وقد وافق هذا البروتوكول من قبل رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام (IACUC) في جامعة ولاية فلوريدا ومتوافق مع "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" (الطبعة الثامنة، والأكاديمية الوطنية للعلوم، 2011).
المواد
- الحيوانات: ثمانية أسابيع من العمر، من الذكور، سبراغ داولي الفئران (تشارلز ريفر مزارع، ويلمنجتون، MA، الولايات المتحدة الأمريكية) وزنها 250-300 ز في وقت الجراحة.
- خدر
- استنشاق التخدير نظام (VetEquip شركة، بليسانتون، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)
- Isoflurane مخدر (الصيدلانيات باكستر، ديرفيلد، IL، الولايات المتحدة الأمريكية)
- التجسيمي النظام (ديفيد KOPF الصكوك، Tujunga، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)
- نظام الحيوانات الصغيرة التجسيمي
- غير تمزق الأذن القضبان لالفئران
- حامل الغاز رئيس التخدير بالنسبة للفئران
- درجة الحرارة التنظيم
- BAT-12 ميزان حرارة المسبار الميكروي (البنك أدوات دقيقة، وشركة، ساراسوتا، FL، الولايات المتحدة الأمريكية)
- T / PUMP، TP600 بطانية الحرارية (صناعات Gaymar، وشركة، بستان حديقة، NY، USA)
- الأدوات الجراحية
- مشرط مقبض ونصل رقم 11، ملقط القزحية، غريف ملقط، الكامشات المشبك البلدغ، مفك، 10 ميكرولتر مع حقنة إبرة قياس 26 مشطوف (أدوات دقيقة العالمي، وشركة، ساراسوتا، FL، الولايات المتحدة الأمريكية)
- محرك صغروي الحفر وحامل التجسيمي، نقابة المحامين التجسيمي الحاقن (Stoelting، الخشب دايل، IL، الولايات المتحدة الأمريكية)
- 1.0 ملم بر حفر الجولة، 1.0 مم الحفر مخروط مقلوب بر (Roboz الجراحية الصك المحدودة، وشركة، غايثرسبيرغ، MD، الولايات المتحدة الأمريكية)
- اللوازم الجراحية
- تصاعد مسامير 0-80 X 3/32 مع 2.4 ملم طول رمح، 21 عيار دليل قنية [4MM طويلة دون رمى] وقنية همية (بلاستيك واحد، رونوك، VA، الولايات المتحدة الأمريكية)
- طائرة الاكريليك أسنان والسائلة (لانج الأسنان شركة التصنيع، وشركة، ويلنج، IL، الولايات المتحدة الأمريكية)
- 3،0 النايلون خياطة (الواحة، Mettawa، IL، الولايات المتحدة الأمريكية)
- مسحات القطن، Puralube مرهم العين (فيشر العلمية، بتسبرغ، PA، الولايات المتحدة الأمريكية)
- كليبرز الشعر الكهربائية (اوستر، بروفيدانس، رود آيلند، الولايات المتحدة الأمريكية)
- المواد الكيميائية
- Endothelin-1 (الأمريكية الببتيد، سانيفيل، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)
- الكلورهيكسيدين 2٪ (Agrilabs، وسانت جوزيف، MO، الولايات المتحدة الأمريكية)
- البوبرينورفين حمض الهيدروكلوريك (هوسبيرا شركة، ليك فورست، IL، الولايات المتحدة الأمريكية)
- التصور معدات
- المجهر الجراحي (SEILER الصك وتصنيع؛ سانت لويس، MO، الولايات المتحدة الأمريكية)
- إضاءة الألياف البصرية (TechniQuip شركة، ليفرمور، CA، الولايات المتحدة الأمريكية)
- الليزر دوبلر flowmetry النظام (ADInstruments، وشركة، كولورادو سبرينغز، CO، الولايات المتحدة الأمريكية)
- شandard رصاص دقق
- التحقيق حامل
- مقياس التدفق الدم
- Powerlab 4/30 مع LabChart 7
- قياس حجم احتشاء
- الفئران مصفوفة المخ (Zivic ميلر مختبر.، وشركة، أليسون بارك، PA، الولايات المتحدة الأمريكية)
- 2،3،5-triphenyltetrazolium كلوريد (سيغما الدريخ شركة، وسانت لويس، MO، الولايات المتحدة الأمريكية) المخفف إلى 0.05٪ في برنامج تلفزيوني
- مسطحة الماسح الضوئي (إبسون الكمال V30، إبسون الأمريكية، وشركة، لونغ بيتش، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية)
- الصورة J البرمجيات (يماغيج 1.42q البرامج والمعاهد الامريكية الوطنية للصحة في بيثيسدا، MA، الولايات المتحدة الأمريكية)
1. خطوات ما قبل الجراحة
- قبل الجراحة، ويعيش الفئران تحت دائرة الضوء / الظلام 12:12 مع حرية الوصول إلى المياه والقوارض تشاو.
- هو فعل التخدير مع 4٪ isoflurane في 100٪ خليط الغاز O 2 في دائرة الحث حتى الفئران لم تعد السحب لقرصة مخلب الخلفي.
- Aينبغي الحفاظ على أسلوب التحليل خلال هذا الإجراء بما في ذلك استخدام قفازات معقمة، والأدوات الجراحية المعقمة، وثنى الجراحية المعقمة 11.
- وحلق تاج الرأس مع الشعر كليبرز الكهربائية.
- يتم وضع الفئران في وضعية الانبطاح على وسادة ماصة الكذب على سطح التشغيل التحكم في درجة حرارته (بطانية الحرارية).
- يتم وضع الرأس في جهاز التجسيمي بدءا من وضع قناع الوجه الغاز مخدر.
- المقبل، يتم إدراج أشرطة الأذن وشددت.
- خلال إجراء التخدير يتم الاحتفاظ بنسبة 2٪ isoflurane في 100٪ خليط الغاز O 2.
- يتم تطبيق مواد التشحيم مرهم عيني لكلتا العينين، والجفون مغلقة لمنع جفاف العين خلال العملية الجراحية.
- يتم إدراج التحقيق درجة حرارة الجسم الأساسية للحفاظ على درجة حرارة ثابتة الحيوانية من 37 ± 0.5 ° C.
- مع رئيس عقدت بحزم في التجسيميالجهاز، منطقة العمليات الجراحية هو تطهير بالتناوب مع الكلورهيكسيدين 2٪ والمالحة ثلاث مرات.
2. خطوات الجراحية
- باستخدام مشرط، يتم إجراء شق خط الوسط على الجلد المغطي للالقبة من أكثر الجوانب الذيلية للعيون (nasion) إلى ما بين الأذنين (الخط القفوي متفوقة).
- وتراجع الجلد ثم أفقيا مع المشابك البلدغ 3.
- تتم إزالة النسيج الضام من الجمجمة باستخدام قطعة قطن جافة بحيث يمكن رؤية الهياكل متعددة بشكل واضح. وتشمل هذه bregma، وخياطة الاكليلية، والحق ريدج الجمجمة الجانبي. وتستخدم قطعة قطن لإزالة الدم من جراحي ميداني.
- باستخدام المجهر الجراحي، ويقع bregma، ويتم ضبط المتلاعبين التجسيمي حتى يتم ركزت الجولة 1.0 مم بر الحفر في bregma.
- يتم نقل بعد ذلك إلى بر الحفر 1.6 مم و 5.2 مم الأمامي الجانبي لbregma.
- وحفر حفرة بر التي تخترق الجمجمة لالقناالتنسيب العلا (الشكل 1). يتم مسح باستمرار الحطام الزائدة والدم باستخدام قطعة قطن.
عند هذه النقطة، يمكن إدراج قنية دليل (الخطوة 7) أو يمكن القيام بها مباشرة ET-1 حقن من خلال ثقب بر (الانتقال مباشرة إلى الخطوة 16).
- يتم حفر المقبل، والثقوب بر لمدة 3 مسامير التركيب من خلال سمك جزئية من الجمجمة باستخدام 1.0 ملم الحفر مخروط مقلوب بر (الشكل 1). وحفر حفرة واحدة في كل عظم الجبهي الأمامي حوالي 1-2 ملم لخياطة الاكليلية و 1-2 مم الوحشي للخياطة السهمي. وحفر حفرة واحدة في العظم الجداري الخلفي حوالي 2-3 ملم لخياطة الاكليلية و 2-3 مم الوحشي للخياطة السهمي المماثل لثقب دليل بر قنية. 0-80 يتم وضعها ثلاثة X 3/32 مسامير المتصاعدة في هذه الثقوب بر وسوف توفر الدعم للأسمنت القابضة في قنية. يجب أن تكون مسامير فقط متقدمة 2 أو 3 حتى لا يتحول إلى تلف هذه المسألة الجافية.
- يتم وضع قنية في دليل حامل قنية التجسيمي ويقع bregma.
- يتم ضبط المتلاعبين التجسيمي حتى يتم ركزت على قنية دليل على bregma. يتم نقل قنية إلى الحفرة تقع بر 1.6 مم و 5.2 مم الأمامي الجانبي لbregma.
- وأخيرا، يتم خفض قنية دليل في حفرة بر مع الموقف النهائي من طرف 4.5 مم البطني لbregma.
- الليزر دوبلر تدفق تحقيق موضع (اختياري)
- من أجل رصد تدفق الدم في الدماغ باستخدام LDF، يمكن وضع حامل التحقيق في الموقف قبل الالصاق قنية دليل مع الاسمنت الأسنان.
- يتم قطع قاعدة حامل التحقيق تدفق مع التمثال باستثناء علامة التبويب إسفين صغيرة الشكل.
- ثم يتم وضع مسبار حامل الخلفي للقنية دليل وسطي عادل لريدج الجمجمة الجانبي مع علامة التبويب الموجهة بشكل إعلامي (الشكل 1).
- صاحب التحقيق وزتلصق uide قنية معا باستخدام الاسمنت الأسنان.
- ثم يتم استخدام الاسمنت الأسنان لتأمين قنية في المكان. الاسمنت على اتصال مع جميع المسامير الثلاثة ويحيط قاعدة كاملة من قنية.
- يجب أن تكون جافة تماما الأسمنت قبل إزالة حامل قنية. هذا يستغرق حوالي 5 دقائق.
بعد هذه الخطوات، يمكن إغلاق الشق الجراحي ويمكن مشدود دمية قنية قنية في الدليل. وبدلا من ذلك، يمكن إجراء ET-1 يسببها MCAO على الفئران بعد فترة من التعافي من جراحة زرع قنية. لهذا الأسلوب، يجب تنفيذ الخطوة 19 التالي ويمكن تنفيذ الخطوات 14-18 في وقت لاحق. دليل لأداء قنية الحقن وزرع ET-1 خلال نفس الجراحة، ينبغي تنفيذ الخطوة ال 14 المقبلة.
- يتم تحميل المحقنة مع ضخ ET-1 (مخففة إلى 80 ميكرومتر في PBS) ثم تقام في حاقن التجسيمي.
- التم تعديل المتلاعبين التجسيمي حتى يتم ركزت طرف الإبرة في حافة قنية الدليل.
- وخفضت طرف الإبرة من خلال قنية دليل على موقف قدرها 17.2 مم البطني إلى حافة قنية الدليل. إذا لم يتم استخدام قنية دليل، وركزت طرف الإبرة في bregma وخفضت من خلال ثقب إلى بر مم 8،7 موقف بطني لbregma.
- هي التي غرست 3 ميكرولتر من 80 في ET1 ميكرومتر بمعدل 1 ميكرولتر لكل دقيقة.
- ترك الحقنة في مكان لمدة 3 دقائق بعد اكتمال ضخ ومن ثم إزالة ببطء.
- يتم إغلاق شق مع الدرز النايلون 3.0 و هو مشدود دمية قنية في قنية.
- وينبغي استخدام جرعة من مسكن مناسب (أي البوبرينورفين في 0،05-0،1 ملغ / كلغ) بعد الجراحة لتقليل الألم وعدم الراحة أثناء فترة النقاهة.
- تتم إزالة الفئران من الجناح الجراحي ووضعها في الحارة أو المنطقة الانتعاش الجافة لمنع انخفاض حرارة الجسم، مع إمكانية الوصول، مجانا سهلة لينة في الغذاء والماء.