A التقييم الكمي للهجرة الخليوي من قبل مصلحة دمغ المصوغات المسار على الحركة Phagokinetic

ملخص

يُعد اختبار مسار الحركة البلعومية طريقة تُستخدم لتقييم حركة الخلايا. وبشكل محدد، يقيس هذا الاختبار الحركة الكيميائية (حركية الخلايا العشوائية) بمرور الوقت بطريقة كمية. ويستفيد الاختبار من قدرة الخلايا على تكوين مسار قابل للقياس لحركتها على شرائح تغطية مطلية بالذهب الغروي.

الملخص

تُعد الحركية الخلوية عملية بيولوجية مهمة لكل من الكائنات وحيدة الخلية ومتعددة الخلايا. فهي ضرورية لحركة الكائنات وحيدة الخلية نحو مصدر للمغذيات أو بعيداً عن الظروف غير المناسبة، كما أنها أساسية في الكائنات متعددة الخلايا من أجل تطور الأنسجة، والترصد المناعي، والتئام الجروح، على سبيل المثال لا الحصر^1,2,3. ويمكن أن يؤدي خلل تنظيم هذه العملية إلى أمراض عصبية وقلبية وعائية ومناعية خطيرة، فضلاً عن تفاقم تكوين الأورام وانتشارها^4,5. ومن الناحية الجزيئية، ثبت أن بلمرة الأكتين وإعادة تدوير المستقبلات يلعبان أدواراً مهمة في تكوين الامتدادات الخلوية (الأقدام الصفائحية)، التي تدفع الحركة الأمامية للخلية^6,7,8. ومع ذلك، لا تزال هناك العديد من التساؤلات البيولوجية حول هجرة الخلايا دون إجابات.

يؤكد الدور المركزي للحركية الخلوية في صحة الإنسان وأمراضه على أهمية فهم الآليات المحددة المشاركة في هذه العملية، ويجعل من الطرق الدقيقة لتقييم حركية الخلايا أمراً بالغ الأهمية بشكل خاص. تُستخدم المجاهر عادةً لتصوير حركة الخلايا، ومع ذلك، تتحرك الخلايا ببطء شديد، مما يجعل القياس الكمي لهجرة الخلايا عملية تستهلك الكثير من الموارد وتتطلب كاميرات وبرامج باهظة الثمن لإنشاء أفلام فاصلة زمنياً كمية للخلايا المتحركة. وبناءً على ذلك، فإن القدرة على إجراء قياس كمي لهجرة الخلايا يكون فعالاً من حيث التكلفة، وغير مجهد، ويستخدم معدات مختبرية شائعة، تمثل حاجة ماسة للعديد من الباحثين.

يستخدم مقايسة حركة مسار البلعمة (phagokinetic track motility assay) قدرة الخلية المتحركة على إزالة جزيئات الذهب من مسارها لإنشاء مسار قابل للقياس على شريحة زجاجية مغطاة بالذهب الغروي^9,10. وباستخدام برمجيات متاحة مجانًا، يمكن تقييم مسارات متعددة لكل معاملة لتحقيق المتطلبات الإحصائية. ويمكن استخدام هذه المقايسة لتقييم حركة العديد من أنواع الخلايا، مثل الخلايا السرطانية^11,12، والأرومات الليفية (fibroblasts)⁹، والخلايا المتعادلة (neutrophils)¹³، وخلايا العضلات الهيكلية¹⁴، والخلايا الكيراتينية (keratinocytes)¹⁵، والأرومات الغاذية (trophoblasts)¹⁶، والخلايا البطانية (endothelial cells)¹⁷، والخلايا الوحيدة (monocytes)^10,18-22. يتضمن البروتوكول إنشاء شرائح مغطاة بجسيمات الذهب النانوية (Au°) التي يتم توليدها عن طريق اختزال حمض الكلوروأوريك (Au³⁺) بواسطة سترات الصوديوم. طور Turkevich et al. هذه الطريقة في عام 1951²³ ثم قام Frens et al. بتحسينها في السبعينيات^24,25. ونتيجة لخطوة الاختزال الكيميائي هذه، تترسب جزيئات الذهب (بقطر 10-20 nm) من خليط التفاعل ويمكن تطبيقها على الشرائح الزجاجية، التي تصبح جاهزة بعد ذلك للاستخدام في تحليلات الهجرة الخلوية^9,26,27.

بشكل عام، يُعد مقايسة حركية المسار البلعومية طريقة سريعة وكمية وسهلة لقياس الحركية الخلوية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدامها كمقايسة بسيطة عالية الإنتاجية، لاستخدامها مع أنواع الخلايا التي لا تسمح بالتصوير المتقطع (time-lapsed imaging)، فضلاً عن استخدامات أخرى تعتمد على احتياجات الباحث. إن القدرة على قياس الحركية الخلوية لأنواع متعددة من الخلايا كمياً دون الحاجة إلى مجاهر وبرمجيات باهظة الثمن، إلى جانب استخدام المعدات والمواد الكيميائية المختبرية الشائعة، تجعل من مقايسة حركية المسار البلعومية خياراً قوياً للعلماء المهتمين بفهم الحركية الخلوية.

البروتوكول

1. تحضير شرائح التغطية المطلية بالجيلاتين

1. ضع شرائح غطاء زجاجية مغسولة بالحمض (بقطر 15 mm) في طبق (أو أطباق) بلاستيكية معقمة بحجم 100 mm. ضع من 8-9 شرائح في كل طبق وتأكد من عدم تلامسها مع بعضها البعض أو مع جوانب الطبق.

ملاحظة: يجب أن تكون أغطية الشرائح والإبر والملاقط معقمة للقضاء على الكائنات الدقيقة الملوثة المحتملة، وكذلك الذيفانات الداخلية التي ستؤثر على الوظائف الخلوية، بما في ذلك الحركة.

2. قم بوزن مسحوق الجيلاتين ثم أعد تعليقه في ماء منزوع الأيونات لتحضير محلول جيلاتين بتركيز نهائي قدره 0.5 g/300 ml. بعد ذلك، يجب تعقيم محلول الجيلاتين بجهاز الأوتوكلاف.
3. باستخدام الماصة،....

النتائج

يظهر هنا مثال لصور تم التقاطها باستخدام مجهر ضوئي توضح منطقة مسار أخلاها خلية واحدة (يظهر مونوسايت من تجاربنا في الشكل 2)). وتنشئ الخلايا غير المتحركة مسارات مميزة صغيرة بيضاوية أو دائرية الشكل حول نفسها، مما يشير إلى مستوى أساسي منخفض من الحركة لهذه الخلايا غير المحفزة (الشكلان 2A و2B). وفي المقابل، تتميز الخلايا عالية الحركة [في نظامنا، الخلايا المصابة بالفيروس المضخم للخلايا البشري (HCMV)] بحركة توجيهية تظهر في الشكلين 2C و2D على شكل مناطق مسار مستطيلة. وبعد الحصول عل.......

المناقشة

يُعد مقايسة حركية المسار البلعومي المقدمة في هذا المقال طريقة بسيطة وفعالة للغاية للتحليل الكمي لهجرة الخلايا. ونظراً لإمكانية تحليل أنواع متعددة من الخلايا^9-17، فإن هذه الطريقة تمتلك إمكانات استخدام واسعة عبر تخصصات متعددة. ويسمح استخدام أغطية شرائح زجاجية مطلية بالذهب الغروي بقياس مساحة المسار التي خلت منها خلية متحركة. ويمكن لهذه المقايسة قياس تأثير المحفزات المختلفة (أي عوامل النمو، أو ربيطات المصفوفة خارج الخلوية المنقاة، أو الفيروسات، أو البكتيريا) على حركية الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، فإن عدم اش.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أغطية شرائح زجاجية (15mm)	Fisher Scientific	12-545-83
جيلاتين 300 Bloom	Sigma-Aldrich	G-1890
حمض رباعي كلورو الذهبيك ثلاثي الهيدرات	Fisher Chemical	G54-1	14.5 mM (محلول عمل نهائي)
سترات الصوديوم	Fisher Scientific	BP327-500	0.5% (محلول عمل نهائي)
بارافورمالدهيد	Fisher Scientific	O4042	3% (محلول عمل نهائي)
أطباق زراعة أنسجة 100 mm	Sarstedt	83.1802
أطباق 12 عين	Fisher Scientific	08-772-29
أطباق 24 عين	Fisher Scientific	07-200-84
جهاز تهجين Techne Oven Hybridiser HB-1D	LabPlanet	2040500	سيكون فرن المختبر القياسي كافياً
ماصات سيرولوجية 10 ml	Sarstedt	86.1254.001
جهاز تعبئة/تفريغ Pipet-Aid	Drummond	13-681-15
ماصة يدوية أحادية القناة P200	Rainin	PR-200
رؤوس ماصات حاجزة 200 ml	CLP	BT200
برنامج ImageJ	http://rsb.info.nih.gov/ij/		الترخيص: ملكية عامة
مجهر Nikon Eclipse TE300 مع كاميرا photometrics CoolSNAPfx أحادية اللون بدقة 12-bit CCD	Nikon		توقف إنتاجه؛ المواصفات الأكثر قابلية للمقارنة تتوفر في Nikon Eclipse Ti، ولكن Nikon 80i من الفئة الأدنى سيكون مناسباً أيضاً. وتوفر علامات تجارية أخرى مجاهر مماثلة.
ملاحظة: لقد استخدمنا الكواشف والمعدات المدرجة أدناه في دراساتنا المختلفة. ويمكن استخدام لوازم وموردين وكواشف ومعدات أخرى طالما كانت لها مواصفات مماثلة.