألدريتشG-1890
حمض رباعي كلورو أوريك ثلاثي هيدراتفيشر كيميكالG54-114.5 ملي مولار (حل عمل نهائي)
سترات الصوديومفيشر ScientificBP327-5000.5٪ (حل عمل نهائي)
بارافورمالدهيدفيشر ساينتفيكO40423٪ (حل عمل نهائي)
100 مم طبق زراعة الأنسجةSarstedt83.1802
ألواح 12 بئرفيشر ساينتفيك08-772-29
ألواح 24 بئرفيشر Scientific07-200-84
Techne Oven Hybridiser HB-1DLabPlanet2040500يكفي فرن
10 مل ماصات مصليةSarstedt86.1254.001
حشو / موزع Pipet-AidDrummond13-681-15
P200 ماصة يدوية أحادية القناةRaininPR-200 200
مل أطراف حاجزCLPBT200
ImageJ softwarehttp:// rsb.info.nih.gov/ij/< / a>ترخيص: المجال العام
نيكون Eclipse TE300 مع القياسات الضوئية CoolSNAPfx أحادية اللون 12 بت CCDكاميرا نيكونتوقفت; المواصفات الأكثر قابلية للمقارنة لها نيكون Eclipse Ti ، ولكن النهاية الدنيا من نيكون 80i ستكون مناسبة أيضا. توفر العلامات التجارية الأخرى أيضا مجاهر مماثلة.
<قوي>ملاحظة: < / قوي> تم استخدام الكواشف والمعدات المدرجة أدناه من قبلنا في دراساتنا المختلفة. يمكن استخدام الإمدادات والموردين والكواشف والمعدات الأخرى ، طالما أن لديهم مواصفات مماثلة.
المختبر القياسي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armstrong, P. B. The control of cell motility during embryogenesis. Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).
  2. Dustin, M. L. Stop and go traffic to tune T cell responses. Immunity. 21, 305-314 (2004).
  3. Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).
  4. Etienne-Manneville, S. Polarity proteins in migration and invasion. Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).
  5. Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).
  6. Mitchison, T. J., Cramer, L. P. Actin-based cell motility and cell locomotion. Cell. 84, 371-379 (1996).
  7. Pollard, T. D., Borisy, G. G. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments. Cell. 112, 453-465 (2003).
  8. Bretscher, M. S. Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells. Cell. 87, 601-606 (1996).
  9. Albrecht-Buehler, G. The phagokinetic tracks of 3T3 cells. Cell. 11, 395-404 (1977).
  10. Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence. J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).
  11. Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. Methods in Molecular Biology. 622, Humana Press. 379-392 (2010).
  12. Ohta, H., et al. HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells. Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).
  13. Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate. FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).
  14. Kawamura, K., et al. N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor. J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).
  15. Ando, Y., Jensen, P. J. Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration. J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).
  16. Todt, J. C., et al. Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility. Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).
  17. McAuslan, B. R., Reilly, W. Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions. Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).
  18. Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner. J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).
  19. Smith, M. S., et al. Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence. J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).
  20. Bentz, G. L., Yurochko, A. D. Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).
  21. Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).
  22. Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry. J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).
  23. Turkevich, J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold. Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).
  24. Frens, G. Particle size and sol stability in mental colloids. Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).
  25. Frens, G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).
  26. Zetter, B. R. Assay of capillary endothelial cell migration. Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).
  27. Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility. Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).
  28. Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions. Immunology. 77, 298-303 (1992).
  29. Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility. BMC Cell Biol. 6, 14(2005).
  30. Pan, Y., et al. Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles. Small. 3, 1941-1949 (2007).
  31. Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. Wound-healing assay. Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).
  32. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  33. Brooks, D. M., Brooks, S. A. In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R). Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).
  34. Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway. J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).
  35. Benazeraf, B., et al. A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo. Nature. 466, 248-252 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Image J

مقالات ذات صلة