وصف هذه المقالة على الطريقة التي يمكن لأحد أن يقلد في الجسم الحي تطوير ذبابة الفاكهة هيئة فطر في خارج الحي نظام الثقافة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
السابقين التثقيف المجراة من الجامعة، تطوير الأمخاخ ذبابة الفاكهة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ونحن تصف طريقة لاستزراع الأحياء السابقين من أدمغة ذبابة الفاكهة بأكملها. ويمكن استخدام هذا بمثابة الطباق إلى التلاعب الوراثي المزمن عن التحقيق في بيولوجيا الخلايا، وتطوير الهياكل المركزية في المخ من خلال السماح التدخلات الدوائية الحادة والتصوير الحي من العمليات الخلوية. وقد أظهرت كمثال على هذه التقنية، والعمل من قبل مختبر لدينا (1) التي مقصورة غير المعترف بها من قبل التحت خلوية تقع بين حجرات محواري وsomatodendritic من محاور عصبية في الدماغ المركزي ذبابة الفاكهة. وقد تبين في تطوير هذه المقصورة، ويشار إلى هذا الجزء محور عصبي الأولي (AIS) 2، وراثيا تعتمد على كيناز الخلايا العصبية الخاصة التي تعتمد على cyclin، Cdk5. نعرض هنا أن السابقين معاملة المجراة من عقل ذبابة الفاكهة البرية من نوع اليرقات مع roscovitine Cdk5 محددة مثبطات الدوائية وolomoucine 3 يسبب تغيرات حادة في منظمة الأكتين، وفي توطين Fasciclin بروتين على سطح الخلية 2، والتي تحاكي التغيرات ينظر في المسوخ التي تفتقر Cdk5 نشاط وراثيا.
ويرد المثال الثاني من تقنية فيفو ثقافة السابقين لإعادة عرض للاتصالات من هيئة فطر الجنينية (MB) الخلايا العصبية جاما خلال التحول من يرقة إلى الكبار. هيئة فطر هي مركز التعلم والذاكرة الشمية في الذبابة 4، وهذه الخلايا العصبية غاما تقليم فروعها محواري وشجيري خلال تطوير العذراء ومن ثم إعادة تمديد فروع في timepoint في وقت لاحق لتأسيس نمط تعصيب الكبار 5. وقد تبين من تشذيب هذه الخلايا العصبية لجماعة الإخوان المسلمين أن يحدث عن طريق انحطاط المحلية لفروع neurite 6، من خلال الآلية التي يتم تشغيلها بواسطة إكديسون، وهو هرمون الستيرويد، ويتصرف بناء على مستقبلات إكديسون B1 7، والتي تعتمد على نشاط ubiquitin-proteasome نظام 6. يمكن أن أسلوبنا في زراعة المجراة سابقا باستخدام البريد لاستجواب مزيد من آلية إعادة عرض التنموية. وجدنا أن في الإعداد فيفو الثقافة السابق، الخلايا العصبية غاما من جماعة الإخوان المسلمين خصت عملية التقليم التنموية مع دورة الوقت مماثلة لتلك التي في الجسم الحي. كان من الضروري، مع ذلك، إلى الانتظار حتى 1.5 ساعة بعد تشكيل puparium قبل explanting النسيج حتى يتسنى للخلايا لارتكاب لا رجعة فيه إلى التحول؛ تشريح الحيوانات في بداية pupariation أدى إلى تحول ضئيلة أو معدومة في الثقافة. وهكذا، بعد إجراء التعديلات المناسبة، يمكن تطبيق ثقافة المجراة سابقا نهج لدراسة ديناميكية، فضلا عن الجوانب حالة مستقرة في علم الأحياء في الدماغ المركزي.
البروتوكول
أ. إعداد وسائل الإعلام
- تعد وسائل الإعلام كاملة بواسطة فلتر تعقيم شنايدر ذبابة الفاكهة وسائل الإعلام تستكمل مع مصل بقري جنيني 10٪ و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين عقار.
- وينبغي إعداد وسائل الاعلام في كل مرة جديدة. بدلا من ذلك، يمكن إذابة 1 قسامة جديدة من قبل وسائل الاعلام المجمدة قبل كل استعمال.
- قبل زراعة، إضافة 10 ميكروغرام / مل الانسولين و 2 ميكروغرام / مل إكديسون إلى وسائل الإعلام. وأعدت المخدرات كما أسهم المركز والمجمدة في aliquots الصغيرة. وكانت aliquots إذابة ليس معاد تجميد.
- ينبغي الحفاظ على جميع العاملين في حلول 25 درجة مئوية.
زراعة أدمغة اليرقات
1. اختيار وتشريح أدمغة اليرقات
- إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الاعلام لمدة 12 ملم Millicell إدراج ثقافة الخلية. سيتم وضع العقول في تشريح هذه الملاحق لتسهيل المناعية سهل.
- إضافة كمية صغيرة من وسائل الاعلام استعدادا لتشريح زجاج ووتش.
- يوالغناء ملعقة صغيرة، والتقاط تجول يرقات العمر الثالث ووضعها في كوب ووتش. (ونحن نفترض أن ثقافة المجراة سابقا طريقة وتنطبق كذلك على يرقات العمر الأول أو الثاني، لكننا لم نجرب هذا.)
- عقد نهاية الخلفي لليرقة مع زوج من ملقط، فتح بعناية حتى نهاية الأمامي مع زوج الثانية من # 5 ملقط.
- تشريح بسرعة خارج الدماغ، والحفاظ على حبل العصب بطني سليمة.
2. زراعة المجراة سابقا من الأمخاخ اليرقات مشرح
- نصائح باستخدام ماصة ما قبل الرطب، ونقل الدماغ بعناية في إدراج ثقافة الخلية، معبأة سلفا مع وسائل الاعلام.
- أدمغة نقل، في وسائل الإعلام، إلى حاضنة عند 25 درجة مئوية حتى وقت المطلوب نقطة يتم التوصل إليه. هذا الأسلوب يعمل بكفاءة لمدة تصل إلى 48 ساعة في الثقافة.
- تحل محل وسائل الإعلام في 8 ساعات. أبعد من ذلك، استبدال نصف وسائل الإعلام كل ساعة 5-6.
3. الدوائية من التلاعباليرقات الأمخاخ
ويمكن استخدام هذه الطريقة في زراعة المجراة سابقا على التعاطي مع التفاعلات الدوائية الجينية أثبتت سابقا في مختبرنا 1.
- إضافة 100 roscovitine ميكرومتر و 100 ميكرون olomoucine إلى وسائل الإعلام المعدة.
- نقل عقل تشريح لهذه الوسائط.
- ثقافة العقول عند 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- تحل محل وسائل الإعلام في 8 ساعات. أبعد من ذلك، استبدال نصف وسائل الإعلام (مع المخدرات) كل ساعة 5-6.
زراعة أدمغة العذارى
1. اختيار من شرانق لتشريح
- بمناسبة الشرانق البيضاء على قارورة / قنينة.
- اختيار فقط الشرانق التي هي بيضاء تماما. لا ينبغي أن الشرانق مع أي نوع من التلون إدراجها.
- هذه المرحلة هي 0 ساعات بعد تشكيل Puparium (APF).
- وهذه الشرانق تكون جاهزة للتشريح 1.5 ساعة بعد وضع العلامات. هذه خطوة حاسمة لضمان تقليم التنموية يحدث في الجسم الحي السابقين ثقافة.
2. تشريح من الشرانق
- إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الاعلام لمدة 12 ملم Millicell إدراج ثقافة الخلية. (سيتم وضع العقول في تشريح هذه الملاحق لتسهيل المناعية من السهل).
- مرة واحدة وقد تم التوصل في الوقت المطلوب نقطة، إضافة كمية صغيرة من وسائل الاعلام استعدادا لتشريح زجاج ووتش.
- باستخدام صغيرة، ملعقة الرطب، والتقاط الشرانق ملحوظ من قبل لتشريح ووضعها في كوب ووتش.
- عقد نهاية الخلفي من الشرانق مع زوج من ملقط، فتح بعناية نهاية الأمامي من حالة خادرة مع زوج الثانية من # 5 ملقط.
- تشريح بسرعة خارج الدماغ، والحفاظ على حبل العصب بطني سليمة والمرفقة.
3. التثقيف المجراة سابقا من الأمخاخ العذارى مشرح
- نقل الدماغ بعناية في إدراج ثقافة الخلية، معبأة سلفا مع وسائل الاعلام.
- أدمغة نقل، في وسائل الإعلام، إلى حاضنة عند 25 درجة مئوية حتى ف الوقت المطلوبتم التوصل oint. استخدمنا هذه الطريقة لمدة تصل إلى 10 ساعة في ثقافة للتجربة معروضة، ولكن يمكن تمديدها لفترات أطول من المراقبة والعلاج، إذا لزم الأمر.
- لوقت أطول من نقاط APF 8 ساعات، تحل محل وسائل الإعلام كل ساعة 5-6.
من هذه الخطوة على والبروتوكول لم يتغير بالنسبة لكل من اليرقات والعذارى.
ب. إصلاح الأمخاخ مشرح
- مرة واحدة يتم الوصول إلى المطلوب الوقت نقطة، وإزالة وسائل الاعلام وإضافة 500 ميكرولتر من الفورمالديهايد 4٪ في برنامج تلفزيوني 1X مع 0.5٪ تريتون X-100 (PBST) لمدة 30 دقيقة، ليحل محل مع الفورمالديهايد جديدة بعد 15 دقيقة.
- تأكد من عدم السماح للعقل لتجف في حين يحل محل وسائل الاعلام مع مثبت.
- يغسل الفورمالديهايد مع أربعة يغسل 10 دقيقة من برنامج تلفزيوني 1X مع 0.5٪ TritonX-100 (PBST).
جيم تلطيخ الأمخاخ ثابت
- بعد أن تم غسلها من الفورمالديهايد، منع العقول لمدة 1 ساعة في حل حجب PBS 1X مع 1٪ عاديمصل الماعز و 1٪ ألبومين المصل البقري.
- إضافة الأجسام المضادة الأولية تتكون في عرقلة الحل.
- احتضان العقول بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- في صباح اليوم التالي، يغسل الأجسام المضادة الأولية مع أربعة يغسل 10 دقيقة من PBST.
- إضافة الأجسام المضادة الثانوية تتكون في عرقلة الحل.
- ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات.
- يغسل الأجسام المضادة الثانوية مع أربع يغسل 10 دقيقة من PBST.
D. تركيب المخ الثابتة وملون للفحص المجهري
- تتوازن العقول في وسائل الاعلام Vectashield المتصاعد لمدة 1 ساعة.
- تركيب دماغ على الشرائح الزجاجية باستخدام وسائل الإعلام Vectashield المتصاعدة.
- وضع رقائق الزجاج على جانبي العقول قبل تركيب الغطاء زلة. وهذا ما يمنع من أن يكون العقل المدبر وممرود، مع الحفاظ على عينة رقيقة بما يكفي لمسح جميع الطائرات التنسيق مع المجهر متحد البؤر. وكانت العقول الموجهة نحو متزايد على تسهيل عرض ملامح من الفائدة. عند الضرورة،وكانت الصور الدماغ بالتناوب مع برنامج Imaris بتقديم رأي الأمثل للتوثيق وقياس.
- ختم تغطية زلات مع طلاء الأظافر واضح.
- مخزن ينزلق بعيدا عن الضوء.
هاء النتائج الممثل
ويوضح الشكل 1 لجنة من الطور الثالث من العقول يرقات الذباب البرية من نوع (أ) و (B). الذباب التي تعبر عن مشتق المهيمنة سلبية من Cdk5 (Cdk5DN) (كونيل، كراولي وآخرون، 2000) على حد سواء صريحة أكتين-GFP (الخضراء) في الخلايا العصبية غاما ميغابايت. كما هو موضح سابقا (Trunova وآخرون، 2011)، وهناك منطقة في محاور عصبية من الخلايا العصبية القريبة غاما من النوع البري الذي فشل في جمع أكتين-GFP، مما يدل على خط النار في "منطقة واضحة" (A، قوس)، و fasciclin 2 بروتين (الحمراء) يتراكم في محاور عصبية تصل فقط الى الحدود بطني من هذه المنطقة (خط أفقي أبيض). خط منقط في لوحة الثالث من الشكل 1 (أ) يدل على موقف جماعة الإخوان المسلمين، وتسليط الضوء على قانونفي "منطقة واضحة" وحدودها بطني. الذباب في التعبير عن Cdk5DN، منطقة الأكتين واضح غائب (B) وFasciclin 2 (FasII) تفاعلية مناعية ظهريا ينتشر من خلال تلك المنطقة. (لاحظ أن عدد متغير من مشروع محاور عصبية FasII إيجابية أفقيا عبر ميغابايت، وهذه ليست ذات صلة النمط الظاهري). شريط الحجم يمثل 20 ميكرون.
باستخدام طريقة لدينا من زراعة المجراة سابقا، نعامل البرية من نوع الذباب مع مزيج من roscovitine وolomoucine، مثبطات الدوائية من Cdk5 النشاط. ويبين الشكل 2 لجنة من الطور الثالث من العقول اليرقات من سيطرة (A) والمخدرات المعالجة (B ) البرية من نوع الذباب. تشبه الذباب تعبر عن السلبية السائدة Cdk5 بناء، العقل تعامل مع Cdk5 مثبطات لمدة 24 ساعة، وتبين فقدان المميزة لمنطقة الأكتين واضحة والتحول في حدود FasII (مربع بين قوسين). خطوط بيضاء إظهار موقف من حدود FasII من النوع البري. شريط الحجم يمثل 20 ميكرون.
فيقوإعادة 3 يعرض سلسلة ممثل الهيئات فطر ذبابة الفاكهة 0-10 ساعات APF، وصفت مع غشاء استهداف mCD8-GFP (الخضراء). بين قوسين تشير إلى الكأس، وهذا هو، التوقعات شجيري من جماعة الإخوان المسلمين. قبل التحول، ويمكن للمرء أن يرى المحاور ميغابايت التعقيب ظهراني البطني في حزم سميكة، فضلا عن "الضباب" للإشارة فلوري الناشئة عن شجرة شجيري كثيف (قوس). وأشارت لوحة أظهرت أدمغة تشريح في ذلك الوقت. لاحظ التقليم من التشعبات في المنطقة المشار إليها بواسطة الأقواس، ان مثل هذه من قبل 6-8 ساعات ذهابه APF، في ضباب من إشارة شجيري (على الرغم من إشارة محواري تتأثر). تم تشريح أدمغة في لوحة (ب) في APF ساعات و 0، وذلك قبل ارتفاع إكديسون الداخلية (ترومان وRiddiford، 2002)، والمجراة سابقا مثقف كما هو محدد. هذه لا تظهر أي تشذيب التنموية من التشعبات، بل إشارة شجيري استمرت 10 ساعة في APF. للتحايل على هذا، يتم وضع علامة الشرانق في APF ساعات و 0، ولكن تشريح في 1.5 ساعة APF والمثقفين. جزءل C يظهر سلسلة ممثل لهذه الهيئات فطر ذبابة الفاكهة من APF 0-10 ساعات. كما هو الحال في العينات غير مثقف، إشارة شجيري غير قابل للكشف من قبل قوات الشرطة المسلحة ساعة 8. شريط الحجم يمثل 20 ميكرون.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
التلاعب الوراثي المزمن في بنية الأنسجة وظيفة، بما في ذلك التحولات والتعبير عن الجينات المحورة، وعادة ما تنتج مجموعة من الآثار المباشرة وغير المباشرة في وقت متأخر العواقب التي يمكن أن يكون من الصعب جدا فصل. ويمكن استكمال الطرق الوراثية مع علم الصيدلة تسهيل استجواب من خلال الوقت وراء النمط الظاهري. على سبيل المثال، كانت هذه طريقة فعالة لتشريح مساهمات مكونات هيكل الخلية مختلفة خلال تكوين الحيوانات المنوية في ذبابة الفاكهة 10. في المثال الحالي، أتاح لنا لاظها...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نود أن نشكر جميع أعضاء مختبرنا لمناقشاتهم، وتقديم المشورة المفيدة والتعليقات على المخطوطة. ونحن أيضا نود أن نشكر بشكل خاص مارتا كوخ وحسن باسم لاقتراح ممتاز أن ننتظر حتى 1.5 ساعة APF قبل تشريح أدمغة للزراعة في إعادة عرض التجارب. كما نشكر مركز التصوير NHGRI لاستخدام مجهر متحد البؤر بهم. وأيد هذا العمل من قبل برنامج العلوم العصبية الأساسية لبرنامج بحوث ضمن الجدران NINDS، المعاهد الوطنية للصحة (Z01 NS003106).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم الكاشف | شركة | فهرس العدد | نهائي تركيز |
| شنايدر ذبابة الفاكهة وسائل الإعلام | إينفيتروجن | 21720-024 | |
| الأبقار مصل الجنين (حرارة المعطل) | إينفيتروجن | 10082-147 | 10٪ |
| البنسلين / الستربتومايسين عقار | إينفيتروجن | 15140-122 | 1٪ |
| الانسولين | إينفيتروجن | 12585-014 | 10μg/ml |
| إكديسون | سيغما الدريخ | H5142 | 2μg/ml |
| Roscovitine | سيغما الدريخ | R7772 | 100μM |
| Olomoucine | سيغما الدريخ | O0886 | 100μM |
| طبيعي عنزة المصل | إينفيتروجن | 50062Z | 1٪ |
| ألبومين المصل البقري | فيشر العلمية | M9501 | 1٪ |
| الفورمالديهايد | سيغما الدريخ | D4551 | 4٪ |
| تريتون-X 100 | فيشر العلمية | BP151 | 0.5٪ |
| التخزين المؤقت فوسفات المالحة | إينفيتروجن | 70011-044 | 1X |
| Vectashield | ناقلات مختبرات | H1000 | |
| إدراجات Millicell خلية الثقافة | ميليبور | PI8P01250 | |
| Multidish، 4 جيد | الحرارية العلمية | 176740 | |
| دومون # 5 الملقط | أدوات العلم غرامة | 11251-20 | |
| مجهر الشرائح | فيشر العلمية | 12-544-7 | |
| تغطية زجاج | فيشر العلمية | 12-548-5M |
المراجع
- Trunova, S., Baek, B., Giniger, E. Cdk5 regulates the size of an axon initial segment-like compartment in mushroom body neurons of the Drosophila central brain. J. Neurosci. 31 (29), 10451-10462 (2011).
- Nakada, C., et al. Accumulation of anchored proteins forms membrane diffusion barriers during neuronal polarization. Nat. Cell Biol. 5 (7), 626-632 (2003).
- Schmid, G., Strosznajder, J. B., Wesierska-Gadek, J. Interplay between the p53 tumor suppressor protein family and Cdk5: novel therapeutic approaches for the treatment of neurodegenerative disease using selective Cdk inhibitors. Mol Neurobiol. 34 (1), 27-50 (2006).
- Kahsai, L., Zars, T. Learning and memory in Drosophila: behavior, genetics, and neural system. Int. Rev. Neurobiol. 99, 139-167 (2011).
- Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126, 4065-4076 (1999).
- Watts, R. J., Hoopfer, E. D., Luo, L. Axon pruning during Drosophila metamorphosis: evidence for local degeneration and requirement of the ubiquitin-proteasome system. Neuron. 38 (6), 871-885 (2003).
- Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
- Connell-Crowley, L., Le Gall, M., Vo, D. J., Giniger, E. The cyclin-dependent kinase Cdk5 controls multiple aspects of axon patterning in vivo. Curr. Biol. 10 (10), 599-602 (2000).
- Truman, J. W., Riddiford, L. M. Endocrine insights into the evolution of metamorphosis in insects. Annu. Rev. Entomol. 47, 467-500 (2002).
- Noguchi, T., Miller, K. G. A role for actin dynamics in individualization during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Development. 130, 1805-1816 (2003).
- Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control. Mol. Biol. Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).
- Brown, H. L. D., Cherbas, L., Cherbas, P., Truman, J. W. Use of time-lapse imaging and dominant negative receptors to dissect the steroid receptor control of neuronal remodeling in Drosophila. Development. 133, 275-288 (2006).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
