مقالة منهجية

الجيل الركيزة لEndonucleases من CRISPR / كاس أنظمة

28.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/4277

⸱

سبتمبر 8, 2012

 ,  ,  ,  , 
1Prokaryotic Small RNA Biology, Max-Planck-Institute for Terrestrial Microbiology

في هذه المقالة

ملخص

CRISPR / كاس أنظمة المناعة التكيفية التوسط في البكتيريا والعتيقة. ويقترح العديد من البروتينات لتكون بمثابة كاس endoribonucleases تعمل على السلائف crRNA ذات أطوال متباينة. نحن هنا توضيح ثلاثة أساليب مختلفة لتوليد ما قبل crRNA ركائز لتحليل كيميائي حيوي من النشاط نوكلياز داخلية كاس.

الملخص

تفاعل الفيروسات والمضيفين على شكل بروكاريوتيك تطور الحياة الجرثومية وarchaeal. بدائيات النوى وضعت عدة استراتيجيات لتجنب الهجمات الفيروسية التي تشمل تقييد التعديل، والعدوى فاشلة ونظم CRISPR / كاس. هذه النظم على التكيف المناعي وجدت في العديد من أنواع البكتيريا ومعظم الأركيا تتكون من ج ص مصقول egularly ط ق هورت nterspaced ص ص alindromic EPEAT (CRISPR) تسلسل وعدد من الجينات كما RISPR C (CAS) sociated (الشكل 1) 1-3. مجموعات مختلفة من البروتينات استراتيجية المساعدة القطرية ويكرر تحديد ما لا يقل عن ثلاثة أنواع متباينة من CRISPR الرئيسية / كاس نظم 4. ويقترح البروتينات العالمية Cas1 وCas2 أن تشارك في امتصاص DNA فيروسيسيتم إنشاء عنصر جديد التبادل بين اثنين في محطة يكرر 5 'من كتلة CRISPR تمتد 5. وكتب الكتلة بأكملها إلى crRNA-السلائف يحتوي على جميع متواليات التبادل وتكرار وتتم معالجتها لاحقا من قبل انزيم من عائلة متنوعة Cas6 إلى أصغر crRNAs 6-8. هذه crRNAs تتكون من تسلسل التبادل يحيط بها 'محطة (8 النيوكليوتيدات) و3' لمدة 5 العلامة النهائية المستمدة من تكرار تسلسل 9. ويمكن الآن للعدوى المتكررة من الفيروس يكون قد تم حظره كما سيتم توجيه crRNA جديدة من مجمع البروتين CAS (تتالي) إلى الحمض النووي الفيروسي والتعرف عليه على هذا النحو من خلال التكامل الأساس 10. وأخيرا، لCRISPR / كاس أنظمة من النوع 1، فإن Cas3 نوكلياز تدمير الغازي الكشف عن الحمض النووي 11،12.

هذه العمليات تحديد CRISPR / كاس نظام المناعة والتكيف بدائيات النوى وفتح مجال البحوث رائعة لدراسة البروتينات كاس المعنية.وظيفة البروتينات كاس العديد من لا يزال بعيد المنال، والأسباب واضحة للتنوع أنظمة CRISPR / كاس يزال يتعين مضيئة. وتوقع الأنشطة المحتملة من البروتينات معظم التحليلات الحسابية عن طريق كاس تفصيلا. وتظهر إما جزءا كبيرا من البروتينات أو المقترحة لكاس تعمل كما endonucleases 4.

هنا، نقدم طرق لتوليد crRNAs والسلائف cRNAs من أجل دراسة endoribonucleases كاس. المقايسات نوكلياز داخلية مختلفة تتطلب تكرار متواليات قصيرة إما مباشرة يمكن أن توليفها كما أليغنوكليوتيد] RNA أو تسلسل أطول crRNA وقبل crRNA-التي يتم إنشاؤها عن طريق البلمرة في المختبر RNA T7 جولة الاعادة النسخ. هذه المنهجية يسمح إدماج من النيوكليوتيدات المشعة لتوليد ركائز نوكلياز داخلية المسمى داخليا وإنشاء crRNAs تركيبية أو متحولة. ويستخدم Cas6 النشاط نوكلياز داخلية لتنضج قبل crRNAs في crRNAs مع 5'-HYDRoxyl و '2، تيرميني الفوسفات 3'-دوري.

البروتوكول

1. جيل من ركائز قبل crRNA طويل المدى عبر PCR

  1. تصميم الاشعال PCR استهداف المناطق التبادل من مجموعة CRISPR. إضافة بوليميراز RNA T7 (T7RNAP) تسلسل المروج (5 '-taatacgactcactata-3 ") إلى الأمام ومواقع التمهيدي لتقييد المنتج PCR الاستنساخ في ناقلات على حد سواء الاشعال (مثل BamHI والثالث للهند pUC19، الشكل. 2A) .
    ملاحظة: يتطلب T7RNAP بقايا الجوانيدين لبدء النسخ السليم لل.
  2. تضخيم الخاص بك قبل crRNA تسلسل الحمض النووي الجيني الاهتمام من قبل PCR.
  3. فصل المنتجات PCR بواسطة الكهربائي للهلام الاغاروز جل واستخراج الفرقة المطلوب. هضم المنتجات PCR مع الانزيمات التقييد لإنشاء نهايات لزجة (مثل BamHI وHindIII، الشكل. 2A). تنقية المنتج PCR مع مجموعة تنقية PCR للقضاء على الانقسام والمنتجات.
  4. إنشاء رد فعل الذي يحتوي ربط T4 يغاز DNA، T4 العازلة يغاز DNA ونسبة 03:01 المولي للمنتج PCR المشقوق وتقوم تقنية dephosphorylated ناقلات الخطية مع نهايات لزجة ذات الصلة. احتضان الخليط في 16 ° C بين عشية وضحاها. تحويل الخليط إلى ربط الخلايا المختصة القولونية DH5α بواسطة بروتوكولات القياسية واستخدام الفحص الأبيض الأزرق لتحديد ربط ناجحة.
  5. عزل البلازميدات من المستعمرات الأبيض باستخدام إعداد ملف البلازميد. تحديد التسلسل استنساخ الإيجابية التي بلازميد. وبدلا من ذلك، يمكن استخدام PCR مستعمرة لفرزها.

2. جيل من المتوسط ​​قبل crRNA ركائز الصلب عن طريق الحمض النووي من أليغنوكليوتيد]

  1. تصميم الأمام وعكس أليغنوكليوتيد] مع تكرار تسلسل المطلوب / CRISPR التبادل. وأليغنوكليوتيد] تحتوي على تسلسل مروج RNAP T7 فضلا عن تقييد مواقع الطرفي (مثل BamHI والثالث للهند pUC19). إنهاء أليغنوكليوتيد] لضمان أن ينتهي شكل لزجة بعد الصلب (انظر الشكل 2B ).
  2. 5'-1 الفوسفات نانومول لكل قليل النوكليوتيد في رد فعل منفصل 20μl تحتوي على 5 ميكرولتر من كيناز عديد النوكليوتيد T4 (PNK)، 2 ميكرولتر من العازلة 10X PNK T4، 2 ميكرولتر ATP (10 ملم). احتضان كل عينة لمدة 1 ساعة عند 37 ° C.
  3. هجن في أليغنوكليوتيد] 2 فسفرته. الجمع بين 1μl من الخليط بنسبة ضئيلة إلى الأمام فسفرته (من 2.2.)، 1 ميكرولتر من خليط بنسبة ضئيلة عكس فسفرته (من 2.2.)، 1 ميكرولتر من العازلة T4 DNA يغاز 10X في رد فعل 10 ميكرولتر. احتضان العينات لمدة 5 دقائق في 95 ° C على كتلة التدفئة أو في الماء المغلي، إيقاف مصدر الحرارة، والسماح للخليط يبرد إلى درجة حرارة الغرفة (~ 2-3 ساعات).
    ملاحظة: في هذه الخطوة الهامة، عملية التبريد البطيئة تفضل الصلب من أليغنوكليوتيد] 2 بالمقارنة مع تشكيل هياكل داخل كل واحد قليل النوكليوتيد.
  4. Ligate 4 ميكرولتر من مزيج التهجين، 1μl من ناقلات تقوم تقنية هضمها وdephosphorylated (0.1 ميكروغرام /ميكرولتر) مع يغاز DNA T4، T4 العازلة 10X يغاز DNA و 10 ملي ATP في خليط ربط 20 ميكرولتر. احتضان العينة في 16 درجة مئوية خلال الليل.
  5. تحويل البلازميدات ligated في الخلايا المختصة القولونية DH5α بواسطة بروتوكولات القياسية والاستفادة من الفحص بيضاء اللون الأزرق. عزل البلازميدات وتحديد استنساخ إيجابية من قبل الهضم (للكشف عن إدراج من الحجم المطلوب) والتسلسل البلازميد اللاحقة.

3. جيل من ركائز قصيرة عبر RNA كاس العرف التوليف قليل النوكليوتيد RNA

تصميم كاس قصيرة RNA ركائز (مثل تكرار تسلسل واحد، الشكل 2C) والاستفادة من مرافق مخصصة التوليف قليل النوكليوتيد RNA.

ملاحظة: يمكن استخدام إدراج ديوكسي ريبونوكليوتيد في الموضع المحدد من قليل النوكليوتيد RNA (الشكل 2C) لتحديد موقع من الانقسام RNA.

4. في المختبر T7 النسخ RNA بوليميراز

  1. عزل البلازميدات مع بناء الخاصة بك تصميم (من 1.9. أو 2.7.) باستخدام مجموعة maxiprep تنقية البلازميد.
  2. خطي البلازميد مع انزيم تقييد أن يشق المصب جزء مستنسخ (مثل HindIII). ضمان الهضم الكامل.
    ملاحظة: إذا كان المطلوب محطة لمدة 3 متباينة تعريف 'من محضر RNA، وينبغي أن يتضمن تصميم بناء إضافية محددة لتقييد موقع النسخ "جولة الاعادة" المنبع من تسلسل HindIII.
  3. تنقية البلازميد خطي من الفينول: كلوروفورم استخراج (1:1) وهطول الأمطار الإيثانول. استرداد الأحماض النووية من resuspending بيليه في المياه المعالجة العقيمة DEPC.
  4. إنشاء المختبر في T7 RNAP الاعادة خليط النسخ التي تحتوي على 40 ملي Hepes / KOH (الرقم الهيدروجيني 8)، 22 ملم MgCl 2 و 5 dithiothreitol مم، 1 مم سبيرمدين، 4 مم لكل ثلاثي الفوسفات نوكليوزيد (ATP، CTP، GTP، UTP )، 40-100 ميكروغرام / مل من هضمهاالبلازميد و 0.1 ملغ / مل في الماء T7 RNAP DEPC المعالجة. احتضان لمدة 3 ساعات في 37 ° C.
  5. تحليل النصوص الحصول على هلام RNA يبدل طبيعة 8 M اليوريا 12٪ بولكرلميد (الشكل 3A). يمكن تنقيته من النصوص RNA عن طريق تبادل أنيون أحادي س اللوني 13 و تعافى من الهطول الإيثانول من الكسور وإعادة تعليق RNA من بيليه في الماء المعقم DEPC المعالجة. لاستخدامها في المستقبل، تخزين RNA في -80 ° C.

5. Cas6 نوكلياز داخلية مقايسة

  1. إنشاء 20 ميكرولتر T7 RNAP في المختبر خليط من تشغيل النسخ (انظر 4.4) الذي يحتوي على المبلغ المخفض من ATP مم 2 ويتم استكمال مع 2.5 ميكرولتر α-[32 P]-ATP (10 ميلي كوري / مل، 5000 تسى / ملمول). تنقية منتجات التفاعل عبر استخراج جل من اليوريا يبدل طبيعة M 8 هلام بولكرلميد 12٪. تصور من قبل عصابات تصوير الإشعاع الذاتي.
  2. إنتاج وتنقية البروتينات المؤتلف المطلوب كاس. في هذا المثال، Cوتنقيته من as6 thermocellum المطثية عبر هطول الأمطار والحرارة ني NTA اللوني.
  3. إعداد مقايسة رد فعل نوكلياز داخلية (مثل كلوستريديوم thermocellum Cas6، خليط التفاعل تحتوي على 20 ملي Hepes (KOH pH8)، 250 مم بوكل، 2 ملم MgCl 2، 1 ملم DTT، 12،000 نسخة في الدقيقة الركيزة RNA و 1 ميكرومتر انزيم وحضنت في 37 ° C لمدة 30 دقيقة).
  4. تحميل 5 ميكرولتر من خليط التفاعل (+ 10 ميكرولتر العازلة RNA التحميل التي تحتوي على 95٪ الفورماميد) على اليوريا M 8 هلام بولكرلميد 12٪. تصور المنتجات الانقسام بعد الكهربائي من تصوير الإشعاع الذاتي.

6. ممثل النتائج

ويرد مثال على ركائز RNA لتحليل النشاط نوكلياز داخلية في كاس 3A الشكل. تم تحميل وقسامة من 5 ميكرولتر من 100 ميكرولتر التحليلية في رد فعل النسخ المختبر. يرجى ملاحظة أن كفاءة الإنتاج RNA يتراوح بين بنيات مختلفة. بعض العوامل روقد لوحظت قبعة للتأثير على كمية من الحمض النووي الريبي التي تم الحصول عليها هي (ط) التسلسل الأولي بعد G +1 اللازمة لبدء النسخ، (الثاني) إمكانية تشكيل هيكل RNA خلال النسخ و(الثالث) اختيار الموقع تقييد للجيل للموقف الانقسام جولة الاعادة.

التحقيق في النشاط نوكلياز داخلية RNA يتطلب عالي النقاء المؤتلف كاس البروتينات (الشكل 3B) والضوابط السلبية المناسبة. ومن الناحية المثالية، هذه العينة المراقبة السلبية يختلف أقل قدر ممكن من رد الفعل التحقيق نوكلياز داخلية كاس. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق حضانة RNA مع العازلة رد فعل الخلية والمحللة من دون التعبير CAS (وبعد إجراء تنقية متطابقة). عنصر تحكم مثالي السلبية هو إضافة ديوكسي ريبونوكليوتيد في موقع الانقسام المقترحة. في الشكل 3C، يظهر الانقسام من سلسلة المحطة رقم 5 'تكرار مرقوم للthermocellum المطثية Cas6. تحت ظروف مماثلة، وهذا تكرار ليست الركيزة بعد الآن عندما تنشأ ديوكسي ريبونوكليوتيد في موقف -9. هذا الأسلوب يوفر أيضا معلومات عن الموقع الانقسام. وأخيرا، هو المشقوق وصفت داخليا طويلة قبل crRNA من Cas6 ويلاحظ شظايا الانقسام اثنين.

figure-protocol-1
نظرة عامة على الرقم التخطيطي 1. من CRISPR / كاس النشاط. نظرة عامة يلي إدراج تسلسل الحمض النووي الفيروسي (protospacer) في الكتلة CRISPR (التكيف)، والنسخ وتجهيز مجموعة CRISPR في crRNAs الصغيرة من قبل نوكلياز داخلية Cas6، وامتصاص crRNAs في مجمع تتالي وتدخل على تكرار الهجوم الفيروسي على أساس التكامل بين crRNA وprotospacer. زخارف Protospacer المجاورة (PAM) تسلسل علامة protospacer الفيروسية.

igure 2 "SRC =" / files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg "/>
الشكل 2. الجيل من ركائز RNA البروتينات لكاس. مخطط يبين سير العمل لتوليد (A) لفترة طويلة قبل crRNA ركائز، (B) وسيطة قبل crRNA ركائز و (C) RNA قصيرة كاس ركائز لمرحلة ما قبل الإنتاج crRNA. يتم عرض تسلسل سبيل المثال لمجموعة من CRISPR thermocellum المطثية. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

figure-protocol-2
الشكل 3. Cas6 مقايسة نوكلياز داخلية. A.) هلام بولكرلميد زرقة الطولويدين الملون من قليل النوكليوتيد RNA مصمم خصيصا (250 بمول) واثنين في المختبر RNA النصوص (5 ميكرولتر من رد فعل نموذجي 100 ميكرولتر). B.) SDS-PAGE هلام لإعداد Cas6 (80 بمول) من المطثية بعد thermocellum الحرارةهطول الأمطار في 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة و ني NTA اللوني. C.) الكشف عن النشاط Cas6 endonucleolytic لمحطة 5 'تسلسل تكرار وصفت وقبل crRNA في محاضر المختبر. الأخذ في موقف dNTP -9 تلغي الانقسام Cas6 لركيزة قصيرة RNA CAS (S، الشكل. 2C). كما يتم إنشاء A 5 'علامة محطة NT 8 لنضوج crRNA من ركائز قبل crRNA طويلة (L، الشكل 2A). تم فصل العصابات على تغيير طبيعة اليوريا M 8 هلام بولكرلميد 12٪ من تصور وتصوير الإشعاع الذاتي.

المناقشة

الأساليب قدم تمكين الجيل من ركائز نوكلياز داخلية كاس يتراوح حجم مختلفة وبدرجات حرية في تصميم التسلسل. ويقتصر النهج الأكثر مباشرة إلى الأمام لتوليد الاصطناعية ركائز قليل النوكليوتيد RNA RNA لتصاميم قصيرة بسبب زيادة التكاليف والقيود التقنية في خلق أطول oligomers RNA. في حين تم الإبلاغ عن نجاح RNA RNA تجميعي للoligomers معدلة أكثر من طول النيوكليوتيدات 100، الحد الأقصى عمليا واقتصاديا لتخليق RNA مخصص تقع أقل من 40 النيوكليوتيدات. ومع ذلك، يمكن توليفها أي تسلسل معين، ويمكن استخدامها في مقدمة المستهدفة من النيوكليوتيدات تعديل (على سبيل المثال ريبوزية) لتحليل المواقع الانقسام بالتفصيل. يجب أن يكون إنشاء أطول قبل cRNAs عبر النسخ في المختبر.

والصلب من أليغنوكليوتيد] التي تحتوي على الحمض النووي الريبي بوليميراز T7 المروج يسمح لإنتاج طول وسيطة قبل crRNكما. الحد الأقصى لطول بشكل روتيني واقتصاديا أليغنوكليوتيد] DNA هو مجرد تجميع فوق 150 النيوكليوتيدات ويمثل الحد الأقصى لcrRNAs الاصطناعية قبل عبر هذه الطريقة. يمكن للجمعية العديد من صلب قليل النوكليوتيد أزواج DNA التي تشكل نهايات لزجة مع بعضها البعض تمديد هذه المدة القصوى لكن يتطلب التحديات المتزايدة في الاستنساخ للبناء. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هو القدرة على توليد ما قبل crRNA بنيات (وبالتالي كاس نوكلياز داخلية ركائز) مع أي تسلسل المطلوب. وهذا يسمح للاختبار تصاميم crRNA الاصطناعية.

وأخيرا، يمكن الحصول على أكبر ما قبل crRNAs من amplificates PCR من كامل العناصر الجينية CRISPR أو جزيئاتها. ويمكن إدخال تعديلات على قالب النسخ في المختبر عن طريق الطفرات البلازميد في الموقع موجهة للجيل السابق للcrRNA المتغيرات. ويمكن استخدام هذه التركيبات لتحليل نمط العالمية انشقاق داخل endonucleolytic كاملقبل crRNA.

واستند عمل رائدة لإنتاج RNA بوليميراز RNA معدلة عبر T7 في النسخ المختبر على نقل الرناوات 14 و RNA فيروس فسيفساء بروم 15. بوليميراز RNA توافق T7 المروج يتكون من مجال الاعتراف (-17 من خلال -5) والشروع مجال (-4 من خلال +6) مع بدء النسخ في لغوانوزين الأساسية +1 16. يمكن أن تختلف المواقف من المصب +1 الذي يسمح للنسخ من ما يقرب من أي تسلسل الحمض النووي الريبي المطلوب. الأساليب قدمت لتوليد المختبر في قوالب النسخ جولة الاعادة تسمح لفي تركيب المختبر من قبل كاملة crRNAs التي تطابق المناطق CRISPR الجيني أو الاصطناعية المتغيرات قبل crRNA. يتم إنشاء النسخ الحالية مع ثلاثي الفوسفات 5'-محطة ما لم يتم معبي رد فعل النسخ مع GMP للحصول على الأدينوزين 5 'تيرميني 14. ويلزم مصطلحات من هذا القبيل إذا النصوص أن يكون المسمىمع كيناز عديد النوكليوتيد T4-γ و[32 P].-ATP النشاط الانقسام من Cas6 والإنزيمات مثل Cas6 يولد crRNA التي تحتوي على 5'-الهيدروكسيل و '2، تيرميني الفوسفات 3'-دوري. ويمكن بعد هذه الرناوات يتم تحليلها لاعتراف المجمع تتالي.

الإفصاحات

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أود أن أشكر جانيت Schermuly لإعداد المؤتلف بوليميراز RNA T7 ونورمان Ebelt للمساعدة في إعداد الشكل 1. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل أموال من جمعية الألمانية للبحوث (DFG FOR1680) وماكس بلانك.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم كاشف شركة كتالوج رقم التعليقات (اختياري)
الفوسفاتيز القطب الجنوبي NEB M0289L
في المختبر Triphosphates التدوين النقاوة الصف النكليوتيد العلوم البيولوجية جينا NU-1010 - NU-1013
السائل اللوني، ktapurifier 100 GE للرعاية الصحية
DNA أليغنوكليوتيد] MWG OPERON
[أليغنوكليوتيد] RNA MWG OPERON
هلام استخراج كيت QIAGEN 28704
PCR تنقية كيت QIAGEN 28104
تدور Miniprep كيت QIAGEN 27106
بلازميد ماكسي كيت QIAGEN 12163
BamHI NEB R0136L
HindIII NEB R0104L
T4 DNA يغاز NEB M0202S
T4 عديد النوكليوتيد كيناز Ambion AM2310
T7 بوليميريز RNA إعداد الخاصة
Deoxynucleotide الحل ميكس NEB N0447L
ميني متلون نظام تيترا الكهربائي بيو راد 165-8001
العاصفة 840 ماسح GE للرعاية الصحية 163723
تخزين Phosphorscreen الجزيئية حيوية 63-0034-81
أحادية س 5/50 GL GE للرعاية الصحية 17-5166-01
Phusion البلمرة DNA عالية الدقة NEB M0530L استخدام المخزن المؤقت GC
زرقة الطولويدين سيجما T3260
pUC19 NEB N3041S
γ-[32 P]-ATP، α-[32 P]-ATP هارتمان تحليلية SRP-401، SRP-307

المراجع

  1. Barrangou, R. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science. 315, 1709-1712 (2007).
  2. Makarova, K. S., Grishin, N. V., Shabalina, S. A., Wolf, Y. I., Koonin, E. V. A putative RNA-interference-based immune system in prokaryotes: computational analysis of the predicted enzymatic machinery, functional analogies with eukaryotic RNAi, and hypothetical mechanisms of action. Biol. Direct. 1, 7(2006).
  3. Lillestøl, R. K., Redder, P., Garrett, R. A., Brugger, K. A putative viral defence mechanism in archaeal cells. Archaea. 2, 59-72 (2006).
  4. Makarova, K. S. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat. Rev. Microbiol. 9, 467-477 (2011).
  5. Brouns, S. J. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes. Science. 321, 960-964 (2008).
  6. Carte, J., Pfister, N. T., Compton, M. M., Terns, R. M., Terns, M. P. Binding and cleavage of CRISPR RNA by Cas6. RNA. 16, 2181-2188 (2010).
  7. Haurwitz, R. E., Jinek, M., Wiedenheft, B., Zhou, K., Doudna, J. A. Sequence- and structure-specific RNA processing by a CRISPR endonuclease. Science. 329, 1355-1358 (2010).
  8. Gesner, E. M., Schellenberg, M. J., Garside, E. L., George, M. M., Macmillan, A. M. Recognition and maturation of effector RNAs in a CRISPR interference pathway. Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 688-692 (2011).
  9. Carte, J., Wang, R., Li, H., Terns, R. M., Terns, M. P. Cas6 is an endoribonuclease that generates guide RNAs for invader defense in prokaryotes. Genes Dev. 22, 3489-3496 (2008).
  10. Wiedenheft, B. Structures of the RNA-guided surveillance complex from a bacterial immune system. Nature. 477, 486-489 (2011).
  11. Garneau, J. E. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468, 67-71 (2010).
  12. Sinkunas, T. Cas3 is a single-stranded DNA nuclease and ATP-dependent helicase in the CRISPR/Cas immune system. EMBO J. 30, 1335-1342 (2011).
  13. Jahn, M. J., Jahn, D., Kumar, A. M., Söll, D. Mono Q chromatography permits recycling of DNA template and purification of RNA transcripts after T7 RNA polymerase reaction. Nucleic Acids Res. 19, 2786-2787 (1991).
  14. Sampson, J. R., Uhlenbeck, O. C. Biochemical and physical characterization of an unmodified yeast phenylalanine transfer RNA transcribed in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 1033-1037 (1988).
  15. Dreher, T. W., Bujarski, J. J., Hall, T. C. Mutant viral RNAs synthesized in vitro show altered aminoacylation and replicase template activities. Nature. 311, 171-175 (1984).
  16. McGinness, K. E., Joyce, G. F. Substitution of ribonucleotides in the T7 RNA polymerase promoter element. J. Biol. Chem. 277, 2987-2991 (2002).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Cas6 T7

مقالات ذات صلة