Method Article

RNA-يليها تحليل Transcriptomes في المعاملة والثرومبين الإنسان الرئوي مراقبة الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة

DOI:

10.3791/4393

⸱

February 13th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعرض هذا البروتوكول إجراء كاملة ومفصلة لتطبيق RNA-يليها، قوية تكنولوجيا الحمض النووي من الجيل التالي تسلسل، لtranscriptomes الشخصي في خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية مع أو بدون العلاج ثرومبين. هذا البروتوكول هو تعميم لمختلف الخلايا أو الأنسجة المتضررة من الكواشف المختلفة أو الحالات المرضية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توصيف التعبير الجيني في الخلايا عن طريق قياس مستويات مرنا هو أداة مفيدة في تحديد كيفية تأثر الجهاز النسخي للخلية بواسطة إشارات خارجية (على سبيل المثال العلاج من تعاطي المخدرات)، أو كيف تختلف الخلايا بين حالة صحية ودولة مريضة. مع ظهور والتحسين المتواصل لتكنولوجيا DNA الجيل القادم التسلسل، أصبح RNA-التسلسل (RNA-يليها) وسيلة شعبية متزايدة لتحليل transcriptome الى الدليل كافة أنواع النصوص، لتحديد هيكل الترانسكربتي من جميع الجينات التي أعرب عنها وتحديد ل مستويات التعبير المتغيرة للمجموعة مجموع النصوص في الخلية 1،2، أو الأنسجة كائن معين. RNA-يليها إلى تغييره بالتدريج ميكروأرس DNA كأسلوب مفضل للتحليل transcriptome لأنه يحتوي على مزايا أنشأ حسابا باسم transcriptome كاملة، وتوفير نوع مسند الرقمية (عدد نسخة من أي نص) وليس الاعتماد على أي sequen الجيني المعروفةم 3.

هنا، نقدم بروتوكول كاملة ومفصلة لتطبيق RNA-يليها لtranscriptomes الشخصي في خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية مع أو بدون العلاج ثرومبين. ويستند هذا البروتوكول على دراسة حديثة نشرت لدينا بعنوان "RNA-يليها يكشف Transcriptome الرواية الجينات والأشكال الإسوية خلايا الاوعية الدموية الدقيقة في الإنسان الرئوي غشائي المعالجة مع الثرومبين،" 4 التي نفذنا بنجاح أول تحليل transcriptome كاملة من خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية تعامل مع الثرومبين باستخدام RNA-يليها. أسفرت موارد تكنولوجيا المعلومات لم يسبق لها مثيل لمزيد من التجارب للحصول على أفكار في الآليات الجزيئية الكامنة ثرومبين بوساطة ضعف البطانية في التسبب في حالات الالتهابات، والسرطان، والسكري، وأمراض القلب التاجية، ويوفر إمكانية خيوط جديدة الأهداف العلاجية لتلك الأمراض.

النص الوصفي من هذا البروتوكولوينقسم إلى أربعة أجزاء. الجزء الأول يصف العلاج للخلايا الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الرئوي البطانية مع الثرومبين والعزلة RNA، والتحليل الكمي والجودة. الجزء الثاني يصف بناء مكتبة والتسلسل. الجزء الثالث ويصف تحليل البيانات. الجزء الرابع يصف مقايسة التحقق من صحة RT-PCR. يتم عرض نتائج ممثلة من الخطوات الرئيسية عدة. وتقدم نصائح مفيدة لتعزيز الاحتياطات أو النجاح في الخطوات الرئيسية في قسم المناقشات. على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم الرئوي الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الخلايا البطانية تعامل مع الثرومبين، يمكن أن يكون تعميمها على transcriptomes الشخصي في كل من خلايا الثدييات وغير الثدييات والأنسجة في التعامل مع محفزات مختلفة أو مثبطات، أو لمقارنة transcriptomes في الخلايا أو الأنسجة بين حالة صحية ودولة المرض.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم عرض مخطط يحدد هذا البروتوكول في الشكل 1.

1. علاج الخلايا مع الثرومبين، RNA العزلة، وتقييم جودة الكمي لRNA

  1. ثقافة الاوعية الدموية الدقيقة الرئة الخلايا البطانية الإنسان (HMVEC-LBL) لالتقاء 90-100٪ في 6 وحات جيدة في EGM-2 مع المتوسط ​​5٪ FBS، عوامل النمو والمضادات الحيوية (Lonza، القط # CC-3202).
  2. تغيير وسائل الاعلام الى وسائل الاعلام المجاعة (0٪ FBS) 30 دقيقة قبل العلاج مع ثرومبين.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لخطوة 1: 28S: يستخدم تقليديا 18S نسبة كمؤشر على تدهور RNA. ومن الناحية المثالية، ذروة 28S يجب أن يكون حوالي ضعف مساحة الفرقة 18S (نسبة 2)، ولكن هذا في كثير من الأحيان لا ينظر النسبة المثالية من الناحية العملية. وعلاوة على ذلك، 28S: يمكن الحصول عليها من نسب 18S طرق طيفية نقلل من كمية تدهور RNA. على نحو أكثر دقة قياس التدهور، وبالتالي نوعية العينة RNA، ونظام Experion بحساب مؤشر جودة RNA (RQI) عدد. الخوارزمية RQI يقارن مخطط رحلاني من عينات الحمض النووي الريبي لبيانات.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الرئيسية

التعامل مع RNA: RNases سوف تتحلل حتى أكثر عالية الجودة RNA، لذلك يجب توخي الحذر خلال العزلة، تخزين واستخدام RNA 10. يتم ارتداؤها دائما قفازات لمنع التلوث من RNases العثور على الأيدي البشرية. يجب تغيير القفازات في كثير من الأحيان، وخاصة بعد لمس الجلد، مقابض الأبواب أو السطوح المشتركة الأخرى. يجب أن تكون مكرسة مجموعة من ماصات فقط لالحمض النووي الريبي العمل وجميع النصائح وال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور ستيفن Kingsmore والطب الجينوم مركز طب الأطفال في مستشفيات الرحمة للأطفال وعيادات لاستخدام مجموعات الحوسبة من أجل تحليل البيانات المتوفرة لدينا، البورشيد لفريق الخدمة الميدانية (اليزابيث بوير، كوك سكوت وكوك مارك) والتقنية فريق استشاري لردودها سريعة ومقترحات مفيدة على التوالي الصك الجيل القادم التسلسل DNA، HiScanSQ، وتحليل البيانات النوعية. وأيد هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح HL080042 (لSQY) وبدء صندوق الوقف للمستشفيات والرحمة للأطفال وعيادات. جامعة ميسوري في مدينة كنساس (لSQY)

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
الكواشف أو معدات شركة كتالوج رقم تعليقات
خلايا الاوعية الدموية الدقيقة الرئة الإنسان غشائي Lonza CC-2815
Lonza، كيت رصاصة Lonza CC-3202 يحتوي EGM-2، FBS، عوامل النمو والمضادات الحيوية
ثرومبين سيجما T4393
Ambion مير فانا كيت الحياة تكنولوجيز 1560 AM
ريبونوكلياز-زاب الحياة تكنولوجيز AM9782
Experion StdSens RNA بيو راد 700-7103
TruSeq RNA إعدادعدة البورشيد FC-122-1001
الخرز AMPureXP بيكمان كولتر A63881
مرتفع عكس المنتسخة II الحياة تكنولوجيز 18064-014
Experion DNA 1K بيو راد 700-7107
QuantiTect SyberGreen QIAGEN 204163
PE الكتلة الجيل كيت البورشيد PE-401-3001
PhiX التحكم كيت البورشيد FC110-301
200 دورة SBS كيت البورشيد FC-401-3001
HiScanSQ * البورشيد SY-103-2001
CBOT البورشيد SY-301-2002
qPCR آلة - Viia7 الحياة تكنولوجيز نموذج # VIIA7 / 10631261 # المعدات أو ما يعادلها
Experion نظام راد الحيوي 7007001 Bioanalyzer هو نظام بديل
الطيف الحيوي تك عصر صفيحة ميكروسكوبية الطيف أو ما يعادلها
الطرد المركزي - الكتب التي أسطورة XTR الحرارية العلمية 75004521 أو ما يعادلها
موقف المغناطيسي الحياة تكنولوجيز AM10027
96-جيدا thermocycler مختبر مزود العامة
الجدول 3. قائمة الكواشف الرئيسية وE الرئيسيةquipment. *، وفي شريط الفيديو، وقد تجلى HiSeq1000 بدلا من HiScanSQ.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).
  2. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).
  3. Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

RNA seq AnalysisTranscriptome ProfilingThrombin TreatmentHuman Pulmonary Microvascular Endothelial CellsRNA IsolationLibrary ConstructionData AnalysisRT PCR ValidationHighSeq 1000Cuffdiff Analysis

Related Articles