مقالة منهجية

استهدفت وصفها من الخلايا العصبية في المجال الوظيفي محددة من القشرة المخية الحديثة مايكرو من خلال الجمع بين الإشارات الجوهرية والتصوير ثنائي الفوتون

DOI:

10.3791/50025

⸱

ديسمبر 12, 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Medical University of South Carolina

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوصف أسلوب لوصفها الخلايا العصبية مع الأصباغ الفلورية في المجالات المحددة سلفا الصغيرة وظيفية من القشرة المخية الحديثة. أولا، يتم استخدام التصوير الجوهرية الإشارات الضوئية للحصول على خريطة وظيفية. ثم يتم استخدام اثنين من الفوتون المجهري لتسمية الخلايا العصبية والصورة ضمن مجال الصغيرة من على الخريطة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في القشرة البصرية الأولية غير القوارض الثدييات، وتتجمع الخلايا العصبية وفقا لتفضيلهم لميزات مثل التحفيز التوجه 1-4، الاتجاه 5-7 و هيمنة العين والتفاوت مجهر 8،9 9. الانتقائية التوجه هو السمة الأكثر دراسة على نطاق واسع وخريطة المستمر مع تخطيط شبه دورية لتوجيه المفضل موجود في القشرة البصرية الأولية 10،11 كامل. دمج مساهمات متشابك، وشبكة الخلوية التي تؤدي إلى تحفيز استجابات انتقائية في هذه الخرائط وظيفية يتطلب التهجين من تقنيات التصوير التي تمتد الفرعية ميكرون إلى المقاييس المكانية ملليمتر. مع الإشارة التقليدية التصوير الضوئي الجوهرية، يمكن تحديد تخطيط الشامل للخرائط وظيفية عبر كامل سطح القشرة البصرية 12. تطوير مجهر ثنائي الفوتون في الجسم الحي باستخدام الأصباغ الكالسيوم الحساسة تمكن واحد لتحديد synaptجيم إدخال تصل إلى العمود الفقري شجيري الفردية 13 أو سجل نشاط في وقت واحد من مئات الأفراد أجسام الخلايا العصبية 6،14. وبناء على ذلك، والجمع بين التصوير الجوهرية إشارة للقرار الفرعية ميكرون المكاني للثنائي الفوتون المجهري يوفر إمكانية تحديد بالضبط التي شرائح والخلايا الجذعية تسهم إلى المجال الجزئي من أي خريطة وظيفية في القشرة المخية الحديثة. نحن هنا يبرهن على وجود طريقة ذات الإنتاجية العالية للحصول على الخارطة بسرعة التوجه القشرية واستهداف محدد الصغيرة النطاق في هذه الخريطة الوظيفية لوصفها الخلايا العصبية مع الأصباغ الفلورية في الثدييات غير القوارض. مع المجهر نفسها التي استخدمت لمدة الفوتون التصوير، ونحن أولا توليد خريطة التوجه باستخدام التصوير الجوهرية الإشارات الضوئية. ثم نعرض كيفية استهداف الدقيقة مجال الاهتمام باستخدام micropipette محملة صبغة إما تسمية عدد سكانها أجسام الخلايا العصبية أو العصبونات تسمية واحدة بحيث التشعبات، والعمود الفقري محاور عصبية واضحة فيالجسم الحي. لدينا أكثر من التحسينات الطرق السابقة تسهيل دراسة العلاقات هيكل الوظائف العصبية مع شبه الخلوية القرار في إطار البنى الوظيفية القشرة المخية الحديثة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الجراحية

  1. حمل التخدير ورصد معدل ضربات القلب بشكل مستمر، وإنهاء المد والجزر CO 2، EEG، ودرجة الحرارة. تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتبعة في رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام من جامعة ساوث كارولاينا الطبية واستندت على تلك التي سبق نشرها 9،15.
  2. كشف السطح الظهري من الجمجمة عن طريق قطع الجلد بشفرة المشرط. تشريح الأنسجة الضامة التي تغمر العظام باستخدام مجرفة Brudon. تنظيف العظام باستخدام أدوات تطبيقها القطن والشاش والقطن ذات الرؤوس. تطبيق الشمع العظام (حسب الحاجة) في الجمجمة ووقف النزيف في بعض الأحيان من خلال الأوردة مبعوث الصغيرة.
  3. إرفاق التيتانيوم المقاوم للصدأ أو الفولاذ لوحة لرئيس الجمجمة (فوق منطقة ذات أهمية حيث سيتم تنفيذ حج القحف) باستخدام الاسمنت الأسنان مختلطة مع الطلاء الأسود (انظر المواد). A افتتاح مستطيل في وسط لوحة الرأس وصولا لحج القحف والتصوير الضوئي. إرفاق غرفة معدنية على الجزء العلوي من لوحة الرأس. وهذه القاعة بمثابة خزان السائل للتصوير بهدف عدسة المياه الغمر.
  4. تأمين لوحة الرأس إلى مرحلة XY باستخدام المشاركات المعادن.
  5. رقيقة مساحة كبيرة من العظام داخل فتح مستطيلة من headplate باستخدام الحفر الأسنان. يجب على المنطقة المراد ضعيفة تمتد إلى ما وراء حدود حج القحف المخطط لها. يجب أن ضعفت الجمجمة سميكة من غير الثدييات إذا القوارض إلى صور عالية الدقة يمكن الحصول عليها من القشرة المخية الحديثة لأنه في موقع حج القحف، والعظام وسمك تملي سمك الاغاروز بين ساترة وسطح القشرة المخية الحديثة (انظر أدناه) .
  6. حفر 2 × 2 مم مربع مخطط في العظام لحج القحف. شطف الغرفة دوريا مع السائل المخي الشوكي الطازجة الاصطناعي (ACSF) لإزالة شظايا العظام وتقليل تبديد الحرارة إلى القشرة الأساسية. تطبيق الشمع العظام حسب الحاجة، لوقف النزيف في بعض الأحيان.
  7. ليفر رفرف العظام مع ملقط # 3.
  8. إزالة كافة ولكن الطبقة السفلية من الجافية باستخدام ملقط غرامة (# 5CO) ومقص الربيع Vannas. والدرة في غير الثدييات القوارض سميكا وغير شفاف ولكن يمكن إزالتها في طبقات متميزة. النزيف أمر نادر الحدوث ولكن يمكن وقفها مع جلفوم وينبغي إزالة أي بقايا الدم برفق من الطبقة المتبقية من استخدام ملقط الجافية والشطف مع ACSF. الطبقة الأخيرة من دورا يتسم بالشفافية والأوعية حنوني ينبغي أن تكون واضحة للعيان من خلال ذلك. وترك هذه الطبقة النهائية من خلال التصوير الجافية سليمة إشارة جوهرية تزيد من نسبة نجاح التحميل الجزء الأكبر من مؤشرات الكالسيوم الفلورية للمرحلة اللاحقة التصوير ثنائي الفوتون من التجربة (انظر المناقشة).
  9. تطبيق قطرة دافئة الاغاروز 2٪ (الذائبة في ACSF) وعلى الفور وضع ساترة خلال حج القحف. تحقق من حج القحف لضمان أن نبضات القلب والأوعية الدموية في الجهاز التنفسي وتكاد تكون معدومة باستخدام الميكروسكوب الجراحي أو تشريح oculars حل الدولتين،الفوتون المجهر في مجال وضع مشرق.

2. الجوهرية الإشارات الضوئية التصوير

  1. إضافة هلام الرغوة غارقة مع ACSF حول السطح الخارجي للساترة لمنع الاغاروز من الجفاف خلال التصوير إشارة الذاتية.
  2. إرفاق الذاتية كاميرا CCD التصوير إشارة إلى ميناء جبل معيار C-على رأس المجهر ثنائي الفوتون (الشكل 1). وضع مصدر إضاءة الضوء على الجدول جوية قرب مرحلة س ص (الشكل 1A). موقف وتأمين أدلة الضوء على حج القحف وheadplate / غرفة (1B الشكل). التراجع عن مزدوج اللون الأساسي والمرآة دون ميناء جبل C-بحيث الضوء المنعكس الأحمر اللازمة لإشارات جوهرية سوف تمر مباشرة من حج القحف إلى الكاميرا CCD (الشكل 1C-D). الهدف باستخدام الهواء 4X (0.13 NA، 17 مم WD)، وحقل 2 × 2 مم للعرض متاح للتصوير إشارة الذاتية.
  3. إدراج مرشح الحرارة في لآيت الطريق لمنع القشرة من التدفئة. استخدام التصفية التي يمر الضوء الأخضر (546 نانومتر مركز λ) وتسجيل صورة مرجعية رقمية في الأوعية الدموية السطحية القشرية.
  4. نقل التركيز إلى 500 ميكرومتر Z تحت السطح القشري. استخدام عامل تصفية الحمراء (630 نانومتر مركز λ) لإلقاء الضوء على قشرة لقياس الإشارات الجوهرية. وضع أدلة ضوء بحيث يتم مضيئة بشكل موحد على السطح القشري. درع حج القحف من ضوء الشاشة التي تنتجها التحفيز البصري. تقديم سلسلة من المحفزات البصرية والصور سجل بيانات الانعكاس. لإنشاء خريطة التوجه في غضون 10 دقيقة، وجمع البيانات الموافق 4 التكرار من سلسلة من 8 منبهات (4 التوجهات والاتجاهات اثنين لكل اتجاه).
  5. تحليل البيانات الجوهرية لتوليد إشارة التوجه اللون كاذبة الخريطة. حدد المناطق المستهدفة المحتملة للثنائي الفوتون توسيم الخلايا العصبية، على سبيل المثال، والتوجه شخصياته الدولاب على الهواء - نقطة في الخريطة مكانجميع التوجهات تلتقي المفضل (الشكل 2A). تراكب الخريطة التوجيه وصورة الأوعية الدموية السطحية القشرية (الشكل 2B-C). استخدام تخطيط من المجالات الوظيفية وموقع سفن السطح الكبيرة لتحديد الهدف، وتجنب المواقع مع الأوعية الدموية الكبيرة والشرايين 15.

3. تحميل الجزء الأكبر من مؤشرات الكالسيوم نيون

  1. إعداد حل بلورونيك 20٪ / DMSO بإضافة 1 غرام في 5 بلورونيك DMSO ميكرولتر. تسخين الخليط في 60 ° C لمدة 10 دقيقة على حل تماما بلورونيك. يسمح هذا الخليط ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة. إضافة 4 ميكرولتر من خليط بلورونيك / DMSO إلى قارورة ميكروغرام 50 من الكالسيوم مؤشر الفلورية الخضراء ولاية أوريغون 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). ثم يضاف 1 ميكرولتر من صبغة حمراء (اليكسا فلور 594، 2 محلول المخزون ملي) و 35 ميكرولتر من حل ماصة (انظر المواد) لتركيز النهائي من 1 ملم OGB-1 AM. يصوتن الحل ل½ ساعة فيحمام المياه المبردة وأجهزة الطرد المركزي ثم 0،45 ميكرون مع فلتر لإزالة الشوائب.
  2. سحب ماصة تفتق طويل مع قطر تلميح الخارجي من 2،0-2،5 ميكرومتر. تحميل 5 ميكرولتر من خليط الصبغة في ماصة.
  3. إزالة الطبقة النهائية من دورا لتسهيل ماصة الإدراج والحصول على أعلى جودة لمدة الفوتون الصور.
  4. تحديد المكان المحدد على سطح القشرية التي يجب أن توضع في ماصة من أجل الوصول إلى هدفه في طبقة قشرية 2/3. هدفنا هو محدد سلفا القشرية التفرد الدولاب على الهواء في خريطة التوجه (الشكل 2). يجب أن تكون مدفوعة ماصة في القشرة بزاوية ° 30 لتمرير بين الجدار وغرفة الهدف. وهكذا، لتسمية المنطقة المستهدفة 200 ميكرومتر تحت السطح القشري، فإن موقف دخول ماصة على سطح القشرية يكون حوالي 350 ميكرون الجانبي إلى موقف الهدف (الشكل 3 AB).
  5. نقل المرحلة XY (التي الحيوان وعتوضع ipette مياداة مجهرية) إلى مركز إدخال السطح القشري موقف إطار الهدف (الشكل 3C). استخدام الهدف 20X 40X أو مع مسافة العمل (WD) ما لا يقل عن 3 مم (انظر المواد) للتأكد من أن ماصة ستدخل بسهولة القشرة دون لمس الهدف أو العظام على طول جدار حج القحف. مرة واحدة ويتركز موقف دخول في إطار الهدف، ورفع الموقف Z الهدف بنسبة 2 مم (الشكل 3D). مع برنامج التحصين الموسع، مضان أخضر فاتح تشغيل لتصور الأحمر اليكسا الصبغة في ماصة، استخدم محور مائل للمياداة مجهرية لنقل ماصة حتى يتركز طرفها (وركز) في إطار الهدف مباشرة فوق موقف سطح دخول القشرية ( الرقم 3E).
  6. خفض عموديا ماصة (على طول محور ض) حتى تصل إلى السطح ماصة القشرية (الشكل 3F)، في حين عرض مستمر من خلال طرف ماصة مكتب تعزيز الوحدةلارس من المجهر. باستخدام مشرق مجال الإضاءة، والدم سطح السفن والأغشية القشرية السحائي المتبقية (PIA والعنكبوتي) مرئية بسهولة كما ماصة تقترب من سطح القشرية. إذا كان ماصة لا يصل إلى موقف الإدخال المطلوب، ورفع ماصة وإعادة تقويم يعتمد على استهداف المعالم الأوعية الدموية على سطح القشرية.
  7. إزالة الهدف، الفتيل السائل النخاعي الزائد من حج القحف وتجفيف العظام المجاورة باستخدام الرماح امتصاص الخالي من الوبر. تطبيق قطرة دافئة الاغاروز 3٪ (الذائبة في ACSF) لتحقيق الاستقرار في القشرة التي مرئيا من خلال حج القحف (الشكل 3G). في القوارض غير، الاغاروز 3٪ من الضروري تخفيف نبضات لامتصاص نجاح الأصباغ الفلورية من الخلايا العصبية. للتصوير الضوئي إشارة الجوهرية 2٪ فقط وهناك حاجة لأن الاغاروز مزيج من الاغاروز 2٪ وساترة ويوفر الاستقرار اللازم. هنا، يتم استخدام أي ساترة للخطوة صبغة التحميل حتى 3٪ والاغاروزاللازمة. بعد الاغاروز وقد عززت، اضافة الى وجود الهدف 40X (0.8 NA، 3.3 مم WD) وإعادة ملء الغرفة مع ACSF.
  8. التحول من الميدان مشرق لاثنين من الفوتون عرض وتحديد موقع الطرف ماصة. باستخدام محور مائل للمياداة مجهرية، نقل ماصة حتى طرفها تصل إلى العمق المطلوب في القشرة (الشكل 3H). وأحيانا نفث طرد ضغط خليط الصبغة (أ PSI قليلة، كل 0،1 ثانية نبض) تساعد على منع الطرف ماصة من انسداد. لأن OGB-01:00 يصبح فقط مرئية عند دخول الخلايا، وصبغ أحمر اليكسا أمر بالغ الأهمية لرؤية غيض ماصة داخل القشرة.
  9. قبل محاولة تحميل الخلايا العصبية في طبقة قشرية 2/3 مع الجرعة الكاملة من الأصباغ، وإعادة تركيز الهدف على سطح القشرية لتأكيد عمق غيض ماصة والتأكد من أن الطرف هو في موقع الهدف على أساس تخطيط سفن السطح الدم. إذا كان في طبقة ماصة 2/3، وينبغي أن نفث صغيرة من الخليط صبغة تضيءخارج الخلية الفضاء وتكشف عن وجود الجمعية كثيفة من أجسام الخلايا الدائرية والظلال الداكنة.
  10. لتحميل أجسام الخلايا العصبية في القشرة مجال قطرها ميكرون 300-600، وضخ صبغة الخليط في الفضاء خارج الخلية باستخدام نبضات 30-90، كل 1،0 ثانية نبض، 2-10 رطل. ينبغي أن نبضات من الضغط لا تكون قوية لدرجة أن الأنسجة يتحرك. بعد اكتمال حقن، انتظر لدقيقة قليلة، ثم إزالة ماصة وموضوعية. الانتظار لمدة 1 ساعة للسماح للOGB-1 صباحا إلى اتخاذ يكون كاملا، من قبل الخلايا العصبية.
  11. إزالة الاغاروز المستخدمة في صبغ التحميل وشطف غرفة تسجيل. وضع قطرة صغيرة من 2-3٪ الاغاروز على السطح وسرعان ما وضع ساترة خلال حج القحف. لأن الأصباغ الفلورية هي حساسة للضوء، وتجنب الإفراط في تعريض القشرة إلى الميدان أو مشرق ضوء برنامج التحصين الموسع-الفلورسنت. اضافة الى وجود ارتفاع NA (1.0) 20X الهدف في ماسك الهدف وإعادة مركز المنطقة المسماة القشرية في إطار الهدف باستخدام المرحلة XY. درع من حج القحف السابقينمصادر الضوء traneous، على سبيل المثال، عرض الحوافز البصرية، وذلك باستخدام طبقات متعددة من مواد تعتيم.

4. وحيدة الخلية الصعق الكهربائي من الأصباغ نيون

  1. لدراسة التشكل شجيري، يعد الحل من 100 ميكرومتر اليكسا فلور 594 (1:20 التخفيف في ACSF من 2 ملي الأسهم اليكسا فلور 594). قد لتصوير الفنية للالتشعبات يمكن استخدام الملح OGB 16،17.
  2. سحب ماصة تفتق طويل مع حجم غيض من 1 ميكرومتر وتحميل 5 ميكرولتر من صبغة في ماصة. جميع الخطوات الأخرى استهدفت عمل المجال مماثلة لطريقة التحميل بالجملة (أرقام 1-3). لوضع تلميح ماصة مجاورة لغشاء الخلية العصبية الجسم، ورصد زيادة في مقاومة القطب وتطبيق نفث ضغط صبغ لإلقاء الضوء على الفضاء خارج الخلية ونرى أجسام الخلايا والظلال أثناء التصوير ثنائي الفوتون.
  3. عندما غيض ماصة المجاورة لغشاء الخلية العصبية الجسم، استخدم 800A Axoporator لتطبيق1-3 البقول (-8 إلى -10 V، 10 ميللي ثانية النبض). شغل الفوري للعصبون مع صبغ هو تصور بسهولة مع اثنين من الفوتون المجهري. إزالة ماصة وجمع صور عالية الدقة من التشعبات والمحاوير في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتوضيح دقة طرقنا وضع العلامات صباغة، استهدفت نحن أصغر الجزئي أي مجال وظيفي الخريطة المعروفة في القشرة المخية الحديثة غير القوارض. تتخللها قليلة في جميع أنحاء الخريطة التوجه في القشرة البصرية الأولية هي شخصياته. هذه النقاط التي تحدث في جميع الاتجاهات بحيث تتلاقى المفضلة في خرائط ملونة كاذبة من التوجه المفضل، والمناطق في جميع أنحاء نظرة التفرد مثل "دواليب الهواء" (الشكل 2A-B). تم تحديد واحدة الدولاب على الهواء في حج القحف لوضع العلامات صبغ (دائرة خضراء في ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم طريقة لاستهداف بوضع العلامات على أجسام الخلايا العصبية (أو محورا وتشعبات عصبية) في المجالات المحددة مسبقا الصغيرة وظيفية من القشرة المخية الحديثة. دمج الجوهرية التصوير الإشارات الضوئية مع اثنين من الفوتون المجهري يوفر إمكانية تحديد أي نقاط الاشتباك العصبي والخلايا المساهمة في المجال الجزئي من أي خريطة وظيفية، سواء يرتبط الانتقائية العصبية مع موقع الخلايا العصبية في خريطة وظيفية، والدائرة العصبية مكونات هذا التغيير مع تجربة بصرية 7 أو تطبيق الأدوية العلاجية سريريا <...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من المعهد الوطني للعيون R01EY017925 وR21EY020985 والتمويل من المؤسسات دانا وايت هول لPK كما نشكر متى بتريا للحصول على المساعدة مع العمليات الجراحية؛ غريس ديون لتعقب التشعبات هو مبين في الشكل 5A، وبراتيك Chhatbar لل تعليقات على المخطوط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
اسم الكاشف / المواد شركة كتالوج رقم تعليقات
1. دعم الحياة / التجربة الإعدادية
Isoflurane ويبستر البيطرية NDC 57319-474-05
Isoflurane المرذاذ Midmark VIP 3000
تعليقات بطانية التدفئة التنظيم جهاز هارفارد 50-7079F
ECG مراقب Digicare الطبية الحيوية LifeWindow لايت
مكبر للصوت EEG نظم AM 1800
طرق العرض رصد EEG هيوليت باكارد 78304A
إنهاء المد والجزر CO 2 مراقب RESPIRONICS Novametrix Capnoguard 1265 تحسين التهوية
نتوءات كربيد الحفر لحفر العظام هنري شين غرامة (0.5 مم تلميح) والخشنة (1.25 تلميح مم)
الاسمنت لheadplate / غرفة DENTSPLY 675571، 675572
مسحوق الطلاء الأسود الصبغ سارجنت الفن وشركة 22-7185 إضافة إلى الاسمنت لتحسين التدريع ضوء والحد من انعكاسات
الاغاروز - النوع الثالث-A سيجما A9793 لتقليل نبضات خلال إشارة الذاتية والتصوير ثنائي الفوتون
ساترة: 5 أو 8 مم، 0.17 مم سمك الدقة في العالمstruments 502040، 502041 لتقليل نبضات خلال التصوير، قد يتم قطع ساترة حسب الحاجة
[كرتس Brudon جورج تيمان 105-715-0، 105-715-3 تنظيف سطح الجمجمة
الشمع العظام Ethicon W31G وقف النزيف بسرعة
يميل القطن القضيب علوم المجهر الإلكتروني 72308-05 نظيفة وجافة السطح العظام
دومون # 5CO الملقط أدوات العلوم الجميلة 11295-20 انتزاع طبقات الفردية دورا أو الحنون
Vannas ربيع مقص أدوات العلوم الجميلة 15000-03 قطع الجافية
جلفوم شركة فايزر 09-0396-05 لوقف نزيف على الجافية
امتصاص الرماح أدوات العلوم الجميلة 18105-01 فائقة السرعة والوبر الحرة فتل من CSF
تعتيم المواد Thorlabs BK5 درع حج القحف
2. صبغ إعداد / الحقن
ثنائي ميثيل Sulphoxide (DMSO) سيجما D2650
بلورونيك سيجما P2443
ولاية أوريغون الخضراء 488-Bapta 01:00 إينفيتروجن O6807 الكالسيوم مؤشر
الكسا فلور 594 إينفيتروجن A10438
الطرد المركزي فلتر (0.45 ميكرون حجم المسام) ميليبور UFC30HV00 لإزالة الشوائب قبل الحقن
الزجاج ماصة مجتذب سوتر الآلات P97
الخيطية البورسليكات الزجاج الشعرية (1.5 مم الخارجي) أدوات الدقة العالم 1B150F-4 صبغ طرد ماصة
Microloader إيبندورف 5242 956 003 لتحميل صبغة في ماصة
مياداة مجهرية سوتر الآلات MP-285 لوضع ماصة
ضغط النبض تحكم باركر Hannifin PicoSpritzer III للحقن الصبغة ضغط
وحيدة الخلية electroporator الجزيئية الأجهزة Axoporator 800A لالصعق الكهربائي للصباغة
3. معهد العالم العربي الجوهريةجينج
4X الهدف (0.13 NA، 17 مم WD) OLYMPUS UPLFLN4X
الجوهرية الأجهزة / البرمجيات التصوير الضوئي شركة تصوير 3001 / VDAQ يتم استخدام البرنامج للحصول على VDAQ التصوير العرضية
CCD كاميرا Adimec Adimec-1000
ضوء العرض مصدر الطاقة كيبكو 15-15M أكل
مصدر الضوء التصوير الضوئي شركة HAL 100 شدة الضوء على السطح القشري هو 3-5 ميغاواط
الأخضر مرشح (لصورة الأوعية الدموية) التصوير الضوئي شركة λ = 546 نانومتر (ممر الموجة 30 نانومتر) لصورة مرجعية من الأوعية الدموية السطحية
مرشح الأحمر (لإشارة الذاتية) Imagi البصريةنانوغرام شركة λ = 630 نانومتر (ممر الموجة 30 نانومتر) لجمع الإشارات الجوهرية
مرشح الحرارة التصوير الضوئي شركة KG-1
4. ثنائي الفوتون تلاعب / التصوير
ثنائي الفوتون المجهر والبرامج البراري تكنولوجيا انظر شين وآخرون 2012 للمسار الضوء والفلاتر وقوة الليزر
منظمة الشفافية الدولية: ياقوت ليزر أطياف-الفيزياء ماي تاي XF
20X (0.5 NA؛ WD 3.5 ملم) OLYMPUS UMPLFLN20X ويستخدم 0،5 NA الهدف الوحيد لمحاذاة ماصة على حج القحف (وليس للتصوير الفوتون اثنين)
20X (1.0 NA؛ WD 2.0 مم) OLYMPUS XLUMPLFLN20X
40X (0.8 NA؛ WD 3.3 مم) OLYMPUS LUMPLFLN40X/IR
الجدول الهواء نيوبورت ST-200 يعزل من إعداد الاهتزازات الخارجية
س ص المرحلة مايك آلة شركة (أتليبورو، MA) التجريبية الموضوع ومياداة مجهرية سوتر وضعت على خشبة المسرح س ص
وصفات
اصطناعية الدماغي الشوكي السوائل كلوريد الصوديوم (135 ملم)، بوكل (5.4 ملم)، MgCl 2 (1.0 ملم)، CaCl 2 (1.8 ملم)، HEPES (5 ملم)، درجة الحموضة 7.4
الحل ماصة 14 كلوريد الصوديوم (150 مم)، بوكل (2.5 ملم)، HEPES (10 ملم)، درجة الحموضة 7.4

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
  2. Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
  3. Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
  4. Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
  5. Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
  6. Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
  7. Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
  8. Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
  9. Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
  10. da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16(2010).
  11. Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
  12. Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).
  13. Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
  14. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
  15. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
  16. Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
  17. Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
  18. Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
  19. Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
  20. Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
  21. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
  22. Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. Toga, A. W., Mazziotta, J. C. , Academic Press. San Diego. 55-97 (1996).
  23. Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
  24. Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Intrinsic Signal ImagingTwo photon MicroscopyOrientation MapNeuron LabelingFunctional Micro domainCortical ImagingFluorescent DyeSingle Neuron ResolutionVisual CortexSub cellular Resolution

مقالات ذات صلة