نحن تصف طريقة جديدة لعزل الحمض النووي الجيني من الدم الكامل التي جمعت لبلازما / الأمصال. بعد جمع البلازما، ويتم عادة تجاهل الدم المضغوط. يمثل طريقة لدينا رواية تحسنا كبيرا خلال الأساليب القائمة ويجعل الحمض النووي والبلازما المتاحة من مجموعة واحدة، دون طلب دم إضافية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة عملية ومبتكرة لاستخراج الحمض النووي الجينوم من الدم أطقم مجموعة لحفظ البلازما بروتين
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الاختبارات المعملية يمكن القيام به على الأجزاء الخلوية أو السوائل من الدم. استخدام مختلف أنابيب جمع الدم يحدد جزء من الدم الذي يمكن تحليلها (الدم الكامل، البلازما أو مصل). مختبرات تشارك في دراسة الأساس الجيني للاضطرابات الإنسان تعتمد على الدم الكامل anticoagulated جمعها في vacutainer المحتوية على EDTA-كمصدر من الحمض النووي للتحليل الجيني / الجيني. لأن معظم المختبرات السريرية أداء الكيمياء الحيوية، وإجراء اختبارات مصلية والفيروسية كخطوة أولى في تحقيق نتائج المظهري، ويتم جمع الدم anticoagulated أيضا في أنبوب يحتوي على الهيبارين-(أنبوب البلازما). لذلك عندما تكون هناك حاجة الحمض النووي والبلازما للتحليلات متزامنة ومتوازية من البيانات على حد سواء الجينومية والبروتين، فمن المعتاد أن جمع الدم في كل من EDTA والأنابيب الهيبارين. إذا يمكن جمع الدم في أنبوب واحد، ويكون بمثابة مصدر لكلا البلازما والحمض النووي، وستنظر هذه الطريقة على التقدم إلى المنهجيات القائمةالمواد المستنفدة للأوزون. استخدام الدم المضغوط بعد استخراج البلازما يمثل مصدرا بديلا للالحمض النووي الجيني، وبالتالي التقليل من كمية عينات الدم معالجتها والحد من عدد العينات المطلوبة من كل مريض. وهذا من شأنه في النهاية توفير الوقت والموارد.
تم إنشاء نظام لجمع الدم P100 دينار بحريني لحفظ بروتين البلازما كما تحسن أسلوب أكثر من بلازما السابقة أو جمع المصل أنابيب 1، لتحقيق الاستقرار في محتوى البروتين من الدم، وتحسين واكتشاف العلامات البيولوجية البروتين والبروتينات التجريب من الدم البشري. وBD P100 أنابيب تحتوي على 15.8 مل من K2EDTA مجففة والملكية كوكتيل طيف واسع مجفف بالتجميد من مثبطات الأنزيم البروتيني لمنع تجلط الدم والعمل على استقرار بروتينات البلازما. وهي تشمل أيضا فاصل الميكانيكية، الذي يوفر حاجز مادي بين البلازما والكريات الخلية بعد الطرد المركزي. وقد وضعت عدد قليل من الطرق لاستخراج الحمض النووي من الدم المتجلط SAmples جمعها في أنابيب البلازما القديمة 2-4. وارتبطت التحديات من هذه الأساليب أساسا مع نوع من الفاصل داخل الأنابيب (هلام الفاصل) وشملت صعوبة في استرداد الدم المتجلط، وإزعاج من تفتيت أو تشتيت كلوت، وعرقلة استخراج كلوت بواسطة الجل الفصل.
نقدم الأسلوب الأول الذي يستخرج وينقي الحمض النووي الجيني من الدم تعادل في BD أنابيب P100 جديدة. قارنا نوعية عينة من الحمض النووي من P100 إلى أن أنابيب من أنابيب EDTA. نهجنا هو بسيطة وفعالة. أنها تنطوي على أربع خطوات رئيسية كما يلي: 1) استخدام BD P100 البلازما (تشخيص BD، سباركس، MD، الولايات المتحدة الأمريكية) أنبوب مع فاصل الميكانيكية لجمع الدم، 2) إزالة الفاصل الميكانيكية باستخدام مزيج من السكروز وعلى العقيمة هوك مشبك معدني، 3) الفصل بين طبقة معطف الشهباء تحتوي على خلايا بيضاء و 4) عزل الحمض النووي الجيني منمعطف الشهباء باستخدام الحمض النووي تجارية عدة استخراج العادية أو بروتوكول قياسي مماثل.
البروتوكول
1. جمع العينات
- جمع عينات الدم من الأفراد للموافقة المسبقة عن المناسبة. لكل فرد، واستخلاص 4-5 مل من الدم في أنبوب P100 (تشخيص دينار بحريني، فرانكلين بحيرة، NY، الولايات المتحدة الأمريكية). لأغراض المقارنة، في وقت واحد جمع الدم في أنبوب EDTA.
- وBD P100 أنابيب تحتوي على 15.8 مل K2EDTA مجففة والملكية كوكتيل طيف واسع مجفف بالتجميد من مثبطات الأنزيم البروتيني لمنع تجلط الدم والعمل على استقرار بروتينات البلازما. كما أنها تحتوي على فاصل الميكانيكية. بعد جمع الدم كله، والحفاظ على حد سواء الأنابيب في....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تقييم الجودة وقياس تركيز الحمض النووي
وكانت غلة P100_DNAs أقل بكثير من تلك التي EDTA_DNAs (الجدولان 1 و 2). نقاء الحمض النووي التي يمثلها قيمة 260/280 النسبة مشابهة لكلا P100_DNA وEDTA_DNA عينة مجموعة (الجدولان 1 و 2). نوعية الحمض النووي هو موحدة إلى حد ما داخل كل مجموعة من عينة على الرغم من أن شهدت بعض التدهور في عينات EDTA_DNA، كما يتضح من مسحة خف.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
كثير من الأمراض التي تصيب الإنسان لها أسباب وراثية واستكشاف الأساس الجيني للمرض الإنسان تطالب زيادة الحمض النووي ذات جودة عالية. وanticoagulated المصدر الأكثر شيوعا من الحمض النووي المستخدمة في الدراسات الوراثية الدم الكامل. لأن معظم المختبرات السريرية أداء اختبار الكيمياء الحيوية، ومصلية، والفيروسية كخطوة أولى في تحقيق نتائج المظهري، وغالبا ما تجمع الدم في أنبوب البلازما. بعد جمع البلازما، وكثيرا ما تجاهل الدم المضغوط. لذلك، عندما تكون هناك حاجة لإجراء دراسات الحمض النووي الوراثي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنابيب BD P100 | BD Diagnostics | 366448 | |
| أنابيب EDTA | BD Diagnostics | 367863 | |
| السكروز | Sigma | S9378 | |
| مشبك ورقي | منتج مكتبي | ||
| أنبوب سعة 15 ml | Corning | 430052 | |
| خلايا الدم الحمراء (RBC) | Qiagen | 158389 (طقم) | |
| المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| طقم BioSprint 96 لاستخلاص DNA من الدم (48) | Qiagen | 940054 | |
| أنابيب دقيقة سعة 1.7 ml | Axygen | MCT-175-C | |
| طقم Human Immuno DNA Analysis BeadChip | Illumina | WG-352-1001 | |
| قارئ مصفوفة الخرزات | Illumina | NA | |
| برنامج GenomeStudio | Illumina | N/A |
المراجع
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
