مقالة منهجية

جيل من لقاح جديد للخلايا التشجرية باستخدام الميلانوما والخلايا الجذعية السرطانية الحرشفية

11.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/50561

⸱

يناير 6, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Michigan, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, 3Department of Otolaryngology, University of Michigan

في هذه المقالة

ملخص

أظهر لقاح الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) القائم على الخلايا التشعبية (DC) الذي تم تقييمه في مضيفي الخلايا المناعية النجينية مناعة مضادة للورم أعلى بكثير من لقاحات DC التقليدية النابضة بخلايا الورم السائبة غير المتجانسة.

الملخص

حددنا الخلايا الجذعية السرطانية (CSC) الغنية من المورين الميلانوما D5 syngeneic إلى C57BL/6 الفئران والسرطان الحرشفي SCC7 syngeneic إلى الفئران C3H باستخدام ALDEFLUOR / ALDH كعلامة، واختبار المناعة باستخدام تحلل الخلية كمصدر للمضادات لنبض الخلايا المستنعرة (DCs). DCs نبض مع ALDHعالية CSC lysates تسبب أعلى بكثير مناعة مضادة للورم واقية من DCs نبض مع lysates من ليسات الخلايا السرطانية كلها غير مفرزة في كل من النماذج وفي وضع الانبثاث الرئة وs.c. وضع نمو الورم، على التوالي. وكانت هذه الظاهرة بسبب الاستجابات الفكاهية الناجمة عن لقاح CSC وكذلك الاستجابات الخلوية المضادة ل CSC. على وجه الخصوص ، أنتجت الطحال المعزولة عن المضيف الخاضع للقاح CSC-DC كمية أعلى بكثير من IFNγ و GM-CSF من الخلايا الطحال المعزولة عن المضيف التي تخضع للقاح خلايا الورم غير المفرزة. تدعم هذه النتائج الجهود الرامية إلى تطوير لقاح علاجي قائم على CSC للاستخدام السريري في بيئة مساندة.

المقدمة

الخلايا الجذعية السرطانية هي مقاومة نسبيا للعلاج الكيميائي التقليدي والعلاج الإشعاعي1,2. من ناحية أخرى، قد يكون هذا السكان من الخلايا الخلايا المسؤولة عن الانتكاس وتطور السرطان بعد علاجات السرطان التقليدية1-4. بسبب عدم التعبير عن مستضدات الورم المتمايزة على الخلايا الجذعية السرطانية ، قد تفلت الخلايا الجذعية السرطانية من التدخلات المناعية الحالية للعلاج للسرطان ، والتي تم تصميمها في الغالب لاستهداف المستضدات على الخلايا السرطانية المتمايزة. لذلك، قد يحمل وضع استراتيجيات جديدة تستهدف الخلايا الجذعية السرطانية وتدميرها وعودا بزيادة الفعالية العلاجية لعلاج السرطان الحالي. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بعزل مجموعات الخلايا الجذعية السرطانية المخصبة من ورمين حيوانيين (سرطان الجلد D5 وسرطان الخلايا الحرشفية SCC7)، واستخدمناها كمصدر مستضد لنبض خلايا تقديم المستضد (الخلايا التغصنية، DC) لإعداد لقاح CSC-TPDC. ثم قمنا بتقييم مناعة مضادة للورم الناجمة عن لقاح CSC-TPDC في مضيفي الكومبييت المناعي السينغيني والفئران B6 والفئران C3H على التوالي. تمت مقارنة فعالية مضاد التومور الناجم عن CSC-TPDC مع لقاح DC التقليدي النابض بالليست من الخلايا السرطانية غير المتجانسة غير المحصنة (H-TPDC) ، والذي سبق استخدامه من قبل مجموعتنا5،6، وكذلك من قبل محققين آخرين7 في كل من الدراسات قبل السريرية وفي التجارب السريرية.

البروتوكول

1. ALDEFLUOR تلطيخ

  1. إعداد عينة الخلية: إعداد تعليق خلية واحدة من الخلايا السرطانية، إما من الخلايا السرطانية المستزرعة أو من عينات الورم الطازجة. عد الخلايا وضبط تعليق الخلية إلى تركيز 1 × 106 خلايا / مل في ALDEFLUOR المقايسة المخزن المؤقت.
  2. تسمية أربعة أنابيب اختبار البوليسترين 12 ملم × 75 ملم كما أنابيب التحكم على النحو التالي: #1: غير ملطخة، #2: ALDEFLUOR، #3: ALDEFLUOR بالإضافة إلى دياب، #4: 7AAD.
  3. بالنسبة لأنابيب التحكم هذه، ضع تعليق الخلية 1 مل في #1 #4، ولكن 2 مل في #2 الأنبوب. إضافة 5 ميكرولتر دياب (مثبط ALDH) في أنبوب #3 والحفاظ على الجليد. ثم إضافة 10 ميكرولتر تنشيط الركيزة ALDEFLUOR أنبوب #2، مزيج ونقل فورا 1 مل من الخليط إلى أنبوب #3.
  4. في الوقت نفسه، إضافة 2 ميكرولتر تنشيط الركيزة ALDEFLUOR لكل مليون خلية إلى بقية الخلايا (أنابيب العينة) أيضا في 1 × 106 خلايا / مل في ALDEFLUOR المقيس العازلة.
  5. احتضان كل من أنابيب التحكم 4 وأنابيب العينة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية حمام مائي.
  6. بعد الحضانة، أضف 5 ميكرولتر 7AAD إلى أنبوب التحكم #4، و1 ميكرولتر 7AAD 1 × 106 خلايا إلى أنبوب العينة. حضانة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.
  7. أجهزة الطرد المركزي جميع الأنابيب لمدة 5 دقائق في 250 × ز وإزالة supernatant.
  8. إعادة الإنفاق الخلايا في ALDEFLUOR المقادير المقايسة المخزن المؤقت.
  9. إجراء الفرز القائم على قياس التدفق الخلوي.
  10. تعيين بوابات الفرز باستخدام ALDEFLUOR الخلايا الملطخة تعامل مع DEAB والتحكم السلبي و يوديد البروبيديوم (PI) 7AAD- الخلايا الملطخة للسيطرة على البقاء. وبناء على هذه الضوابط، تم إنشاء بوابة للتمييز بين ALDEFLUOR + / ALDHعالية،D5 وخلايا SCC7. سيتم استخدام هذه البوابات بعد ذلك لفرز جميع الخلايا عينة أعدت أعلاه ل ALDEFLUOR + / ALDHعالية D5 و SCC7 الخلايا.

2. إعداد لقاح الخلايا الجذعية السرطانية Lysate-pulse الخلايا التدينية (CSC-TPDC)

  1. فئران القتل الرحيم (Syngeneic B6 و C3H، على التوالي) باستخدام CO2 وعزل عظام عظم الفخذ والساق.
  2. وضع العظام في الإيثانول 75٪ لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم غسل العظام باستخدام HBSS.
  3. قطع الرأس العظام واستخدام إبرة 21 G ومحقنة 10 مل لدفع الخلايا في طبق.
  4. أسبيرات وتفجير الخلايا باستخدام الحقنة لجعل تعليق خلية واحدة.
  5. بعد الطرد المركزي في 1500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق، تجاهل supernatant. ثم إضافة 5 مل تحلل RBC العازلة لتحلل RBC لمدة 1 دقيقة في 37 °C حمام مائي.
  6. عد عدد الخلايا وضبط تعليق الخلية إلى تركيز 1 مليون خلية / مل في المتوسطة كاملة (CM) التي تحتوي على 10 نانوغرام / مل GM-CSF و 10 نانوغرام / مل IL-4.
  7. ثقافة الخلايا وتعويض CM بالإضافة إلى IL-4 وجنرال موتورز-CSF 3 أيام في وقت لاحق.
  8. في اليومالخامس، احصد الخلايا التشجرية غير الناضجة (DCs) واستعد وسيط عزل DC الذي يحتوي على محلول 4.2 مل C بالإضافة إلى 1 مل متوسط تدرج كثافة OptiPrep.
  9. تعليق الكريات الخلية في 5 مل CM. إضافة تعليق الخلية على العزلة المتوسطة ببطء. جهاز طرد مركزي عند 2000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. جمع DCs بين CM والعزلة المتوسطة. عد عدد الخلايا وضبط تعليق الخلية إلى تركيز 1 مليون خلية / مل في المتوسطة الثقافة التي تحتوي على 10 نانوغرام / مل GM-CSF و 10 نانوغرام / مل IL-4.
  11. إعداد lysates الورم عن طريق تعليق ALDHعالية أو غير مفرزة D5 أو SCC7 الخلايا في المتوسطة الثقافة وتخضع للتعرض السريع تجميد ذوبان أربع مرات تليها تدور في ∼100 × ز لمدة 5 دقائق لجمع جزء الغشاء من اللسحات.
  12. لإعداد CSC-TPDC، نبض DCs مع lysate من ALDH الخلاياالعالية ذاتية. لإعداد H-TPDC، نبض DC مع lysate الخلايا السرطانية غير المتجانسة غير المشتتة. نسبة DC إلى lysate الخلايا السرطانية هي نفسها.

3. التطعيم وتقييم فعالية

  1. تطعيم الفئران B6 العادية على التوالي مع 2500 D5 CSC-TPDC أو D5 H-TPDC الخلايا السرطانية تحت الجلد(ق.c.). تطعيم الحيوانات C3H العادية ق.c. مع 5000 SCC7 CSC-TPDC أو SCC7 H-TPDC الخلايا السرطانية، على التوالي.
  2. بعد التطعيم، تحدي الفئران B6 مع الخلايا السرطانية D5 غير متجانسة أي القتل الرحيم الفئران باستخدام CO2 20 أيام في وقت لاحق. حصاد الرئتين وعدد الانبثاث الرئة.
  3. في نموذج SCC7 ، تحدي فئران C3H مع خلايا ورم SCC7 غير المفحصة .c على الجانب الآخر من لقاح DC. مراقبة حجم الورم.
  4. في نهاية التجارب القتل الرحيم الفئران B6 و C3H باستخدامثانيأكسيد الكربون . في اليوم 34 بعد اللقاح الأول ، قتل الفئران معثانيأكسيد الكربون ، وفي الوقت نفسه جمع الطحال من كل مجموعة مع إجراء مطهر.
  5. تنشيط الطحال T و / أو B الخلايا مع شل الحركة المضادة للCD3 بالإضافة إلى مكافحة CD28 mAbs في CM التي تحتوي على hrIL-2 أو LPS بالإضافة إلى مكافحة CD40 (FGK45) استسقاء ماب.
  6. بعد التنشيط، جمع المضادات الفائقة واستخدامها في الفحص ELISA.
  7. بالنسبة إلى فحص ELISA، لوحات المعطف مع الأجسام المضادة لIFNа، GM-CSF وIgG عند درجة حرارة 4 °C O/N.
  8. بعد تطبيق العازلة حجب، إضافة عينات ومعايير واحتضان في درجة حرارة الغرفة.
  9. غسل لوحة وإضافة الأجسام المضادة الكشف HRP وركيزة TMB لاحتضان.
  10. قياس الامتصاص على قارئ لوحة ELISA في 450 نانومتر في غضون 30 دقيقة بعد وقف رد الفعل.

النتائج

ALDEFLUOR /ALDH وقد استخدمت كعلامة واحدة لعزل الخلايا الجذعية في الأورام الخبيثة متعددة8-11. حددنا مجموعات الخلايا الجذعية المخصبة بالسرطان في نموذجين للورم D5 و SCC7 باستخدام ALDEFLUOR كعلامة. اكتشفنا ALDEFLUOR + الخلايا في سرطان الجلد مورين B16-D5 وسرطان الخلايا الحرشفية SCC7. وجدنا أن ALDEFLUOR + الخلايا تسهم ما يقرب من 0.5٪ و 5.2٪ في خطوط الخلايا السرطانية D5 و SCC7 المستزرعة، على التوالي (الشكل 1). تم تحليل الخلايا السرطانية التي تم حصادها حديثا من الأورام الراسخة لتأكيد وجود خلايا ALDEFLUOR+ . كما هو مبين أيضا في الشكل 1، كان هناك 2.5 ٪ و 4.2 ٪ من خلايا ALDEFLUOR + من في الجسم الحي أنشئت D5 و SCC7 الأورام ، على التوالي. تم تقييم الورم وقدرة التجديد الذاتي لهذه الفئاتالسكانية العالية D5 و SCC7 ALDEFLUOR +/ALDH في مضيف النجيم المناعي السينغي ، فئران C57BL/6 و C3H ، على التوالي8.

لقد استخدمنا غير متجانسة غير المفرغة خلية الورم lysate لنبض DC (H-TPDC) سواء في الدراسات الحيوانية والتجارب السريرية5,6. لدراسة المناعة من CSCs، قمنا بعزل ALDHعالية CSC ونبض DC مع lysate من CSCs لتوليد CSC-TPDC (الشكل 2) واستخدم H-TPDC كتحكم لقاح السرطان التقليدية لاختبار ما إذا كان CSC-TPDC له أي تأثير مفيد في منع نمو الورم.

قمنا بتقييم المناعة من CSCs من خلال فحص المناعة المضادة للورم الوقائي الناجمة عن CSC-TPDC. في نموذج D5 ، تم تطعيم الفئران ذات القدرة المناعية الساذجة .c مع CSC-TPDC أو H-TPDC (بنفس النسبة: DC). تلقت مجموعات التحكم المالحة (PBS). بعد أسبوع واحد من اللقاح الأخير ، تم تحدي الفئران بخلايا ورم D5 غير مفرزة عن طريق الوريد(أي v.) ، وتم حصاد الرئتين بعد 3 أسابيع لتعداد الانبثاث الرئوي. كما هو مبين في الجدول 1، مقارنة مع مجموعة PBS ، الفئران المعالجة ب H-TPDC طورت انبثاث الرئة أقل. والأهم من ذلك أن الفئران التي عولجت ب CSC-TPDC كان لديها نقائل رئوية أقل بكثير من مجموعة لقاح H-TPDC في كلتا التجربتين. في نموذج SCC7 ، تم تطعيم C3H العادية .c مع SCC7 CSC-TPDC أو H-TPDC على التوالي على الجناح الأيمن ، تليها تحدي مع خلايا ورم SCC7 غير المفحذة .c في الجناح الأيسر. بالمقارنة مع مجموعة PBS، H-TPDC المستحثة متواضعة المضادة للورم الحصانة ضد نمو الورم. ومع ذلك، كان هناك تثبيط كبير لنمو الورم في الفئران التي عولجت مع CSC-TPDC بالمقارنة مع كل من مجموعة التحكم ومجموعة H-TPDC (p<0.05، الشكل 3). وتشير هذه النتائج إلى أنه يمكن استخدام مركبات الكربون الكلورية فلورية كمصدر مستضد أكثر فعالية لتحميل الخلايا السرطانية من الخلايا السرطانية التقليدية غير المفحوسة في تحفيز المناعة الوقائية ضد تحدي الخلايا السرطانية.

لمزيد من الفهم للآليات الكامنة وراء المناعة الوقائية المضادة للورم التي يسببها CSC ، حصدنا الطحال من الحيوانات التي خضعت لتطعيمات DC في نهاية التجارب. ثم تم تنشيط خلايا الطحال بواسطة مكافحة CD3/CD28/IL-2 أو المضادة CD3/CD28/IL-2 + LPS/ANTI-CD40. ثم تم جمع المضادات الثقافية للكشف عن التعبير عن السيتوكينات والأجسام المضادة.  كانت هناك إنتاجات أعلى بكثير من IFNа و GM-CSF من قبل خلايا الطحال من الحيوانات التي تم تطعيمها مع D5 CSC-TPDC أو SCC7 CSC-TPDC(الشكل 4). وعلاوة على ذلك، كان هناك بشكل ملحوظ (p<0.05) إنتاج IgG أعلى من قبل LPS/ANTI-CD40 خلايا الطحال المنشط التي تم جمعها من الحيوانات التي تم تطعيمها مع D5 CSC-TPDC أو SCC7 CSC-TPDC مقارنة مع D5 H-TPDC أو SCC7 H-TPDC. وتبين أن هذه الأجسام المضادة ترتبط بمركبات الكربون الكلورية فلورية D5 وSCC7 على التوالي، ويمكن أن يؤدي هذا الربط إلى تحلل CSC في وجود مكمل8.

figure-results-1
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 تم الكشف عن ALDHFLUOR +/ALDHارتفاع السكان في المستزرعة وكذلك حصادها حديثا الطازجة مورين D5 سرطان الجلد وأورام الخلايا الحرشفية SCC7. تم استخدام الخلايا السرطانية المعالجة ب 50 ملليمول / لتر DEAB ، وهو مثبط ALDH محدد ، كعنصر تحكم سلبي. انقر هنا لعرض صورة أكبر. 

figure-results-2
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم توليد لقاحات الخلايا الجذعية السرطانية القائمة على الخلايا التشعبية. لإعداد CSC-TPDC و H-TPDC، تم نبض الخلايا التغصنية المشتقة من نخاع العظم مع ALDHعالية أو ليسات الخلايا السرطانية غير المفحوبة، على التوالي. انقر هنا لعرض صورة أكبر. 

figure-results-3
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن يمكن أن يحفز لقاح CSC lysate pulsed DC (CSC-TPDC) على مناعة وقائية مضادة للورم أكثر فعالية في .c. نموذج الورم SCC7. انقر هنا لعرض صورة أكبر. 

figure-results-4
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال استجابات خلوية نظامية أكثر فعالية في المضيف التنافسي المناعي الذي تم تطعيمه مع CSC-TPDC.  تم حصاد الطحال من الحيوانات التي تعرضت للتطعيم H-TPDC أو CSC-TPDC ، وتم تنشيطها على النحو المشار إليه. ثم تم جمع المضادات الثقافية للكشف عن السيتوكين باستخدام ELISA. انقر هنا لعرض صورة أكبر. 

المناقشة

ويحول المضيفون الذين يعانون من نقص المناعة، مثل فئران SCID، دون إجراء تقييمات مناعية لمركبات الكربون الكلورية فلورية بسبب الافتقار إلى المناعة التكيفية داخل المضيفين. في هذه الدراسة، قمنا بتقييم المناعة من CSCs في المضيفين المناعة، والتي يمكن أن تحاكي عن كثب إعدادات المريض. تعتبر مركبات الكربون الكلورية فلورية المخصبة مناعية ويمكن أن تحفز على مناعة وقائية أكثر فعالية للورم عندما يتم تحميل اللسات الخاصة بها إلى DCs كلقاح مقارنة بخلايا الورم غير المحددة التي تنبض بالخلايا.  ومن الناحية الميكانيكية، منحت الحماية عن طريق الاستقراء الانتقائي للأجسام المضادة التفاعلية CSC والخلايا التائية8 وكذلك إنتاج السيتوكين من النوع 1، مثل IFNο و GM-CSF.

معظم العلاجات المناعية الحالية، بما في ذلك اللقاحات القائمة على الخلايا التغصنية ونقل الخلايا التائية بالتبني، مصممة لاستهداف المستضدات المتمايزة للورم. ولذلك فإن مراكز مكافحة الإصابة بالشلل، التي قد لا تعبر عن هذه المستضدات المتمايزة، قد تفلت من هذه الاستهدافات المناعية. وعلى النقيض من ذلك، فإن لقاح CSC المصمم لاستهداف الخلايا الجذعية السرطانية على وجه التحديد قد يدمر هذه المجموعة الخاصة من الخلايا السرطانية، وبالتالي يحسن الفعالية العلاجية للقاح عن طريق منع انتكاس الورم والانبثاث.

في كل من الخلايا السرطانية المستزرعة والأورام التي تم حصادها حديثا ، حددنا السكان المخصبين ب CSC عن طريق قياس التدفق الخلوي استنادا إلى نشاط ألدهيد ديهيدروجيناز العالي. يمكن عزل هذه الخلاياالعالية ALDH عن طريق فرز التدفق لاستخدامها كمصدر مستضد لنبض DC لتوليد CSC-TPDCs. المقارنة باستخدام ALDH الخلاياالعالية المعزولة عن الخلايا السرطانية المستزرعة مقابل الأورام التي تم حصادها حديثا أظهرت عدم وجود فرق كبير في مصطلح تحريض المناعة المضادة CSC8. وكشفت هذه النتائج عن إمكانية استخدام CSCs معزولة إما عن الخلايا السرطانية المستزرعة أو من الأورام التي تم حصادها حديثا للتطبيق السريري.

لكي يكون اللقاح ذا صلة سريرية، يجب فحصه في بيئة علاجية. ويجري الآن إجراء هذه التجارب في مختبرنا.

الإفصاحات

دعمت STEMCELL Technologies رسوم النشر المفتوح.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل صندوق ويل وجين كالدويل للأبحاث الممنوحة من مركز جامعة ميشيغان الشامل للسرطان، وجزؤا من منحة المعاهد القومية للصحة CA82529 ومؤسسة جيلسون لونغنباو.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ALDHEFLOUR KITتقنيات الخلايا الجذعية1700
Murine IL-4Pepro Tech214-14
Murine GM-CSFPepro Tech315-03
Mouse GM-CSF ELISA KITBD Biosciences555167
OptiPrep Density Gradient متوسطسيجما AldrichD1556
BD OptEIA TMB كاشف ركيزة مجموعةBD Biosciences555214
BD FACS Aria Cell SorterBD Biosciences336834
KcjuniorBio-Tek Instruments176058
معدات

المراجع

  1. Shafee, N., Smith, C. R., et al. Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors. Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).
  2. Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells. Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).
  3. Dallas, N. A., Xia, L., et al. Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition. Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).
  4. Yamauchi, K., Yang, M., et al. Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy. Cancer Res. 68, 516-520 (2008).
  5. Chang, A. E., Redman, B. G., et al. A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer. Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).
  6. Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines. Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).
  7. Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy. Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).
  8. Ning, N., Pan, Q., et al. Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity. Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).
  9. Ginestier, C., Liu, S., et al. CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts. J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).
  10. Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer. Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).
  11. Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature. Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ALDEFLUOR ELISA

مقالات ذات صلة