يوصف أسلوب لوصفها الخلايا العصبية مع الأصباغ الفلورية في المجالات المحددة سلفا الصغيرة وظيفية من القشرة المخية الحديثة. أولا، يتم استخدام التصوير الجوهرية الإشارات الضوئية للحصول على خريطة وظيفية. ثم يتم استخدام اثنين من الفوتون المجهري لتسمية الخلايا العصبية والصورة ضمن مجال الصغيرة من على الخريطة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استهدفت وصفها من الخلايا العصبية في المجال الوظيفي محددة من القشرة المخية الحديثة مايكرو من خلال الجمع بين الإشارات الجوهرية والتصوير ثنائي الفوتون
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في القشرة البصرية الأولية غير القوارض الثدييات، وتتجمع الخلايا العصبية وفقا لتفضيلهم لميزات مثل التحفيز التوجه 1-4، الاتجاه 5-7 و هيمنة العين والتفاوت مجهر 8،9 9. الانتقائية التوجه هو السمة الأكثر دراسة على نطاق واسع وخريطة المستمر مع تخطيط شبه دورية لتوجيه المفضل موجود في القشرة البصرية الأولية 10،11 كامل. دمج مساهمات متشابك، وشبكة الخلوية التي تؤدي إلى تحفيز استجابات انتقائية في هذه الخرائط وظيفية يتطلب التهجين من تقنيات التصوير التي تمتد الفرعية ميكرون إلى المقاييس المكانية ملليمتر. مع الإشارة التقليدية التصوير الضوئي الجوهرية، يمكن تحديد تخطيط الشامل للخرائط وظيفية عبر كامل سطح القشرة البصرية 12. تطوير مجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي باستخدام الأصباغ الكالسيوم الحساسة تمكن واحد لتحديد synaptجيم إدخال تصل إلى العمود الفقري شجيري الفردية 13 أو سجل نشاط في وقت واحد من مئات الأفراد أجسام الخلايا العصبية 6،14. وبناء على ذلك، والجمع بين التصوير الجوهرية إشارة للقرار الفرعية ميكرون المكاني للثنائي الفوتون المجهري يوفر إمكانية تحديد بالضبط التي شرائح والخلايا الجذعية تسهم إلى المجال الجزئي من أي خريطة وظيفية في القشرة المخية الحديثة. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة ذات الإنتاجية العالية للحصول على الخارطة بسرعة التوجه القشرية واستهداف محدد الصغيرة النطاق في هذه الخريطة الوظيفية لوصفها الخلايا العصبية مع الأصباغ الفلورية في الثدييات غير القوارض. مع المجهر نفسها التي استخدمت لمدة الفوتون التصوير، ونحن أولا توليد خريطة التوجه باستخدام التصوير الجوهرية الإشارات الضوئية. ثم نعرض كيفية استهداف الدقيقة مجال الاهتمام باستخدام micropipette محملة صبغة إما تسمية عدد سكانها أجسام الخلايا العصبية أو العصبونات تسمية واحدة بحيث التشعبات، والعمود الفقري محاور عصبية واضحة فيالجسم الحي. لدينا أكثر من التحسينات الطرق السابقة تسهيل دراسة العلاقات هيكل الوظائف العصبية مع شبه الخلوية القرار في إطار البنى الوظيفية القشرة المخية الحديثة.
البروتوكول
1. إعداد الجراحية
- حمل التخدير ورصد معدل ضربات القلب بشكل مستمر، وإنهاء المد والجزر CO 2، EEG، ودرجة الحرارة. تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتبعة في رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام من جامعة ساوث كارولاينا الطبية واستندت على تلك التي سبق نشرها 9،15.
- كشف السطح الظهري من الجمجمة عن طريق قطع الجلد بشفرة المشرط. تشريح الأنسجة الضامة التي تغمر العظام باستخدام مجرفة Brudon. تنظيف العظام باستخدام أدوات تطبيقها القطن والشاش والقطن ذات الرؤوس. تطبيق الشمع العظام (حس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لتوضيح دقة طرقنا وضع العلامات صباغة، استهدفت نحن أصغر الجزئي أي مجال وظيفي الخريطة المعروفة في القشرة المخية الحديثة غير القوارض. تتخللها قليلة في جميع أنحاء الخريطة التوجه في القشرة البصرية الأولية هي شخصياته. هذه النقاط التي تحدث في جميع الاتجاهات بحيث تتلاقى المفضلة في خرائط ملونة كاذبة من التوجه المفضل، والمناطق في جميع أنحاء نظرة التفرد مثل "دواليب الهواء" (الشكل 2A-B). تم تحديد واحدة الدولاب على الهواء في حج القحف لوضع العلامات صبغ (دائرة خضراء في .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نقدم طريقة لاستهداف بوضع العلامات على أجسام الخلايا العصبية (أو محورا وتشعبات عصبية) في المجالات المحددة مسبقا الصغيرة وظيفية من القشرة المخية الحديثة. دمج الجوهرية التصوير الإشارات الضوئية مع اثنين من الفوتون المجهري يوفر إمكانية تحديد أي نقاط الاشتباك العصبي والخلايا المساهمة في المجال الجزئي من أي خريطة وظيفية، سواء يرتبط الانتقائية العصبية مع موقع الخلايا العصبية في خريطة وظيفية، والدائرة العصبية مكونات هذا التغيير مع تجربة بصرية 7 أو تطبيق الأدوية العلاجية سريريا <.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للعيون R01EY017925 وR21EY020985 والتمويل من المؤسسات دانا وايت هول لPK كما نشكر متى بتريا للحصول على المساعدة مع العمليات الجراحية؛ غريس ديون لتعقب التشعبات هو مبين في الشكل 5A، وبراتيك Chhatbar لل تعليقات على المخطوط.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| اسم الكاشف / المواد | شركة | كتالوج رقم | تعليقات | |||||
| 1. دعم الحياة / التجربة الإعدادية | ||||||||
| Isoflurane | ويبستر البيطرية | NDC 57319-474-05 | ||||||
| Isoflurane المرذاذ | Midmark | VIP 3000 | ||||||
| تعليقات بطانية التدفئة التنظيم | جهاز هارفارد | 50-7079F | ||||||
| ECG مراقب | Digicare الطبية الحيوية | LifeWindow لايت | ||||||
| مكبر للصوت EEG | نظم AM | 1800 | ||||||
| طرق العرض رصد EEG | هيوليت باكارد | 78304A | ||||||
| إنهاء المد والجزر CO 2 مراقب | RESPIRONICS | Novametrix Capnoguard 1265 | تحسين التهوية | |||||
| نتوءات كربيد الحفر لحفر العظام | هنري شين | غرامة (0.5 مم تلميح) والخشنة (1.25 تلميح مم) | ||||||
| الاسمنت لheadplate / غرفة | DENTSPLY | 675571، 675572 | ||||||
| مسحوق الطلاء الأسود الصبغ | سارجنت الفن وشركة | 22-7185 | إضافة إلى الاسمنت لتحسين التدريع ضوء والحد من انعكاسات | |||||
| الاغاروز - النوع الثالث-A | سيجما | A9793 | لتقليل نبضات خلال إشارة الذاتية والتصوير ثنائي الفوتون | |||||
| ساترة: 5 أو 8 مم، 0.17 مم سمك | الدقة في العالمstruments | 502040، 502041 | لتقليل نبضات خلال التصوير، قد يتم قطع ساترة حسب الحاجة | |||||
| [كرتس Brudon | جورج تيمان | 105-715-0، 105-715-3 | تنظيف سطح الجمجمة | |||||
| الشمع العظام | Ethicon | W31G | وقف النزيف بسرعة | |||||
| يميل القطن القضيب | علوم المجهر الإلكتروني | 72308-05 | نظيفة وجافة السطح العظام | |||||
| دومون # 5CO الملقط | أدوات العلوم الجميلة | 11295-20 | انتزاع طبقات الفردية دورا أو الحنون | |||||
| Vannas ربيع مقص | أدوات العلوم الجميلة | 15000-03 | قطع الجافية | |||||
| جلفوم | شركة فايزر | 09-0396-05 | لوقف نزيف على الجافية | |||||
| امتصاص الرماح | أدوات العلوم الجميلة | 18105-01 | فائقة السرعة والوبر الحرة فتل من CSF | |||||
| تعتيم المواد | Thorlabs | BK5 | درع حج القحف | |||||
| 2. صبغ إعداد / الحقن | ||||||||
| ثنائي ميثيل Sulphoxide (DMSO) | سيجما | D2650 | ||||||
| بلورونيك | سيجما | P2443 | ||||||
| ولاية أوريغون الخضراء 488-Bapta 01:00 | إينفيتروجن | O6807 | الكالسيوم مؤشر | |||||
| الكسا فلور 594 | إينفيتروجن | A10438 | ||||||
| الطرد المركزي فلتر (0.45 ميكرون حجم المسام) | ميليبور | UFC30HV00 | لإزالة الشوائب قبل الحقن | |||||
| الزجاج ماصة مجتذب | سوتر الآلات | P97 | ||||||
| الخيطية البورسليكات الزجاج الشعرية (1.5 مم الخارجي) | أدوات الدقة العالم | 1B150F-4 | صبغ طرد ماصة | |||||
| Microloader | إيبندورف | 5242 956 003 | لتحميل صبغة في ماصة | |||||
| مياداة مجهرية | سوتر الآلات | MP-285 | لوضع ماصة | |||||
| ضغط النبض تحكم | باركر Hannifin | PicoSpritzer III | للحقن الصبغة ضغط | |||||
| وحيدة الخلية electroporator | الجزيئية الأجهزة | Axoporator 800A | لالصعق الكهربائي للصباغة | |||||
| 3. معهد العالم العربي الجوهريةجينج | ||||||||
| 4X الهدف (0.13 NA، 17 مم WD) | OLYMPUS | UPLFLN4X | ||||||
| الجوهرية الأجهزة / البرمجيات | التصوير الضوئي شركة | تصوير 3001 / VDAQ | يتم استخدام البرنامج للحصول على VDAQ التصوير العرضية | |||||
| CCD كاميرا | Adimec | Adimec-1000 | ||||||
| ضوء العرض مصدر الطاقة | كيبكو | 15-15M أكل | ||||||
| مصدر الضوء | التصوير الضوئي شركة | HAL 100 | شدة الضوء على السطح القشري هو 3-5 ميغاواط | |||||
| الأخضر مرشح (لصورة الأوعية الدموية) | التصوير الضوئي شركة | λ = 546 نانومتر (ممر الموجة 30 نانومتر) | لصورة مرجعية من الأوعية الدموية السطحية | |||||
| مرشح الأحمر (لإشارة الذاتية) | Imagi البصريةنانوغرام شركة | λ = 630 نانومتر (ممر الموجة 30 نانومتر) | لجمع الإشارات الجوهرية | |||||
| مرشح الحرارة | التصوير الضوئي شركة | KG-1 | ||||||
| 4. ثنائي الفوتون تلاعب / التصوير | ||||||||
| ثنائي الفوتون المجهر والبرامج | البراري تكنولوجيا | انظر شين وآخرون 2012 للمسار الضوء والفلاتر وقوة الليزر | ||||||
| منظمة الشفافية الدولية: ياقوت ليزر | أطياف-الفيزياء | ماي تاي XF | ||||||
| 20X (0.5 NA؛ WD 3.5 ملم) | OLYMPUS | UMPLFLN20X | ويستخدم 0،5 NA الهدف الوحيد لمحاذاة ماصة على حج القحف (وليس للتصوير الفوتون اثنين) | |||||
| 20X (1.0 NA؛ WD 2.0 مم) | OLYMPUS | XLUMPLFLN20X | ||||||
| 40X (0.8 NA؛ WD 3.3 مم) | OLYMPUS | LUMPLFLN40X/IR | ||||||
| الجدول الهواء | نيوبورت | ST-200 | يعزل من إعداد الاهتزازات الخارجية | |||||
| س ص المرحلة | مايك آلة شركة (أتليبورو، MA) | التجريبية الموضوع ومياداة مجهرية سوتر وضعت على خشبة المسرح س ص | ||||||
|
المراجع
- Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
- Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
