Method Article

التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

DOI:

10.3791/50047

⸱

May 3rd, 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis , 2NSF Center for Biophotonics Science & Technology, University of California, Davis , 3University of Tromsø, 4Department of Surgery (Division of Surgical Oncology), University of California, Davis , 5UC Davis Comprehensive Cancer Center, University of California, Davis , 6Department of Biological Chemistry, University of California, Davis

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الالتهام الذاتي هو عملية في كل مكان التي تمكن الخلايا تتحلل وإعادة تدوير البروتينات والعضيات. نحن نطبق المجهري مضان متقدمة لتصور وقياس صغيرة، ولكن التغييرات الأساسية، المادية المرتبطة تحريض الالتهام الذاتي، بما في ذلك تشكيل وتوزيع autophagosomes والجسيمات الحالة، والانصهار بهم إلى autolysosomes.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سرطان البروستاتا هو الشكل الرائدة في مجال الأورام الخبيثة بين الرجال في الولايات المتحدة، بينما جراحة يحمل مخاطر كبيرة من العجز الجنسي وسلس البول، وقد كان النهج العلاج الكيميائي التقليدي غير ناجحة إلى حد كبير. العلاج الهرموني فعال في مرحلة مبكرة، ولكن غالبا ما يفشل مع التنمية في نهاية المطاف من الأورام هرمون الحرارية. لقد تم مهتمة في تطوير علاجات تستهدف نقص التمثيل الغذائي محددة من الخلايا السرطانية. أظهرنا مؤخرا أن الخلايا السرطانية تفتقر البروستاتا على وجه التحديد انزيم (سينسيز أرجينينوسكسينات، أو ASS) تشارك في تركيب الأحماض الأمينية أرجينين 1. هذا الشرط يسبب الخلايا السرطانية لتصبح تعتمد على أرجينين الخارجية، وأنها تخضع الإجهاد الأيضي عندما يتم استنفاد أرجينين مجانا من أرجينين deiminase (ADI) 1،10. في الواقع، ونحن قد أظهرت أن خلايا سرطان البروستاتا البشرية CWR22 RV1 يتعرضون للقتل على نحو فعال من قبل ADI مع موت الخلايا المبرمج كاسباس مستقلة وautopha العدوانيةغراي (أو macroautophagy) 1،2،3. الالتهام الذاتي هو عملية تطويريا-الحفظ التي تسمح الخلايا على استقلاب البروتينات غير المرغوب فيها من قبل انهيار الليزوزومية خلال المجاعة الغذائية 4،5. على الرغم من أن المكونات الأساسية لهذا المسار جيدا يتميز 6،7،8،9، العديد من جوانب الآلية الجزيئية لا تزال غير واضحة - على وجه الخصوص، ما هو دور الالتهام الذاتي في وفاة والاستجابة من خلايا سرطان البروستاتا بعد العلاج ADI ؟ من أجل معالجة هذه المسألة، ونحن يتطلب المنهج التجريبي لقياس مستوى ومدى استجابة autophagic في الخلايا - وبما أنه لا توجد الواسمات الجزيئية المعروفة التي يمكن أن تتبع بدقة هذه العملية، اخترنا لتطوير نهج قائم على التصوير، وذلك باستخدام الكمية المجهري مضان 3D 11،12.

باستخدام CWR22Rv1 الخلايا على وجه التحديد المسمى مع تحقيقات الفلورسنت لautophagosomes والجسيمات الحالة، وتبين لنا أن مداخن صورة 3D المكتسبة مع أي وايdefield المجهر deconvolution (وفيما بعد، مع فائق الدقة، المجهري منظم في الإضاءة) يمكن التقاط بوضوح المراحل المبكرة من تحريض الالتهام الذاتي. مع المتاحة تجاريا تطبيقات تحليل الصور الرقمية، ويمكننا الحصول بسهولة على معلومات إحصائية عن عدد جسيم بلعمي ذاتي ويحلول والحجم والتوزيع، ودرجة colocalization من أي خلية المصورة. هذه المعلومات يسمح لنا لتتبع بدقة التقدم من الالتهام الذاتي في الخلايا الحية، ويمكن استمرار تحقيقاتنا في دور الالتهام الذاتي في العلاج الكيميائي للسرطان.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الجزء 1: خلية ثقافة وصفها المناعية فلوري

  1. تنمو الخلايا السرطانية CWR22 RV1 البروستاتا الذي يصيب الانسان على الزجاج coverslips على (# 1.5 أو 170 ميكرون سمك) وضعت في 6 لوحات جيدا، مع RPMI (Mediatech، VA) تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتوميسين / الجلوتامين.
  2. لحث الالتهام الذاتي عن طريق التعامل مع عينات مختارة أرجينين deiminase (ADI، 0.3 ميكروغرام / مل) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  3. إصلاح الخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA، فيشر العلمية، NH) المخفف في برنامج تلفزيوني و 100 ميكرولتر في ساترة، لمدة 10 دقيقة في RT.
  4. غسل الخلايا 3x مع 1 مل HBS / BSA.
  5. Permeabilize الخلايا مع سابونين 0.05٪ (سيغما، MO) في HEPES (HBS) / BSA، و 100 ميكرولتر في ساترة، لمدة 15 دقيقة في RT.
  6. قبل المناعية وضع العلامات، وعينات كتلة مع 2.5٪ الكازين (سيغما، MO) في HBS / BSA، و 100 ميكرولتر في ساترة، لمدة 1 ساعة على RT.
  7. احتضان خلايا ثابتة مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في 2.5٪ الكازين / HBS / BSA، و 100 ميكرولتر لكل coverslIP، O / N عند 4 درجة مئوية.
  8. غسل الخلايا 3x مع 1 مل HBS / BSA.
  9. احتضان خلايا ثابتة مع الأجسام المضادة الثانوية المخفف في 2.5٪ الكازين / HBS / BSA، و 100 ميكرولتر في ساترة، لمدة 1 ساعة على RT.
  10. غسل الخلايا 3x مع 1 مل HBS / BSA.
  11. جبل coverslips على استعداد على الشرائح العادية المجهر والزجاج مع الذهب SlowFade أو إطالة الذهب كاشف antifade (إينفيتروجن، CA) التي تحتوي على 4 '،6-diamidino-2-phenylindole (دابي).
  12. حواف ختم ساترة مع طلاء الأظافر. للحصول على أفضل نتائج التصوير، إتاحة الوقت (مثالي O / N) لوسائل الإعلام لمكافحة تتلاشى تماما تتخلل الخلايا.
  13. تنظيف سطح ساترة مع الميثانول و / أو الكلوروفورم.
  14. إضافة زيت الغمر (معامل الانكسار 1.520 عند التصوير عند 37 درجة مئوية، أو 1.516 عند التصوير في RT) إلى 60X 1.42 NA عدسة الهدف (أوليمبوس، اليابان).
  15. الشريحة موقف على المسرح المجهر ووضع التركيز مع خلايا الفائدة.

2. الجزء 2: خلايا التحضير لتصوير لايف

  1. تنمو CWR22 RV1 الخلايا معربا عن الفلورية الخضراء البروتين يقترن ضوء سلسلة 3 (LC3-GFP) في وسائل الإعلام ثقافة RPMI تحتوي على FBS 10٪ و 1٪ على المضادات الحيوية 35 ملم بولي-D-يسين المغلفة أطباق ثقافة زجاج القاع (ماتيك، MA). ينبغي مطلي الخلايا في كثافة كافية لتسهيل الانتشار السريع، ولكن ليس كثيرا أن الخلايا هي متضخمة وتجمعت بحلول موعد التصوير.
  2. علاج عينات الخلية المحددة مع ADI (0.3 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني.
  3. حوالي 1 ساعة قبل التصوير، وتمييع 1.5 ميكرولتر من LysoTracker الأحمر DND-99 (إينفيتروجن، كاليفورنيا) مع 20 مل RPMI. تحتوي على 10٪ FBS و 1٪ المضادات الحيوية. استخدام المحاليل المحتوية على ADI للعينات المختارة. الحارة جميع وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل إضافة إلى الطبق الثقافة.
  4. احتضان الخلايا مع RPMI تحتوي على LysoTracker الأحمر DND-99 ل15-45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. ما يقرب من 30 دقيقة قبل التصوير، بدوره على العلبة البيئية WeatherStation والسماح لتتوازن إلى 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (مع humidifالهواء IED).
  6. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واستبدال وسائل الإعلام مع معيار RPMI FBS تحتوي على 10٪ فقط، و 1٪ المضادات الحيوية. أضف إلى ADI عينات كما هو محدد.
  7. جبل 35 مم ساترة القاع أطباق الثقافة في محول حسب اختيارك (الدقة، وشركة، WA)، وموقف على المسرح المجهر. استخدام زيت الغمر (معامل الانكسار 1.520) على 60X 1.42 NA عدسة الهدف، ووضع الطبق الثقافة التي شنت على خشبة المسرح.

3. الجزء 3: الميكروسكوب Deconvolution وتحليل

بروتوكول في هذا القسم يفترض استخدام DeltaVision الشخصية DV المجهر deconvolution وما يرتبط بها من SoftWorX تطبيق جناح (الدقة، وشركة، WA).

  1. بدوره على نظام المجهر، بما في ذلك محطة اقتناء وحدة تحكم الصك. فتح تطبيق Resolve3D لتهيئة المسرح المجهر وبدوره على مصدر ضوء زينون. سماح 10 دقيقة لمصدر الضوء في عملية الاحماء والوصول إلى ظروف مستقرة.
  2. إضافةقطرة من زيت الغمر (معامل الانكسار 1.520 للعينات الحية عند 37 درجة مئوية أو 1.516 لعينات ثابتة في RT) على 60X 1.42 NA عدسة الهدف، وعينة الشريحة المركز (زلة تغطية الوجه لأسفل) على عدسة الهدف.
  3. إما باستخدام الإضاءة مشرق الميدان أو الخارجية والتركيز الخشنة ضبط مقبض الباب، رفع ببطء عدسة الهدف حتى حبة من النفط الغمر يجعل الاتصال مع غطاء زجاجي مقلوب. (من هذه النقطة، يجب أن تأتي طبقة الخلايا إلى التركيز في غضون بضعة يتحول من التركيز غرامة ضبط مقبض الباب). عند العمل مع عينات ثابتة على الشرائح، فمن المستحسن تجنب الخلايا داخل أي مجال من المجالات مع فقاعات أو بالقرب منها. عند عرض مع عينات حية على طبق زجاج القاع، وتجنب تحريك عدسة الهدف خارج حدود ساترة الزجاج.
  4. ويمكن تحديد Autophagosomes بواسطة EGFP إشارة (الخضراء). ويتم تحديد الجسيمات الحالة من قبل LysoTracker الأحمر (عينة حية) أو الأجسام المضادة الفلورسنت مكافحة Lamp1 (عينة ثابتة). ويتم تحديد نوى الخلايا بواسطة دابي شارعaining (عينة ثابتة).
  5. حدد الحقل المطلوب من الرأي. من الناحية المثالية، ينبغي أن الخلايا تظهر إشارة الفلورسنت جيدة في جميع القنوات المناسبة، وتعلق، وانتشرت على سطح ساترة بحيث محتويات الخلايا من السهل تصور بما فيه الكفاية. تعديلات صغيرة في العاشر الوحشي، Y، Z والتركيز يمكن التحكم عن طريق الكمبيوتر باستخدام واجهة Acquire3D. تعيين binning إلى 1X1 أو 2X2، اعتمادا على الحقل المطلوب من عرض (ويمكن رؤية أكثر من الخلايا في الحقل عند تعيين binning إلى 2X2).
  6. للحصول على صورة معينة من خلال القسم الوسطي للخلية، تعيين المعلمات التعرض (مثل٪ انتقال السلطة وزمن التعرض) مثل أن الحد الأقصى لكثافة بكسل لا يتجاوز 3،000 التهم الموجهة إليه. عموما، يجب تعيين انتقال٪ عند أدنى مستوى ممكن، من دون التطرق الى زمن التعرض المقابلة أكثر من 1 ثانية. كرر هذا الإجراء كل لون مضان ليمكن تصوير ولكل حقل منفصل من أجل الحصول على صور عالية الجودة.
  7. تعيين Uحدود pper والسفلي من Z-مكدس عن طريق ضبط التركيز فقط قليلا عبر الجزء العلوي والسفلي من عينة الخلية، على التوالي. العدد الكلي من الصور في إعطاء Z-مكدس وهكذا يحدده هذه الحدود والتباعد بين الطبقات (القيمة الافتراضية: 0.2 ميكرون).
  8. لتقليل الحركة الفنية خلال الحصول على الصور، ونحن نوصي تحديد طريقة الحصول على الصور ل"الطول الموجي ثم ض المكدس" للعينات ثابتة، و "ض المكدس ثم الطول الموجي" للحصول على عينات حية.
  9. وdeconvolved الصور مضان باستخدام SoftWorX (الدقة التطبيقية، WA) وتحليلها لاحقا باستخدام VoloCITY (الارتجال، والآن بيركن إلمر، MA).

4. جزء 4: سوبر القرار، منظم في الإضاءة (OMX) الميكروسكوب

بروتوكول في هذا القسم ينطبق على استخدام OMX مجهر الإضاءة الهيكلية (الدقة التطبيقية، WA).

  1. تبديل على السلطة الرئيسية والليزر المطلوبة (410 نانومتر، 488 نانومتر، و / أو 532 نانومتر). الانتظار لمدة 20 ميلn للحصول على أشعة الليزر لأن يستقر حراريا.
  2. إضافة زيت الغمر (معامل الانكسار 1.516 للعينات ثابتة في RT) على 60X 1.42 NA عدسة الهدف. إذا كان ينظر إلى فقاعات في قطيرة الزيت، وتنظيف موضوعية وإضافة زيت مرة أخرى.
  3. ضع الشريحة عينة على المسرح وإذا لزم الأمر، والسماح 10 دقيقة للخلايا ليستقر على ساترة.
  4. تهيئة برنامج الاستحواذ. استخدام الإضاءة مضان لضبط التركيز حتى يمكن رؤية الخطوط العريضة الحادة للخلية. (وينبغي توخي الحذر في جميع الأوقات للحد من التعرض للخلايا لإثارة مضان، حتى الحصول على الصور الفعلية).
  5. يمكن الحصول على تفحص فسيفساء دوامة لمعاينة مناطق أوسع من العينة لتحديد الخلايا أو المناطق ذات الاهتمام. فمن المستحسن استخدام مرات التعرض قصير (1-10 مللي ثانية)، وانخفاض القوة الإثارة (0.1-1٪ انتقال)، في حين مسح العينة أو العثور الأهداف.
  6. تحديد autophagosomes بواسطة GFP-LC3 مضان. تحديد الجسيمات الحالة من قبل اليكسا فلور 555 المضادة للLAMP(بروتين غشاء يحلول المصاحب) ونوى الخلايا باستخدام دابي (عينات ثابتة).
  7. اختيار الظروف التجريبية بما في ذلك الطول الموجي الإثارة، مساحة الصورة (على سبيل المثال 512X512)، سمك مكدس، وقت التعرض، ونسبة انتقال الليزر. عن Super الصور حل، وضمان أن يتم تمكين الخيار إضاءة منظم. للفحص المجهري deconvolution على OMX، حدد خيار الإضاءة التقليدية.
  8. للحصول على أفضل النتائج التعمير، حدد الظروف التجريبية مثل أن الحد الأقصى لكثافة عدد ما بين 10،000 و 15،000 خلال عملية الاستحواذ. إذا photobleaching هو مصدر قلق، والتصوير في انخفاض التعرض (التهم بين 5،000 و 10،000) يمكن استخدامها. من الناحية المثالية، ينبغي أن التهم ولا تنقص أكثر من عامل من اثنين خلال اقتناء كامل، وينبغي تجنب انخفاض بأكثر من أربعة أضعاف. إذا لزم الأمر، والحد من سماكة كومة لضمان العد شدة المستدام. الكاميرا التشبع في 64،000 التهم، والحد الأقصى وذلك فيتوتر لا ينبغي أبدا تتجاوز هذا. للحصول على عينات جيدة، وجدنا الظروف التجريبية لتكون 10 ~ 50 ميللي ثانية زمن التعرض مع انتقال الليزر 1٪. ويفضل عينات مشرق وصامد التي يمكن تصويرها مرارا وتكرارا. مطلوب مستقرة وصمة عار لمرور الزمن، سوبر الصور حلها.
  9. للحد من الضوضاء، سرعة قراءات 95MHz (الخيار سرعة متوسطة) واكتساب الوقت من 2 ميللي ثانية أو أكثر يوصى. ويتم الحصول على زيادة الأعمال الفنية المصورة في إعادة بنائها، وعندما يتحرك عينة خلال عملية الاستحواذ. ونتيجة لهذا التأثير، ينصح التعرض القصير لخلايا غير ملتصقة أو سريعة الحركة.
  10. لا يمكن أن يؤديها التصوير متعددة في وقت واحد أو بالتتابع. وهكذا أوصى غلة وضع متتابعة أقل عبر الحديث و.
  11. للحد من photobleaching، فمن المستحسن عموما إلى صورة مع موجات أطول الإثارة الأول (532 نانومتر، 488 نانومتر، ومن ثم 410 نانومتر). ومع ذلك، من أجل النتائج التجريبية هو مبين في الشكل (3)، وكان هذا ترتيب عكسيد (أي 48 نانومتر، 532 نانومتر و 410 نانومتر) وذلك بسبب صمود هذه عينة معينة.
  12. تعيين الحد العلوي / السفلي من Z-مكدس عن طريق تحريك خشبة المسرح المجهر حتى أعلى / أسفل الخلايا قليلا من التركيز. ينبغي أن تعقد المسافة المطلوبة بين كل صورة ثابتة عند 0.125 ميكرون لسوبر القرار التصوير، كبرنامج إعادة الإعمار ستستغرق هذه القيمة كما الافتراضي.
  13. إعادة بناء مداخن صورة باستخدام SoftWorX (الدقة التطبيقية، WA) وتحليل باستخدام VoloCITY 6.0 (بيركن إلمر، MA).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسلسل الصور هو مبين في الشكل 1 يبين التغيرات الجسدية التي تحدث في CWR22 الخلايا خلال 80 دقيقة الأولى من تحريض الالتهام الذاتي. في هذه الدراسات وغيرها (لا يظهر) لاحظنا باستمرار: (1) النزوح من النواة بعيدا عن مركز الخلية، (2) الحد من التصاق نقطة الوصل، و (3) إزفاء العام للautophagosomes والجسيمات الحالة نحو مركز لل الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، لاحظنا أيضا زيادة طفيفة في colocalization (المشار إليها باللون الأصفر) بين autophagosomes (الخضراء) والجسيمات الحالة (الحمراء)...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في حين أن الملاحظة المباشرة من الخلايا المسمى مع تحقيقات الفلورسنت ضد LC3 مقبولة على نطاق واسع كوسيلة القياسية لتأكيد استجابة autophagic 6، والتصوير 3D الكمي من النظام نفسه (كما فعلنا) يقدم معلومات غير مسبوقة والتفاصيل حول عملية معقدة من الالتهام الذاتي الخلوي . على وجه الخصوص، ونحن نلاحظ أن مئات (إن لم يكن الآلاف) من autophagosomes في الخلايا الحية تتشكل في غضون 80 دقيقة من تحريض الالتهام الذاتي. وبالمثل، نلاحظ تغيرات شكلية مثيرة جدا للاهتمام في توزيع المقصورات الليزوز...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدعم المنحة: المعاهد الوطنية للصحة CA165263، المعاهد الوطنية للصحة CA150197، المعاهد الوطنية للصحة CA150197S1 (HJ الكونغ)، NIH CA150197S1 (CA Changou)، NSF PHY-0120999 مركز بيوفوتونيك علوم والتكنولوجيا (DL ولفسون، FYS تشوانغ)، وزارة الدفاع PC073420 (RJ بولد)، والبحوث مجلس النرويج، ييف ايريكسون السفر جرانت 209286/F11 (BS أهلواليا). كما يقر HJ الكونغ بدعم من صندوق أوبورن السرطان جماعة الوقف. كما يقر RJ بولد بدعم من جون ماكدونالد الوقف.

نشكر الدكتور جيني وي جين الكونغ والدكتور بوروسيا ون وو في DesigneRx لتوريد سخية من ADI.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أرجينين ديميناز (ADI)DesigneRx
HEPESSigmaH4034
CaseinSigmaC5890
ParaformaldehydeFisher4042
SaponinSigmaS4521
Alexa مضاد للفأر 555InvitrogenA21422
Alexa مضاد للأرانب 647InvitrogenA21244
LysoTracker أحمر DND-99InvitrogenL7528
مضاد للمصباح 1DSHBH4A3
إشارات خلية مضادة للكاديرين# 3195
SlowFade GoldInvitrogenS36936
35 مم لوحة سفلية زجاجية مطلية ب بولي دي ليسينMatTekP35GC-1.5-1.4-C
رقم 1 ، غطاء 22 ممCorning# 2865-22
شرائح مجهرGlobe Scientific1324G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69 (2), 700-708 (2009).
  2. Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
  3. Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
  4. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
  5. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  6. Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
  7. Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
  8. Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
  9. Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
  10. Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
  11. Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
  12. Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171 (3), 382-388 (2010).
  13. York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9 (7), 749-754 (2012).
  14. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
  15. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8 (12), 1044-1046 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Autophagy Analysis3D Fluorescence MicroscopyProstate Cancer CellsFluorescence ImagingImage Analysis SoftwareWidefield DeconvolutionStructured IlluminationAutophagosome LysosomeQuantitative ImagingLive Cell Imaging

Related Articles