خلية المشارك الثقافة الزخرفة باستخدام مائي مرحلتين أنظمة

Summary

واستخدمت مائي مرحلتين نظم للسكان في وقت واحد نمط متعددة من الخلايا. هذه طريقة سريعة وسهلة للخلية الزخرفة يستفيد من فصل مرحلة من المحاليل المائية للجلايكول والبولي ايثيلين ديكستران والتوتر السطحي القائمة بين حلول البوليمر اثنين.

Abstract

سوف تكون هناك حاجة التكنولوجيات الزخرفة الخلية التي هي سريعة وسهلة الاستخدام وبأسعار معقولة للتنمية المستقبلية للفحوصات عالية الإنتاجية الخلية، ومنصات لدراسة الخلية خلايا الأنسجة التفاعلات ونظم الهندسة. يصف هذا البروتوكول طريقة مفصلة لتوليد المشترك الثقافات من الخلايا باستخدام حلول حيويا من ديكستران (DEX) والبولي اثيلين جليكول (PEG) أن التخلص منفصلة عند دمجها أعلاه تركيزات العتبة. ويمكن نمط الخلايا في مجموعة متنوعة من التشكيلات باستخدام هذا الأسلوب. لا يمكن أن يؤديها الخلية الزخرفة الاستبعاد عن طريق طباعة قطرات من DEX على ركيزة وتغطيتها بمحلول مكون من خلايا تحتوي على PEG. التوتر السطحي شكلت بين حلول البوليمر سببين الخلايا في الانخفاض في جميع أنحاء خارج الحبرية DEX وتشكيل المقاصة دائرية التي يمكن استخدامها لفحوصات الهجرة. يمكن منقوشة جزر خلية الاستغناء مرحلة DEX الخلية الغنية في حل PEG أو من خلال تغطية DEXالقطرة بمحلول مكون من PEG. يمكن أن تتكون شارك في الثقافات مباشرة من خلال الجمع بين الخلايا مع استبعاد الزخرفة الجزيرة DEX. هذه الأساليب متوافقة مع مجموعة متنوعة من النهج التعامل مع السائل، بما في ذلك micropipetting دليل، ويمكن استخدامها مع أي نوع من الخلايا تقريبا ملتصقة.

Introduction

مائي على مرحلتين نظم (ATPSs) شكل عند خلط الحلول اثنين من البوليمرات غير متوافقة معا في تركيزات عالية بما فيه الكفاية. ويتأثر فصل المرحلة عن طريق مجموعة متنوعة من العوامل التي تشمل الوزن الجزيئي وقطبية من البوليمرات، ودرجة الحرارة من درجة الحموضة والحلول والمحتوى الأيونية من المذيب المائي ^{1 و 2.} النقطة التي يتم تحديد حلين البوليمر منفصلة من الخصائص الفيزيوكيميائية لنظام اختيار المرحلة، ولكن يحدث عادة على تركيزات منخفضة البوليمر (أقل من 20٪ بالوزن / WT) في ظل ظروف غير يبدل طبيعة، السماح باستخدام التكنولوجيا الحيوية لATPSs تطبيقات ^3-9.

حتى الآن على نطاق واسع الأكثر دراسة ATPS هو البولي ايثيلين جلايكول (PEG) / ديكستران النظام (DEX). وقد وصفت في الأصل ATPS التي شكلتها هذه البوليمرات غير مكلفة وحيويا لتنقية الجزيئات الحيوية عن طريق تقسيم الجزيئية ^{2 و 10.} تقسيميحدث عند خلط جزيئات إضافية أو الجزيئات التي لا تساهم في النظام مع المرحلة PEG وDEX. على أساس الانتماءات النسبية لأي DEX أو PEG، فإن الجزيئات أو الجسيمات الموجودة تفضيلي ضمن واحدة من المرحلتين أو في الواجهة. خاصية أخرى من ATPS PEG / DEX هو وجود التوتر السطحي بين مراحل البوليمر اثنين. ATPSs التي شكلتها PEG وDEX عرض التوترات عموما بينية التي هي أقل بكثير من غيرها من نظم على مرحلتين بين السوائل مثل النفط والمياه، إلا أن القوات لا تزال تمارس التوتر السطحي على آثار جزيئات صغيرة مثل الفيروسات والخلايا والمجاميع البروتين ^{2 ، 11-13.} وأخيرا، منذ ارتفاع الوزن الجزيئي وPEG DEX منفصلة في تركيزات منخفضة (أقل من 5٪ بالوزن / WT عالية الوزن الجزيئي البوليمرات أصناف) في وجود تركيزات الفسيولوجية للأملاح، هناك عدد قليل إذا أي آثار ضارة على خلايا الثدييات أدرجت ضمن هذه نظم^14-16.

مؤخرا، تم تطبيق خصائص وتأثيرات بينية من تقسيم ATPSs من مختبرنا للتنميط خلية ^{14، 16-20.} وتم ذلك عن طريق حل micropatterning DEX أكثر كثافة على ركائز ثقافة الخلية في وجود PEG. عندما تدمج الخلايا في مرحلة PEG، فهن مستبعدات من دخول قطرات DEX بسبب PEG / DEX التوتر السطحي ^20. عندما يتم منقوشة الخلايا في مرحلة التنفيذ المباشر، يتم الاحتفاظ بها على سطح الخلية الركيزة الثقافة عن طريق تقسيم التوتر السطحي ^{و16، 17، 19.}

وعلى النقيض من الأساليب الأخرى لخلية الزخرفة، الزخرفة ATPS خلية من السهل تعلم، ويتطلب فقط معرفة أولية حول البوليمرات أنفسهم، والقدرة على أداء زراعة الخلايا واستخدام micropipettor. أساليب أخرى للتنميط الخلية غالبا ما تنطوي على المعدات المتخصصة والتدريب التي لا تترجم بسهولة إلى اله علوم الحياة. على سبيل المثال، بعض الطرق (microcontact الطباعة النافثة للحبر الطباعة أو) الخلايا بشكل غير مباشر من خلال تطبيق نمط أنماط الجزيئات الحيوية لاصقة خلية إلى الركيزة التي تخدم الثقافة فيما بعد مواقع لمرفق الخلية ^{21 و 22.} على الرغم من النهج غير المباشرة مفيدة لبعض أنواع الخلايا، فإنها تتطلب درجة عالية من المهارة المستخدم والمعدات المتخصصة لصنع أداة الزخرفة، ويمكن أن تفتقر خصوصية تبعا لنمط معين نوع / جزيء حيوي الخلية. بدلا من ذلك، يتم إيداع الخلايا مع خصوصية عالية عن طريق نمط من النهج الزخرفة المباشرة التي تشمل تدفق الصفحي الزخرفة، الطباعة بالستينسيل والطباعة النافثة للحبر ^23-26. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات تتطلب أيضا خبرة المستخدم والمعدات المتخصصة، ويمكن أن يتلف الخلايا أثناء عملية الطباعة. على الرغم من أن هذه المناهج عموما إنتاج أنماط دقيقة من الخلايا، على سبيل الزخرفة الخلية إلى أن تكون أداة مفيدة في علوم الحياة، يجب أن يكون فعالة من حيث التكلفة لبسيطة لتنفيذ الثانية.

نحن هنا تقرير مفصل بروتوكول لتوليد نمط مزارع الخلايا باستخدام ATPSs وصفها في تطبيقاتنا التي صدرت سابقا. باستخدام micropipettors فقط، يمكن للمستخدمين إنشاء مناطق الحظر الخلية أو الخلايا الجزر لفحوصات الهجرة. ويتحقق هذا عن طريق PEG / DEX التوتر السطحي أن يحتفظ إما الخلايا في مرحلة التنفيذ المباشر أو يستثني الخلايا المودعة في المرحلة PEG من DEX. من هذه تمشيط اثنين من التقنيات الأساسية الزخرفة، فمن الممكن لتوليد بسرعة شارك في الثقافات من الخلايا مثل الخلايا الليفية الخلايا الكبد شارك في الثقافات. أساليب الزخرفة وصفها، ATPS المعلمات والنتائج المتوقعة بالتفصيل.

Protocol

1. المرحلة توصيف النظام: تحديد عتبات للفصل المرحلة

1. إعداد محاليل تحتوي على PEG وDEX في المخزن المؤقت المطلوب أو خلية ثقافة المتوسط ​​كما هو موضح في الشكل 1 (النقاط البنفسجية) في 15 مل أو 50 مل المخروطية أنابيب. الآخرة، وسوف PEG وDEX الرجوع إلى PEG كيلو دالتون 35 و 500 كيلو دالتون DEX، ومع ذلك، سوف تتغير تركيزات الحرجة اعتمادا على البوليمرات اللتين استخدمتا. تسجيل كتلة PEG وDEX في كل حل. قد عالية التركيز حلول البوليمر يستغرق عدة ساعات ليذوب. ويمكن استخدام المصل لVortexing خالية الحلول. وسائل الإعلام التي تحتوي على البروتينات أو مصل، ضع الأنابيب في مرحلة تعصف حتى يتم حل كل البوليمرات بشكل كامل. سجل وزن وسائل الإعلام المستخدمة لإذابة البوليمرات وتحيط علما تركيزات الأولي.
2. مرة واحدة يتم حل الكامل للبوليمرات، ينبغي أن تظهر حلول غائم. هذا هو أول إشارة إلى أن فصل المرحلة حدث. لتأكيد هذا، والسماح للالبوليمر حلول للراحة في وضع عمودي في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ويمكن استخدام الطرد المركزي في 1000 x ج لتسريع عملية فصل المرحلة. سوف يكون أكثر كثافة مرحلة القاع DEX الغنية والمرحلة الأعلى سيكون PEG الغنية.
3. إضافة ببطء عازلة إضافية أو وسائل الإعلام إلى الأنابيب. وينبغي أن تستخدم زيادات صغيرة حتى لا يقفز نقطة فصل المرحلة.
4. عندما يصبح واضحا الحل لم يعد والتخلص يفصل بعد الطرد المركزي، تم الوصول إلى عتبة مرحلة الانفصال. تسجيل الوزن النهائي من الأنبوب.
5. باستخدام الأوزان السابقة المسجلة للبوليمرات، جنبا إلى جنب مع الوزن النهائي بعد إضافة وسائل الإعلام، وتحديد وزن٪ / وزن كل البوليمرات التي اثنين من فصل المرحلة لن يحدث.
6. رسم هذه القيم كما PEG WT / WT٪ على DEX WT / WT المحور ص و٪ على المحور س. ويمكن استخدام هذه المؤامرة، والمعروفة باسم منحنى binodal، لتحديد عتبة التركيز لفصل المرحلة لconcentrati مختلفةإضافات من PEG / DEX في وسط الخلية ثقافة محددة.

2. التكوين 1: زخرفة استبعاد (96 لوحة جيدا تنسيق)

1. إعداد الحلول منفصلة من 5.0٪ بالوزن / WT PEG و12.8٪ بالوزن DEX / WT في مستنبت الخلية. ATPS استخدام الحلول من وجهة نظر على الأقل مرتين الحرجة لضمان أن يظل ATPS بعد البوليمرات تتوازن مع الاحترام لبعضهما البعض. هناك كمية صغيرة من تدفق DEX في المرحلة PEG الغنية والعكس بالعكس، لذلك، والعمل أيضا بالقرب من تركيز الحرجة يمكن أن يؤدي إلى فقدان النظام وانخفاض تركيزات المرحلة أدناه نقطة حرجة. وبالمثل، يمكن نقل الطبق الثقافة الخلية الحاضنة إلى الرطوبة ودرجة الحرارة التي تسيطر عليها تغيير خصائص مرحلتين وجعل الحلين غير قابلة للامتزاج. ملاحظة: بعض الخلايا قد تؤدي بشكل أفضل مع تركيبات ATPS أخرى. ويمكن اختيار الصيغ مقبولة على أساس منحنيات binodal تحديدها من الجزء 1.
2. حصاد الخلايا لاستخدامها في patte الاستبعادrning. تحديد العدد الإجمالي / تركيز الخلايا المتاحة. اختياري: تسمية الخلايا مع CellTracker أو غيرها من التسميات غير السامة للخلايا للفحص المجهري مضان.
3. بيليه الخلايا و resuspend بيليه في حجم مناسب من 5.0٪ الوتد لتحقيق الرقم المطلوب من الخلايا للاستبعاد. على سبيل المثال، واحدة من لوحة جيدا 96-جيدا يتطلب أن يكون معلق الخلايا الليفية 37500 في 200 ميكرولتر من PEG لإنتاج التقاء في اليوم التالي. توسيع نطاق هذه الأرقام بما يتناسب مع أنواع الخلايا الأخرى والأحجام الركيزة الثقافة.
4. باستخدام micropipettor، الاستغناء 0،5 ميكرولتر من قطرات DEX على ركيزة الثقافة الخلية الجافة. قطرات أكبر حجم إنتاج أكبر مناطق الاستبعاد. ويوصى قطرات تتراوح في حجمها 0،1 حتي 1 ميكرولتر لmicropatterning الاستبعاد. اختياري: يمكن إيداع قطرات DEX 24 ساعة قبل الموعد المحدد ويسمح لليذوى في درجة حرارة الغرفة. وهذا يمكن أن تنتج أنماط أنظف.
5. 200 ميكرولتر من الاستغناء تعليق الخلية إلى PEG روأشار إلى أن تغطية قطرات DEX.
6. مكان في الحاضنة لمدة 12 ساعة مرطب عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO _2. تأكد من أن لا يميل الطبق أثناء التداول والتي يتم وضعها على الرف حاضنة مستوى لتفادي تعطيل الأنماط.
7. إزالة الحل PEG ويغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من ثقافة المتوسط.
8. إضافة جديدة متوسطة الثقافة والعودة إلى الحاضنة.
9. رصد الثقافات دوري لمراقبة حركة الخلية في منطقة الحظر.

3. التكوين 2: زخرفة جزيرة (96 لوحة جيدا تنسيق)

1. إعداد الحلول من 5.0٪ بالوزن / WT PEG و12.8٪ بالوزن DEX / WT في مستنبت الخلية، على النحو الوارد أعلاه.
2. حصاد الخلايا لاستخدامها في الزخرفة الجزيرة. تحديد العدد الإجمالي / تركيز الخلايا المتاحة.
3. بيليه و resuspend الخلايا في وحدة تخزين مناسبة من DEX 12.8٪ لتحقيق التركيز المطلوب من الخلايا لتنميط الجزيرة. تركيزات من 5،000 مويوصى LLS / ميكرولتر أو أقل لأنواع الخلايا الملتصقة بقوة. قد لاعتبار الخلايا التي يجدون صعوبة في إرفاق أو الخلايا التي تلتزم فضفاضة، تركيزات تصل إلى 10،000 خلية / ميكرولتر.
4. العمل بسرعة لتجنب التجفيف، ماصة قطرات 0،5 ميكرولتر من DEX على ركيزة الثقافة الخلية الجافة، كما هو موضح أعلاه. لا تسمح قطرات لتجف. اختياري: يمكن إضافة 200 ميكرولتر من محلول PEG إلى البئر في وقت مبكر. ويمكن بعد ذلك قطرات DEX تودع في حل PEG حيث أنها سوف تنزل الى القاع والاتصال سطح الثقافة. وهذا يمكن أن تنتج أنماط أنظف الجزيرة.
5. تغطية قطرات DEX مع 200 ميكرولتر من PEG.
6. مكان في الحاضنة لمدة 12 ساعة مرطب عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO _2. تأكد من أن لا يميل الطبق أثناء التداول والتي يتم وضعها على الرف حاضنة مستوى لتفادي تعطيل الأنماط.
7. إزالة الحل PEG ويغسل ثلاث مرات مع 200 ميكرولتر من ثقافة المتوسط.
8. إضافة ثقافة جديدةالمتوسطة والعودة إلى الحاضنة.
9. رصد الثقافات دوري لمراقبة حركة الخلايا وانتشار الخارج من الجزر.

4. تكوين 3: استبعاد المشارك الثقافات (96 لوحة جيدا تنسيق)

1. إعداد الحلول من 5.0٪ بالوزن / WT PEG و12.8٪ بالوزن DEX / WT في مستنبت الخلية، على النحو الوارد أعلاه.
2. حصاد الخلايا لاستخدامها في الزخرفة الإقصاء والجزيرة. تحديد العدد الإجمالي / تركيز الخلايا المتوفرة لكل نوع من الخلايا. اختياري: بعض أزواج الخلية قد يعرض مؤشرات انتشار مختلفة بشكل كبير. لمنع خلايا استبعادها من overpopulating على نمط الخلايا الجزيرة (وخاصة بالنسبة للثقافات على المدى الطويل)، وعلاج الخلايا المستخدمة لاستبعاد مع C لمدة 2 ساعة ميتوميسين أو أشرق لهم قبل الحصاد. وهذا منع الانتشار. ويمكن استخدام الأصباغ الفلورية CellTracker للتمييز بين السكان اثنين من خلية إذا لزم الأمر.
3. بيليه الخلايا و resuspend بيليه لexclusioن الزخرفة في حجم مناسب لPEG 5.0٪ لتحقيق الرقم المطلوب من الخلايا، على النحو الوارد أعلاه. إعادة تعليق بيليه لجزيرة الزخرفة في حجم مناسب لDEX 12.8٪ لتحقيق التركيز المطلوب من الخلايا، على النحو الوارد أعلاه.
4. باستخدام micropipettor، الاستغناء 0،5 ميكرولتر من قطرات التعليق الخلية DEX على ركيزة الثقافة الخلية الجافة. لا تسمح قطرات لتجف.
5. تغطية قطرات DEX مع 200 ميكرولتر من تعليق الخلية PEG.
6. مكان في الحاضنة لمدة 12 ساعة مرطب عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO _2. تأكد من أن لا يميل الطبق أثناء التداول والتي يتم وضعها على الرف حاضنة مستوى لتفادي تعطيل الأنماط.
7. إزالة الحل PEG ويغسل ثلاث مرات في 200 ميكرولتر من ثقافة المتوسط.
8. إضافة جديدة متوسطة الثقافة والعودة إلى الحاضنة.
9. رصد شارك في الثقافات لمراقبة التفاعل بين السكان الخلية. يمكن إعداد الضوابط قبل تنفيذ استبعاد أو فردي الجزيرة الزخرفة: اختياريidually، من خلال المشاركة في الثقافة الخلايا التي لا تتفاعل أو عن طريق منع المسارات التاريخية في السكان خلية واحدة أو كليهما قبل أو بعد الزخرفة.

Results

لتحديد توليفة مناسبة من PEG والزخرفة DEX لخلية من المهم لتحديد منحنى binodal. هذا المنحنى يحدد النقاط التي يمكن أن تشكل على ATPS ويمكن أن تختلف لمجموعة معينة من البوليمرات على أساس درجة الحموضة، ودرجة الحرارة والمحتوى الأيونية. زراعة للخلايا التي تتطلب تركيبات مخصصة المتوسطة قد يكون من الضروري لتحديد منحنى binodal تجريبيا. يتم ذلك عن طريق توليد سلسلة من ATPSs التي هي بعيدة عن binodal ومتفاوتة في PEG ومحتويات DEX (الشكل 1، والدوائر البنفسجية). عندما ATPS هو الحاضر،...

Discussion

وmicropatterning الخلية ATPS الأسلوب يتطلب القليل جدا من الخبرة وراء الكفاءة في تقنيات زراعة الخلايا ويمكن أن يتقن بسرعة. مزايا هذا النهج هي أن أنها غير مكلفة وسريعة ومتوافقة مع مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا وصيغ الثقافة. لهذه الأسباب، ينبغي لنا اعتمد بروتوكول بسهولة من قبل علماء الحياة، وخاصة أولئك الذين يدرسون تكاثر الخلايا، والهجرة والكيميائي، وتأثير التفاعلات juxtacrine ونظير الصماوي بين السكان الخلية. ويمكن للفحوصات المقدمة هنا كميا بسهولة في الخلية مستوى السكان باستخدام معي...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
كاشف	الصانع
ديكستران 500،000 كيلو دالتون	Pharmacosmos، الدنمارك
البولي ايثيلين جلايكول 35000 كيلو دالتون	سيغما الدريخ، سانت لويس، MO
الحله	ATCC، ماناساس، VA
HepG2 C3A	ATCC، ماناساس، VA
3T3 المعاهد الوطنية للصحة	ATCC، ماناساس، VA
خلية المقتفي	إينفيتروجن، كارلسباد، CA
DMEM	Gibco، كارلسباد، CA
RPMI	Gibco، كارلسباد، CA
F12	Gibco، كارلسباد، CA
المصل البقري الجنين	Gibco، كارلسباد، CA