يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان

16.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/4235

⸱

نوفمبر 5, 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Program in Translational Biology and Molecular Medicine, Baylor College of Medicine , 2Department of Medicine, Division of Nephrology, Baylor College of Medicine , 3Department of Immunology and Pathology, Shinshu University School of Medicine, 4Center for Cell and Gene Therapy, Baylor College of Medicine , 5Department of Pediatrics, Baylor College of Medicine , 6Program in Cell and Molecular Biology, Baylor College of Medicine , 7Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine , 8Michael E. DeBakey VA Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

وصفنا طريقة لتعديل خلايا T وراثيا الأساسي الإنسان مع التحوير باستخدام غير الفيروسية piggyBac ينقول النظام. خلايا T تعديلها لاستخدام piggyBac نظام ينقول التعبير المعرض التحوير مستقرة.

الملخص

نظام ينقول piggyBac نشط بشكل طبيعي، والمستمدة أصلا من 1،2 الملفوف فراشة وبير. هذا النظام غير الفيروسية هو البلازميد القائم، والأكثر شيوعا استخدام البلازميدات 2 مع واحد يعبر عن انزيم transposase piggyBac وينقول البلازميد إيواء الجينات (ق) في المصالح بين عناصر تكرار مقلوب وهي مطلوبة من أجل نقل الجينات النشاط. PiggyBac نقل الجينات من خلال يتوسط و"قص ولصق" آلية يمكن من خلالها للtransposase يدمج الجزء ينقول في جينوم الخلية الهدف (ق) من الفائدة. أثبتت كفاءة النشاط PiggyBac توصيل الجينات في مجموعة متنوعة واسعة من 1،2 الحشرات، الثدييات 3-5، و الإنسان بما في ذلك cells6 الأولية خلايا T الإنسان 7،8. مؤخرا، تم إنشاء transposase piggyBac مفرط تحسين كفاءة نقل الجينات 9،10.

الإنسان الخلايا الليمفاوية T هي من intere السريريةسانت لعلاج مناعي لسرطان بالتبني 11. من المذكرة، تمت الموافقة على أول محاكمة سريرية شملت ينقول تعديل خلايا T الإنسان باستخدام نظام ينقول الجميلة النائمة 12. لدينا تقييم من قبل الأداة المساعدة من piggyBac كمنهجية غير الفيروسية للالتعديل الوراثي للخلايا T الإنسان. وجدنا piggyBac لتكون فعالة في التعديل الوراثي للخلايا T الإنسان مع الجينات مراسل والانتحار غير محرض مناعة الجين 7. كشف تحليل لمواقع التكامل الجينومية عدم وجود تفضيل للاندماج الجينات المسرطنة بروتو أو بالقرب منها معروفة 13. كنا piggyBac لتعديل الجينات السامة للخلايا الليمفاوية T للقيام مستقبلات مستضد خيالية موجهة ضد مستضد الورم HER2، ووجد أن الجين بوساطة استهدفت خلايا T-معدلة قتل HER2 إيجابية الخلايا السرطانية في التجارب المختبرية والحية في نموذج الفأر مثلي 14. وقد استخدمنا أيضا piggyBacعلى توليد خلايا T المقاومة للrapamycin الإنسان، التي ينبغي أن تكون مفيدة في علاج السرطان حيث يستخدم rapamycin 15.

هنا، نحن تصف طريقة لاستخدام piggyBac لتعديل وراثيا خلايا T الأساسي الإنسان. وهذا يشمل عزل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) من دم الإنسان تليها الثقافة والتحوير الجيني، وتنشيط خلايا T. لغرض هذا التقرير، تم تعديل الخلايا T مع الجينات مراسل (EGFP) للتحليل الكمي والتعبير الجيني من قبل التدفق الخلوي.

ويمكن استخدام خلايا لتعديل PiggyBac T الإنسان مع مجموعة متنوعة من الجينات في المصالح. على الرغم من أننا قد استخدمت لتوجيه الخلايا piggyBac لمستضدات الأورام T 14، وقد استخدمنا أيضا piggyBac لإضافة مفتاح السلامة محرض من أجل القضاء على خلايا الجينات تعديل إذا لزم الأمر 7. وقد مكنت طاقة شحن كبيرة من piggyBac أيضا نقل الجينات منلمقاومة كبيرة rapamycin جزيء mTOR (15 KB) 15. ولذلك، فإننا نقدم منهجية غير مستقرة للفيروسات لتعديل الجينات من الخلايا الأولية T الإنسان لطائفة واسعة من الأغراض.

البروتوكول

اليوم 0

1. عزل PBMCs من دم الإنسان

  1. جمع 20 مل من الدم البشري الطازج باستخدام بزل الوريد إلى أنابيب vacutainer نا الهيبارين.
  2. مزيج الدم والمتقدم RPMI 1640 في 1:1 (V / V) النسبة.
  3. إضافة 20 مل المتوسطة lymphoprep إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل (25 ° C). ببطء طبقة 25-30 مل من الدم RPMI مزيج 1640 على رأس lymphoprep.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 40 دقيقة دون الفرامل.
  5. جمع كل من طبقات متميزة وغامض باستخدام ماصة المتاح في 10 مل من 1X PBS (25 ° C) وتبرزي حجم ما يصل الى 50 مل PBS 1X مع.
  6. أجهزة الطرد المركزي في 450 x ج لمدة 10 دقيقة.
  7. نضح طاف تماما وإضافة 20 مل من RPMI 1640 متقدم.
  8. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
  9. نضح طاف. prewarmed إضافة 10 مل من وسائل الإعلام خلية كاملة T تستكمل مع 5 نانوغرام / مل rhIL-15 ° 37 في C.
  10. حساب عدد الخلايا وعلى مدار 24 لوحة في نسيج معطف جيدا ثقافةإد لوحة في الخلايا 2 × 6 10 / وسائل الإعلام بشكل جيد في كامل الخلية T تستكمل مع 5 نانوغرام / مل rhIL-15 إضافة إلى آبار الماء المعقم المحيطة بها. احتضان بين عشية وضحاها في حاضنة مرطب عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.

يوم 1

2. لوحات طلاء جسم مع مكافحة CD28 ومكافحة CD3-T لتحفيز الخلايا

  1. تخفيف الأجسام المضادة المقاومة للCD28 ومكافحة CD3 في الماء المعقم عند تركيز من 1 ميكروغرام / مل لكل منهما.
  2. إضافة 500 ميكرولتر حل كل الأجسام المضادة إلى 5 آبار ملحوظ من زراعة الأنسجة غير المغلفة لوحة 24 أيضا.
  3. إضافة الماء المعقم للراحة من الآبار. التفاف لوحة التفاف يتقلص في وضعها في الثلاجة 4 C °.

3. Nucleofection من خلايا T Unstimulated

  1. Prewarm سائل الإعلام خلية T في 37 ° C والملحق مع 5 نانوغرام / مل من rhIL-15. إعداد الحل الكامل nucleofector عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من الملحق Nucleofector 1 حتي 2،25 مل من محلول Nucleofector.
  2. Aliquot 5 ميكروغرام لكل من ينقول (زيو-PT-CMV-EGFP) وtransposase (pCMV-piggyBac) في أنبوب 1.5 مل microfuge ملاحظة: قد يكون من الضروري لتحسين transposase وينقول كمية DNA لتوصيل الجينات الأمثل وتقليل ل سمية الخلوية. يمكن الحصول على البلازميدات من الكتاب حسب الطلب.
  3. PBMCs الحصاد من ال 24 جيدا الأنسجة لوحة الثقافة في أنبوب 50 مل. حساب عدد الخلايا. حفظ 2 × 10 6 خلايا لاستخدامها خلال مراقبة التدفق الخلوي.
  4. إضافة 7-10 × 10 6 خلايا لأنبوب الطرد المركزي 15 مل وبسعر 400 XG، 5 دقائق، نضح طاف وتوجيه أصابع بيليه ونفض الغبار.
  5. إضافة 100 ميكرولتر من حل خلية T nucleofection كاملة لبيليه الخلية خففت.
  6. إضافة الخليط إلى حل خلايا الأنبوب الذي يحتوي على البلازميدات.
  7. إضافة الخليط حل خلايا-البلازميد إلى الجزء السفلي من كوفيت nucleofection. يجب الحرص على عدم إدخال أي فقاعات.
  8. Nucleofect باستخدام الخلايا المواليةغرام U-014 (Unstimulated خلايا T، الإنسان، http://bio.lonza.com/resources/product-instructions/protocols/ ).
  9. إضافة 500 ميكرولتر فورا من وسائل الإعلام prewarmed مع rhIL-15 إلى كوفيت. نقل الخلايا إلى جانب لوحة بئر 24 مع 1.5 مل من وسائل الإعلام prewarmed مع rhIL15.
  10. احتضان بين عشية وضحاها في حاضنة مرطب عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.

يوم 2

4. غير محدد تحفيز خلايا T

  1. خلايا الحصاد وتحديد أرقام الخلية. تخصيص 0.5 × 10 6 خلايا لالتدفق الخلوي لتحديد وتيرة GFP إيجابية الخلايا. استخدام غير PBMCs بالنقل والضوابط.
  2. نضح الحل الأجسام المضادة CD3/28 من لوحة زراعة الأنسجة غير المغلفة وشطف جيدا مع وسائل الاعلام كل خلية T.
  3. إعادة تعليق الخلايا خلايا nucleofected عند 0.5 × 6 10 في مل في وسائل الإعلام CTL كاملةتستكمل مع 5 نانوغرام / مل rhIL-15. إضافة 2.0 مل كل من الخلايا nucleofected في 4 آبار لوحة زراعة الأنسجة غير. إضافة 0.5 × 10 6 خلايا غير nucleofected إلى ال 5 أيضا.
  4. احتضان لمدة 3 أيام في حاضنة مرطب عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2.

اليوم 5

  1. حصاد الخلايا T حفز من لوحة زراعة الأنسجة غير المغلفة.
  2. وتعول replate الخلايا في المغلفة جيدا لمدة 24 لوحة الأنسجة الثقافة بنسبة 0.7 × 10 6 خلية / مل في وسائل الإعلام خلية T مع 5 نانوغرام / مل IL-15.

يوم 7

7. تحليل التعبير الجيني

  1. خلايا الحصاد وصمة عار مع الأجسام المضادة لمكافحة CD8 الإنسان (يمكن أيضا استخدام المضادة للCD3 CD4 والمضادة لل) وتحليل التدفق الخلوي مع للتعبير GFP٪.

اليوم 8 (اختياري)

8. التوسع في الخلايا T

  1. في يوم 8 بعد ترنسفكأيشن، يمكن خلايا T في replated Tخلية الإعلام مع IL-15 في كثافة الخلايا بنسبة 0.7 X 6 10 لكل بئر لمزيد من التوسع 16.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويرد التخطيطي تبين الخطوات في تعديل وراثيا الخلايا الليمفاوية T الإنسان مع الجينات مراسل (EGFP) في الشكل رقم 1. هذه البلازميدات متوفرة عند الطلب من المؤلفين. A schemtic مما يدل على الخطوات في الخلايا الليمفاوية T المعدلة وراثيا الإنسان مع الجينات مراسل (EGFP) هو شووين في الشكل 2. من الضروري تنشيط خلايا T من أجل الحصول عليها لتقسيم والتوسع، ونشر في الثقافة. تم زراعة خلايا ثم تعديل T وتحليلها باستخدام التدفق الخلوي للتعبير الجينات في يوم 1 و يوم واح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الطريقة الموضحة هنا يمكن تعديل مستقرة التحوير الأولية الخلايا الليمفاوية T الإنسان. لقد اختبرنا سابقا استخدام نظام ينقول piggyBac لتعديل خلايا T للتعبير عن الجينات مراسل (لأكثر من 4 أسابيع)، جين الانتحار غير مناعة، ومستقبلات مستضد خيالية لعلاج مناعي بالتبني (لأكثر من 100 يوم)، ومهندس المقاومة للأدوية المثبطة للمناعة 7،13-15. يجب عدم تعديل للفيروسات خلايا T لعلاج مناعي بالتبني وغيرها من التطبيقات يكون أقل تكلفة بكثير وتستخدم على نطاق واسع بالتالي أكثر من تنبيغ ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

ويدعم SS في جزء من البحر المتوسط ​​إلى HHMI غراد التدريب من خلال برنامج المنح TBMM. ويدعم MHW في جزء من مهنة جائزة التنمية من وزارة شؤون المحاربين القدامى، وبدعم سخي من الدكتور هارولد والسيدة Selzman M.. وأيد أيضا هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة سرطان الغدد الليمفاوية P50CA126752 منحة المعاهد الوطنية للصحة وSPORE R01 DK093660.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
Lympholyte Cedarlane CL5015
المتقدمة RPMI 1640 LifeTechnologies 12633020
Hyclone مصل بقري جنيني فيشر العلمية SH3008803
GlutaMAX-I الملحق LifeTechnologies 35050-061
IL-15 البروتين المؤتلف الإنسان eBioscience 14-8159
EndoFree كيت ماكسي البلازميد QIAGEN 12362
Amaxa Nucleofector Lonza AAD-1001S & NBSP؛
T الخلية البشرية Nucleofector كيت Lonza VPA-1002
CD8-APC جنوب الحيوية 9536-11
مكافحة الإنسان CD3 eBioscience 16-0037-81
مكافحة CD28 الإنسان BD Pharmingen 555725
24 زراعة الأنسجة المعالجة حسنا لوحة BD الصقر 353047
24 زراعة الأنسجة غير المعالجة حسنا لوحة BD الصقر 351147
T خلية كاملة التكوين وسائل الإعلام
1X المتقدم RPMI 1640
الحرارة المعطل 5٪ مصل بقري جنيني
2 مم GlutamaxIM-I

المراجع

  1. Cary, L. C. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology. 172 (1), 156(1989).
  2. Fraser, M. J. Assay for movement of Lepidopteran transposon IFP2 in insect cells using a baculovirus genome as a target DNA. Virology. 211 (2), 397(1995).
  3. Ding, S. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473(2005).
  4. Saridey, S. K. PiggyBac transposon-based inducible gene expression in vivo after somatic cell gene transfer. Mol. Ther. 17 (12), 2115(2009).
  5. Nakanishi, H. piggyBac transposon-mediated long-term gene expression in mice. Mol. Ther. 18 (4), 707(2010).
  6. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. Jr PiggyBac Transposon-mediated Gene Transfer in Human Cells. Mol. Ther. 15 (1), 139(2007).
  7. Nakazawa, Y. Optimization of the PiggyBac transposon system for the sustained genetic modification of human T lymphocytes. J. Immunother. 32 (8), 826(2009).
  8. Raja Manuri, P. V. piggyBac transposon/transposase system to generate CD19-specific T cells for treatment of B-lineage malignancies. Hum. Gene Ther. 21 (4), 427(2010).
  9. Doherty, J. E. Hyperactive piggyBac gene transfer in human cells and in vivo. Hum. Gene Ther. , In Press (2011).
  10. Yusa, K. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (4), 1531(2011).
  11. Bonini, C. Genetic modification of T cells. Biol. Blood Marrow Transplant. 17, Suppl 1. S15-S20 (2011).
  12. Hackett, P. B., Largaespada, D. A., Cooper, L. J. A transposon and transposase system for human application. Mol. Ther. 18 (4), 1531(2010).
  13. Galvan, D. L. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J. Immunother. 32 (8), 837(2009).
  14. Nakazawa, Y. PiggyBac-Mediated Cancer Immunotherapy Using EBV-Specific Cytotoxic T-Cells Expressing HER2-Specific Chimeric Antigen Receptor. Mol. Ther. 19 (12), 2133(2011).
  15. Huye, L. E. Combining mTor Inhibitors With Rapamycin-resistant T Cells: A Two-pronged Approach to Tumor Elimination. Mol. Ther. 19 (12), 2239(2011).
  16. Vera, J. F. Accelerated production of antigen-specific T cells for preclinical and clinical applications using gas-permeable rapid expansion cultureware (G-Rex). J. Immunother. 33 (3), 305(2010).
  17. Kahlig, K. M. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (4), 1343(2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطيتحليل قياس التدفق الخلويتعديل جينيإجراء النوكليوفيكشنتنشيط الخلايا التائيةتعبير بروتين GFP المبلّغدمج مستقر للجين المنقولترانسبوزون غير فيروسي
piggyBac تعديل النظام الأساسي للخلايا ينقول T الإنسان
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.