مقالة منهجية

كشف البكتيرية والاستدلال باستخدام مجسات الكهروكيميائية

DOI:

10.3791/4282

⸱

أبريل 23, 2013

 ,  ,  , 
1Research Service, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Department of Urology, The David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles , 3GeneFluidics, 4Division of Infectious Diseases, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 5Department of Microbiology, Immunology & Molecular Genetics, University of California, Los Angeles

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف طريقة الكهروكيميائية فحص جهاز استشعار للكشف عن بكتيريا السريع وتحديد الهوية. الفحص ينطوي على مجموعة أجهزة الاستشعار functionalized مع الحمض النووي قليل النوكليوتيد تحقيقات لالتقاط الريباسي الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي) تسلسل أنواع محددة. تهجين شطيرة من الريباسي الهدف مع التحقيق القبض على والفجل البيروكسيداز المرتبطة الحمض النووي للكشف عن قليل النوكليوتيد التحقيق تنتج تيارا تجاه المؤثرات الخارجية قابلة للقياس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتستخدم أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية على نطاق واسع لقياس سريع ودقيق من السكر في الدم ويمكن تكييفها للكشف عن مجموعة واسعة من التحاليل. أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية تعمل عن طريق transducing حدثا الاعتراف البيولوجية إلى إشارة كهربائية مفيدة. يحدث نقل الإشارة من قبل اقتران نشاط انزيم الأكسدة والاختزال إلى القطب تجاه المؤثرات الخارجية. خصوصية استشعار إما سمة ملازمة للانزيم، أوكسيديز الجلوكوز في حالة وجود جهاز استشعار الجلوكوز، أو منتج من الربط بين الانزيم والأجسام المضادة أو التحقيق.

هنا، نحن تصف طريقة فحص الاستشعار الكهروكيميائية للكشف عن مباشرة وتحديد البكتيريا. في كل حال، فإن تحقيقات الموصوفة هنا [أليغنوكليوتيد الحمض النووي. ويستند هذا الأسلوب على تهجين شطيرة من التقاط وكشف عن تحقيقات مع الهدف الريباسي الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي). ويرتكز هذا التحقيق القبض على السطح الاستشعار، في حين يرتبط كشف التحقيق إلى Horseradish البيروكسيديز (HRP). عندما يتم إضافة الركيزة مثل 3،3 '، 5،5'-tetramethylbenzidine (TMB) إلى القطب مع التقاط المستهدفة كاشف المجمعات بد أن سطحه، يتأكسد الركيزة التي كتبها HRP وتخفيضها من قبل القطب العمل. هذه النتائج دورة الأكسدة والاختزال في رحلات مكوكية من الإلكترونات من قبل الركيزة من القطب إلى HRP، وتنتج تدفق التيار في القطب.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام الريباسي كما الجزيء المستهدف للكشف عن البكتيريا وتحديد لديها عدد من المزايا. وفرة من الريباسي في الخلايا البكتيرية ينص على حد حساسية منخفضة تصل إلى 250 بكتيريا في المليلتر من دون الحاجة إلى الهدف التضخيم 1. الريباسي البكتيرية يحتوي على تسلسل أنواع محددة الفريدة التي هي في متناول التهجين مع تحقيقات الحمض النووي. وبناء على ذلك، مجموعة من أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية يمكن استخدامها لتحديد البكتيريا غير معروف، حيث يتم functionalized كل أجهزة الاستشعار مع لجنة التحقيق القبض على أنواع محددة مختلفة. وينبغي أن تدرج أجهزة استشعار مراقبة إيجابية للوصول إلى هدف قليل النوكليوتيد الاصطناعية ان "الجسور" التقاط وكشف عن تحقيقات لإنشاء إشارة المعايرة الداخلية.

أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية لديها مجموعة واسعة من التطبيقات البحوث الأساسية ومتعدية. على سبيل المثال، ومقايسة الموصوفة هنا قد استخدمت لقياس بدقة تأثير E. مرحلة النمو القولونية على RRNA والأرقام نسخة ما قبل الريباسي، الذي هو من مصلحة كبيرة للباحثين المهتمين في علم وظائف الأعضاء 2 البكتيرية. يتم تحديد حساسية الفحص الاستشعار الكهروكيميائية بواسطة إشارة إلى نسبة الضوضاء. تم استكشاف مجموعة متنوعة من تضخيم الإشارات وطرق الحد من الضوضاء. نجد أن تحسين كيمياء سطح جهاز الاستشعار هو المفتاح لخفض ملزم غير محدد من كشف التحقيق و / أو إنزيم HRP. على وجه الخصوص، وقد وجد أحادي الطبقة مختلطة من alkanedithiols وmercaptohexanol للحد من الخلفية التي تغطي سطح القطب أكثر تماما مع الحفاظ على سهولة الوصول للمسبار لالتقاط الهدف التهجين 3. هذه العلاجات الكيمياء السطحية لها أهمية خاصة لفحوصات تشمل عينات بيولوجية معقدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Functionalization من مجسات الكهروكيميائية

  1. إعداد لجنة التحقيق التقاط thiolated بتركيز 0.05 ميكرومتر في 300 ميكرومتر 1،6-hexanedithiol (HDT)، و 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 0.3 M كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA واحتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة . حضانة لجنة التحقيق التقاط thiolated مع HDT يضمن أن يتم تقليل مجموعة ثيول على لجنة التحقيق لقطة، مما أدى إلى نتائج أكثر اتساقا.
  2. تطبيق تيار من النيتروجين إلى عارية الذهب 16 رقاقة الاستشعار مجموعة (ق) لمدة 5 ثوانى لإزالة الرطوبة و / أو الجسيمات.
  3. تطبيق 6 ميكرولتر من HDT-thiolated التقاط هذا المزيج مسبار إلى القطب عمل جميع أجهزة الاستشعار 16 من مجموعة أجهزة الاستشعار وتخزين رقاقة الاستشعار (ق) في طبق بيتري المغطاة في 4 درجات مئوية خلال الليل. تحقيقات التقاط Thiolated ربط مباشرة إلى القطب الذهب العارية وHDT يعمل على منع overpacking للتحقيقات القبض والاحتفاظ بها في التشكل الموسعة التي تروج التهجين مع الهدف.
  4. البعد يوم، وغسل رقاقة الاستشعار مع منزوع الأيونات H 2 O لمدة 2-3 ثوانى والجافة تحت تيار من النيتروجين لمدة 5 ثوانى.
  5. تطبيق 6 ميكرولتر من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 0.3 M كلوريد الصوديوم، 1 ملم EDTA، 1 مم 6-mercapto-1-HEXANOL (صحة الأم والطفل) إلى القطب عمل جميع أجهزة الاستشعار 16 واحتضان لمدة 50 دقيقة. يتم تنفيذ هذا وجميع حضانات لاحقة رقاقة الاستشعار في طبق بتري مغطاة في درجة حرارة الغرفة. صحة الأم والطفل بمثابة عامل عرقلة، وملء الفجوات في التحقيق حيث التقاط thiolated أو HDT غير موجود على سطح القطب.

2. تحضير العينة

  1. نقل 1 مل من ثقافة البكتيرية في مرحلة من النمو سجل (OD 600 ≈ 0.1) إلى أنبوب microcentrifuge والطرد المركزي في XG 16،000 لمدة 5 دقائق. إزالة طاف الثقافة. يمكن معالجة بيليه البكتيرية مباشرة أو تخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في وقت لاحق.
  2. resuspend بدقة بيليه البكتيرية في 10 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم من خلال تطبيق طرف ماصة للبوتتوم من أنبوب microcentrifuge وpipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. احتضان تعليق في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  3. تحييد المحللة البكتيرية عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من 1 م العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.2، تحتوي على 2.5٪ البقري ملي ألبومين المصل (BSA) و 0.25 من جهاز كشف التحقيق فلوريسئين معدلة. احتضان المحللة تحييد لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. فلوريسئين وراثيا للكشف عن تحقيقات هجن مع البكتيرية الجزيئات المستهدفة الريباسي.

3. الكهروكيميائية الفحص الاستشعار

  1. غسل صحة الأم والطفل من رقاقة الاستشعار مع منزوع الأيونات H 2 O لمدة 2-3 ثوانى والجافة تحت تيار من النيتروجين لمدة 5 ثوانى.
  2. تطبيق 4 ميكرولتر من تحييد المحللة البكتيرية إلى القطب عمل كل من أجهزة الاستشعار 14 واحتضان لمدة 15 دقيقة. المجمعات تحقيق الهدف كاشف هجن ليجمد تحقيقات التقاط thiolated.
  3. تطبيق 4 ميكرولتر من 1 نانومتر سد قليل النوكليوتيد في 1 م العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.2، تحتوي على 2.5٪ BSA و 0.25 ومو؛ M فلوريسئين وراثيا للكشف عن التحقيق إلى 2 أجهزة الاستشعار مراقبة إيجابية (التي تستخدم لتطبيع إشارة)، واحتضان لمدة 15 دقيقة.
  4. غسل رقاقة الاستشعار مع منزوع الأيونات H 2 O لمدة 2-3 ثوانى والجافة تحت تيار من النيتروجين لمدة 5 ثوانى.
  5. تطبيق 4 ميكرولتر من 0.5 U / مل المضادة للفلوريسئين-HRP في 1 م العازلة الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.2، يحتوي على 0.5٪ الكازين إلى القطب عمل جميع أجهزة الاستشعار 16 واحتضان لمدة 15 دقيقة. مكافحة فلوريسئين-HRP بربط يجمد فلوريسئين معدلة للكشف عن تحقيقات.
  6. غسل رقاقة الاستشعار مع منزوع الأيونات H 2 O لمدة 2-3 ثوانى والجافة تحت تيار من النيتروجين لمدة 5 ثوانى.
  7. تطبيق الفيلم جيدا ملصقا على سطح رقاقة الاستشعار وتحميله إلى جبل رقاقة الاستشعار. ماصة 50 ميكرولتر من الركيزة TMB على جميع أجهزة الاستشعار 16 وأغلق جبل رقاقة الاستشعار.
  8. الحصول amperometry والقياسات Voltammetry دوري لجميع أجهزة الاستشعار 16 باستخدام قارئ رقاقة هيليوس. الحالية تجاه المؤثرات الخارجية يتناسب مع معدل TMB Rالاستنباط على السطح الاستشعار (انظر الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف مقايسة الكهروكيميائية التي يتم هيكلتها على نحو مماثل لشطيرة ELISA. كما هو مبين في الشكل 1، الهدف الريباسي الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي) التهجين مع التقاط وكشف تحقيقات تم تطويرها من قبل رد فعل الأكسدة التي حفزتها HRP مترافق إلى شظايا الأجسام المضادة لمكافحة فلوريسئين التي تربط إلى 3 'فلوريسئين الربط على كشف التحقيق. عنصرا هاما من حساسية مقايسة هو الكيمياء سطح القطب الذهب. لقد وجدنا أن أحادي الطبقة الثلاثية التي تتكون من مجسات thiolated القبض، mercapt...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فحص جهاز استشعار الكهروكيميائية صفها هنا يمكن الكشف السريع عن الأهداف الحمض النووي. حساسية وخصوصية تعتمد في جزء منها على الطاقة الحرة من التهجين الهدف مسبار، والتي تعتمد بدورها على طول والمحتوى GC من التقاط وكشف تحقيقات. نحن عادة بتنفيذ الخطوات التهجين عند درجة حرارة الغرفة (~ 20 ° C) 5، 6. ومع ذلك، فإن خطوات التهجين (3.2 و 3.3) ويمكن أيضا أن يؤديها في ارتفاع درجات الحرارة في فرن التهجين إذا تم وضع رقاقة في غرفة مغطاة تحتوي على ترطيبها ورقة فلتر لمنع التبخر 7، 8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع المؤلفين هي المخترعين على براءات الاختراع ذات الصلة إلى الأساليب المذكورة. وقد تم الترخيص واحدة من هذه البراءات لشركة Qvella. BMC وداه لها حصة في شركة Qvella. VG هو رئيس GeneFluidics، التي هي الشركة المصنعة لأجهزة الاستشعار الكهروكيميائية رقاقة مجموعة، جبل رقاقة، ورقاقة القارئ وصفها في هذه الورقة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذه الدراسة من قبل جائزة الاتفاق التعاوني AI075565 (لداه) من المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية والتي يندي وصندوق روبي كين للتميز في أبحاث المسالك البولية للأطفال. BMC هو جوديث وروبرت ونستون في كرسي المسالك البولية للأطفال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
6-mercapto-1-hexanol (MCH)Sigma451088يحفظ في درجة حرارة الغرفة
1،6-hexanedithiol (HDT)SigmaH-12005يخزن في درجة حرارة الغرفة
مجسات التقاط الثيولOperonN / AStore في 100 & mu ؛ M في 0.1x TE عند -20 درجة ؛ مجسات
كاشف C Fluoresein ModifiedOperonN / AStore at 100 & mu ؛ M في 0.1x TE عند -20 درجة ؛ C
تجسير أولينوكليوتيدأوبرونN / Aمخزن في 100 مو ؛ M في 0.1x TE عند -20 درجة ؛ C
Anti-Fluorescein-HRP ، شظايا فابRoche11 426 346 910Store at 4 & deg; C
Helios Chip ReaderGeneFluidicsGFR-2009
Sensor Chip MountGeneFluidicsGFR-003
ملصق بئرالفيلم GeneFluidicsيتم شحنها مع رقائق الاستشعار رقائق
مصفوفة ذهبية مكشوفة 16 مستشعرا GeneFluidicsSC1000-16X-Bفي 100٪ N2< / sub> في درجة حرارة الغرفة
ألبومين مصل الأبقارمتجر SigmaA7906في 4 درجات ؛ C
1M عازلة الفوسفات ، درجة الحموضة 7.2 0.35M NaH 2< / sub>PO 4< / sub> ، 0.65M K2< / sub>HPO4< / sub> ، معدلة إلى درجة الحموضة 7.2
مانع الكازين في PBS Pierce37528مخفف بحجم متساو من 1M Phosphate Buffer ، درجة الحموضة 7.2 ، تخزينها في درجة حرارة 4 درجات ؛ C
<قوي>الجدول 1. الكواشف والمعدات.< / قوي>

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
  2. Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
  3. Campuzano, S., et al. Ternary monolayers as DNA recognition interfaces for direct and sensitive electrochemical detection in untreated clinical samples. Biosens. Bioelectron. 26, 3577-3584 (2011).
  4. Gau, V., et al. Electrochemical molecular analysis without nucleic acid amplification. Methods. 37, 73-83 (2005).
  5. Patel, M., et al. Target Specific Capture Enhances Sensitivity of Electrochemical Detection of Bacterial Pathogens. J. Clin. Microbiol. 49, 4293-4296 (2011).
  6. Mastali, M., et al. Optimal probe length and target location for electrochemical detection of selected uropathogens at ambient temperature. J. Clin. Microbiol. 46, 2707-2716 (2008).
  7. Liao, J. C., et al. Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens. J. Clin. Microbiol. 44, 561-570 (2006).
  8. Liao, J. C., et al. Development of an advanced electrochemical DNA biosensor for bacterial pathogen detection. J. Mol. Diagn. 9, 158-168 (2007).
  9. Pedrero, M., Campuzano, S., Pingarron, J. M. Electroanalytical sensors and devices for multiplexed detection of foodborne pathogen microorganisms. Sensors (Basel). 9, 5503-5520 (2009).
  10. Kuralay, F., Campuzano, S., Haake, D. A., Wang, J. Highly sensitive disposable nucleic acid biosensors for direct bioelectronic detection in raw biological samples. Talanta. 85, 1330-1337 (2011).
  11. Ecker, D. J., et al. Ibis T5000: a universal biosensor approach for microbiology. Nat. Rev. Microbiol. 6, 553-558 (2008).
  12. Casalta, J. P., et al. Evaluation of the LightCycler SeptiFast test in the rapid etiologic diagnostic of infectious endocarditis. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 28, 569-573 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

TMB

مقالات ذات صلة