Method Article

فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

DOI:

10.3791/51114

⸱

January 17th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm U1019 - CNRS UMR 8024, Institut Pasteur de Lille, Université de Lille

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، ونحن نصف الفحص phenotypic ينطبق على شاشات عالية الإنتاجية / عالية المحتوى من الحمض النووي الريبي الاصطناعية التدخل الصغيرة (siRNA)، مركب كيميائي، والمكتبات متحولة السل الميكوباكتيريوم. تعتمد هذه الطريقة على الكشف عن السل الفطري المسمى بالفلورسنت داخل الخلية المضيفة المسماة بالفلورسنت باستخدام المجهر الكونفوكوكال الآلي.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من توافر العلاج واللقاح، لا يزال السل واحدا من أكثر الأمراض البكتيرية فتكا وانتشارا في العالم. منذ عدة عقود، يشكل الانفجار المفاجئ للسلالات المقاومة للأدوية المتعددة والواسعة النطاق تهديدا خطيرا لمكافحة السل. لذلك، من الضروري تحديد أهداف ومسارات جديدة حاسمة للعامل المسبب لمرض السل، والسل الميكوباكتريا (Mtb) والبحث عن مواد كيميائية جديدة يمكن أن تصبح أدوية السل. ويتمثل أحد النهج في وضع أساليب مناسبة للشاشات الجينية والكيميائية للمكتبات الكبيرة الحجم التي تمكن من البحث عن إبرة في كومة قش. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير فحص فينوتوبيكال يعتمد على الكشف عن Mtb المسمى فلوريا داخل الخلايا المضيفة المسماة بالفلورسنت باستخدام المجهر الكونفوجال الآلي. يسمح هذا الفحص المختبري بتقدير كمي قائم على الصورة لعملية استعمار Mtb في المضيف وتم تحسينه لتنسيق 384 microplate جيدا ، وهو مناسب لشاشات مكتبات المتحولة ذات المركبات الكيميائية أو Mtb. ثم تتم معالجة الصور للتحليل متعدد البارامترات ، والذي يوفر قراءة الاستدلال على الإمراض من Mtb داخل الخلايا المضيفة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من بين مسببات الأمراض المعدية الناشئة والناشئة التي تم الإبلاغ عنها خلال السنوات الماضية ، يحتل مرض السل الفطري(Mtb)مكانا بارزا كونه مسؤولا عن 1.4 مليون حالة وفاة و 8.7 مليون إصابة جديدة في عام 2011 (تقرير السل العالمي 2012 ، www.who.int/topics/tuberculosis/en/). على الرغم من توافر العلاجات متعددة الأدوية ، فإن عدد المصابين لا يزال في ارتفاع ومقاومة الأدوية المتعددة (MDR) وكذلك مقاومة للأدوية على نطاق واسع (XDR) Mtb تنتشر بسرعة في جميع أنحاء العالم1. وعلاوة على ذلك، عند الأخذ في الاعتبار وجود مستضدات Mtb، فمن الواضح أن ثلث سكان العالم يعتبرون مصابين بشكل كامن من قبل Mtb. إحصائيا، في حالة واحدة من أصل عشرة، هناك تطور نحو الشكل النشط للمرض مع الأعراض السريرية اللاحقة2. لذلك، هناك حاجة ماسة إلى وسائل جديدة لمحاربة Mtb. في هذا السياق، قمنا بتطوير اختبار في المختبر الظاهري الظاهري تعتمد على رصد غزو Mtb والضرب في الخلايا المضيفة عن طريق المجهر الفلوري confocal الآلي3. التكيف من المقايسة في لوحات microtiter 384 جيدا في تركيبة مع اقتناء الصور الآلي وتحليلها ، وسمح عالية المحتوى / عالية الإنتاجية فحص (HC / HTS) من المكتبات متوسطة النطاق من المركبات ، siRNAs والمسوخ البكتيرية. وهكذا مكن فحص مكتبة RNAi واسعة الجينوم على هذا الفحص الظاهري من تحديد العوامل المضيفة الرئيسية المشاركة في الاتجار Mtb والنسخ المتماثل داخل الخلايا ولكن أيضا توضيح مسارات المضيف التي تستغلها عصيات الدرنة. وكان التكيف آخر من هذا الفحص phenotypic خاصة لتحديد العوامل البكتيرية الأساسية لاستمرار Mtb داخل البلعوم. على سبيل المثال ، يعتبر اعتقال النضج البلعوم واحدة من الآليات الرئيسية التي تسهل بقاء وتكرار Mtb في الضامة. رصد توطين subcellular من المسوخ Mtb خروج المغلوب في مقصورات الفلورسنت المسمى الحمضية يسمح لتحديد الجينات البكتيرية المشاركة في عملية البقاء على قيد الحياة4. وأخيرا ، فإن التصوير عالي المحتوى من Mtb يقدم أيضا طريقة ممتازة لقياس كفاءة الدواء لتثبيط الظواهر المختلفة مثل النمو البكتيري داخل الخلايا3. بالإجمال، هذا النوع من الفحص الظاهري عالي الإنتاجية يسمح بتسريع اكتشاف الأدوية ضد السل والبيانات التي تجمعها هذه النهج المختلفة تساهم في فهم أفضل للتلاعب المضيف الذي تمارسه Mtb.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. عالية الإنتاجية الجينوم على نطاق فحص سيرنا

الفحص الذي تم إجراؤه في نموذج خلايا الالتهاب الرئوي من النوع الثاني البشري A549 عند العدوى مع Mtb H37Rv مع التعبير عن بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). ويرد هذا الإجراء في الشكل 1A.

  1. Resuspend مكتبة siRNA المجففة التي يتم تخزينها في لوحات الأم (لوحات 96 بئر) مع العازلة 1x siRNA للوصول إلى تركيز 4 ميكرومتر، ثم نقل 10 ميكروغرام من الخليط إلى لوحة ابنة 384 جيدا (لوحة ابنة 1).
  2. إضافة 10 ميكرولتر من العازلة 1x siRNA في لوحة ابنة 1 لتخفيف siRNA من قبل 2 أضعاف. بعد إعادة ضغط siRNA ، يتم إغلاق اللوحات بختم الألومنيوم القابل للقشر ويمكن تخزينها عند -20 درجة مئوية على الأقل 6 أشهر وما يصل إلى 2-3 سنوات ، ولكن قد يختلف وقت التخزين اعتمادا على توصيات الشركة المصنعة لمكتبة siRNA.
  3. تمييع siRNAs في لوحة ابنة 1 في لوحة ابنة 2 للوصول إلى تركيز 500 nM. بعد إعادة ضغط siRNA ، يتم إغلاق اللوحات بختم الألومنيوم القابل للقشر ويمكن تخزينها عند -20 درجة مئوية على الأقل 6 أشهر وما يصل إلى 2-3 سنوات ، ولكن قد يختلف وقت التخزين اعتمادا على توصيات الشركة المصنعة لمكتبة siRNA.
  4. قبل الاستخدام، إذابة لوحة ابنة 2 في درجة حرارة الغرفة.
  5. خذ 2.5 ميكرولتر من siRNA من لوحة الابنة 2 ووضعها في لوحة فحص 384 جيدا.
  6. في نفس لوحة 384-well المقايسة في الخطوة 1.5، إضافة 2.5 ميكرولتر السلبية والإيجابية siRNA التحكم إلى الآبار الخاصة بهم.
  7. تمييع كاشف العدوى في 1x D-PBS لتحقيق حل كاف لتوفير كاشف 0.1 ميكرولتر من العدوى في كل بئر وبادئة محلول العدوى المخفف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  8. إضافة 7.5 ميكرولتر من خليط محلول كاشف/ PBS transfection لكل بئر في لوحة المقايسة واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  9. إضافة 40 ميكرولتر من خلايا A549 (1500 خلية / بئر) معلقة في RPMI 1640 المتوسطة تكملها 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS). الحفاظ على الخلايا لمدة 3 أيام حضانة عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2. تنقسم هذه الخلايا كل 24 ساعة، وبالتالي فإن حوالي 12,000 خلية موجودة في الآبار بعد ثلاثة أيام من العدوى.
  10. غسل ثقافة MTB H37Rv التي تعبر عن MTB H37Rv لمدة أسبوعين مع D-PBS (خالية من MgCl2 و CaCl2)عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × غرام لمدة 5 دقائق والتخلص من الغسالات. كرر هذه الخطوة 3x. (بالنسبة للظروف الثقافيةGFP-Mtb H37Rv انظر البروتوكول 3).
  11. تعليق بيليه البكتيرية في 10 مل من RPMI 1640 المتوسطة تكمل مع 10٪ FBS وdecant لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح المجاميع البكتيرية إلى الرواسب.
  12. جمع الناسخ البكتيري وقياس OD600 (OD600 ينبغي أن يكون بين 0.6-0.8) وGFP-مضان (قيمة RFU) باستخدام قارئ لوحة صغيرة لتحديد التركيز البكتيري. حساب titer التعليق باستخدام خط انحدار مرجع عرض قيمة RFU = f (قيمة CFU) التي تم إنشاؤها قبل التجربة على ثقافة أخرى التي تم إعدادها في نفس الشروط. إعداد تعليق بكتيري يحتوي على 2.4 × 106 بكتيريا / مل ، وهو ما يتوافق مع تعدد العدوى (MOI) من 5.
  13. إزالة المتوسطة في لوحة 384-well المقايسة وإضافة 25 ميكرولتر من تعليق البكتيرية الطازجة.
  14. احتضان لوحة 384-well المقايسة في 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات في جو يحتوي على 5٪ CO2.
  15. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا بلطف مع المتوسطة RPMI تستكمل مع 10٪ FBS 3x.
  16. لقتل البكتيريا خارج الخلية المتبقية، علاج الخلايا مع 50 ميكروغرام من الطازجة RPMI-FBS المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل من أميكاسين في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة في جو يحتوي على 5٪ CO2.
  17. إزالة أميكاسين متوسطة تحتوي وإضافة 50 ميكرولتر من RPMI المتوسطة الطازجة تكملها مع 10٪ FBS. احتضان لوحة 384-well assay عند 37 درجة مئوية لمدة 5 أيام في جو يحتوي على 5٪ CO2.
  18. قبل الحصول على الصورة، أضف 10 ميكرولتر من 30 ميكروغرام/مل من DAPI في PBS (التركيز النهائي 5 ميكروغرام/مل) واحتضن لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  19. تحميل لوحة في المجهر confocal الآلي.
    figure-protocol-1
    انقر هنا لعرض صورة أكبر.
  20. تعيين معلمات التعرض. سجل DAPI مضان باستخدام ليزر الإثارة 405 نانومتر مع مرشح الانبعاثات 450 نانومتر وفلورسينس GFP باستخدام ليزر الإثارة 488 نانومتر مع مرشح الانبعاثات 520 نانومتر.
    figure-protocol-2
    انقر هنا لعرض صورة أكبر.
    figure-protocol-3
    انقر هنا لعرض صورة أكبر.
  21. حدد الآبار والحقول في كل بئر يتم الحصول عليها، والتي يشار إليها بعد ذلك باسم معلمات التخطيط والتبليط الفرعي.
    figure-protocol-4
    انقر هنا لعرض صورة أكبر.
    figure-protocol-5
    انقر هنا لعرض صورة أكبر.
  22. إنشاء ملف التجربة باستخدام المعلمات من الخطوتين 1.20 و 1.21 وتشغيل الاستحواذ التلقائي.
    figure-protocol-6
    انقر هنا لعرض صورة أكبر.
    figure-protocol-7
    انقر هنا لعرض صورة أكبر.
  23. نقل الصور إلى ملقم بعيد.
    figure-protocol-8
    انقر هنا لعرض صورة أكبر.
  24. تقييم الصور باستخدام برامج تحليل الصور. الكشف عن نواة الخلية من قناة DAPI باستخدام خوارزمية الكشف عن النوى والمنطقة البكتيرية من قناة GFP باستخدام خوارزمية خصائص كثافة بكسل(الشكل 4A).

ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول لدراسة تأثير إسكات الجينات على نمو Mtb داخل الخلايا. Mtb هي بكتيريا بطيئة النمو تنقسم كل 20 ساعة في الظروف المثلى. بعد 5 أيام بعد الإصابة ، لا تزال كمية Mtb خارج الخلية منخفضة في غياب تحلل الخلية ولم تؤثر على جودة التحليل. يجب تحسين هذا البروتوكول من حيث طول مدة العلاج بالمضادات الحيوية ووقت الحضانة ليتم تكييفها لشاشات سيرنا باستخدام البكتيريا سريعة النمو مثل Mycobacteria smegmatis وEscherichia coli التي يتم إطلاقها على نطاق واسع ويمكن أن تصيب خلايا جديدة.

2. عالية الإنتاجية فحص المركب

الفحص الذي تم إجراؤه على الخلايا المضيفة المصابة Mtb H37Rv. ويرد هذا الإجراء في الشكل 1B.

  1. إذابة اللوحات الأم 384 جيدا التي تحتوي على مكتبة مركب solubilized في DMSO 100٪. نقل 0.5 ميكرولتر من المركبات في 384 جيدا ابنة لوحات تحتوي على 10 ميكرولتر من RPMI 1640 المتوسطة تكملها مع 10٪ FBS.
  2. غسل ثقافة MTB H37Rv التي تعبر عن MTB H37Rv لمدة أسبوعين مع D-PBS (خالية من MgCl2 و CaCl2)عن طريق الطرد المركزي عند 4000 × غرام لمدة 5 دقائق والتخلص من الغسالات. كرر هذه الخطوة 3x (بالنسبة للظروف الثقافيةGFP-Mtb H37Rv راجع البروتوكول 3).
  3. تعليق بيليه البكتيرية في 10 مل من RPMI 1640 المتوسطة تكمل مع 10٪ FBS وdecant لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح المجاميع البكتيرية إلى الرواسب.
  4. جمع الناسخ البكتيري وقياس OD600 (OD600 ينبغي أن يكون بين 0.6-0.8) وGFP-فلوريسين (قيمة RFU) باستخدام قارئ microplate. حساب titer التعليق باستخدام خط انحدار مرجع عرض قيمة RFU = f (قيمة CFU) التي تم إنشاؤها قبل التجربة. التركيز النموذجي هو 1 × 108 البكتيريا / مل.
  5. حصاد 6 أيام الضامة البشرية الأولية القديمة في 4 × 105 خلايا / مل في RPMI 1640 المتوسطة تكملها 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) و 50 نانوغرام / مل الإنسان المؤتلف M-CSF (لخلايا الدم الأحادي المحيطية الإنسان تنقية والتمايز الضامة انظر البروتوكول 4).
  6. احتضان الخلايا الأولية المخففة مع العصيات في وزارة الداخلية المختلفة، تتراوح بين 1-5، في تعليق مع اهتزاز خفيف في 90 دورة في الدقيقة لمدة 2 ساعة في 37 درجة مئوية.
  7. غسل الخلايا المصابة عن طريق الطرد المركزي في 350 × ز لإزالة البكتيريا خارج الخلية. بعد كل خطوة الطرد المركزي، إعادة إنفاق بيليه في RPMI 1640 المتوسطة تكملها مع 10٪ FBS. كرر هذه الخطوة 2x.
  8. تعليق الخلايا المصابة في RPMI 1640 المتوسطة تكملها 10٪ FBS والاميكاسين في 50 ميكروغرام / مل واحتضان تعليق مع اهتزاز خفيف لمدة 1 ساعة في 37 درجة مئوية.
  9. إزالة الخلايا والثقافة المتوسطة التي تحتوي على أميكاسين عن طريق الطرد المركزي في 350 x ز وغسل الخلايا المصابة مع كامل RPMI 1640 المتوسطة تكملها 10٪ FBS و 50 نانوغرام / مل الإنسان المؤتلف M-CSF. كرر مرة واحدة.
  10. إضافة 40 ميكرولتر من تعليق الضامة المصابة في نفس لوحة المقايسة في الخطوة 2.1، والذي يحتوي بالفعل على 10 ميكروغرام من التخفيفات المركبة. وقد وصل التركيز النهائي ل DMSO في كل بئر الآن إلى 1٪.
  11. احتضان لوحات المقايسة لمدة 5 أيام عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2.
  12. وصمة عار الخلايا الحية مع صبغة الفلورسنت الفلورسنت خلية permeant أحمر بعيد.
  13. تحميل لوحة في المجهر confocal الآلي.
    figure-protocol-9
    انقر هنا لعرض صورة أكبر.
  14. تعيين معلمات التعرض. سجل مضان أحمر بعيد باستخدام ليزر الإثارة 640 نانومتر مع فلتر الانبعاثات 690 نانومتر وفلورسينس GFP باستخدام ليزر الإثارة 488 نانومتر مع فلتر الانبعاثات 520 نانومتر.
    figure-protocol-10
    انقر هنا لعرض صورة أكبر.
    figure-protocol-11
    انقر هنا لعرض صورة أكبر.
  15. حدد الآبار والحقول في كل بئر يتم الحصول عليها، والتي يشار إليها بعد ذلك باسم معلمات التخطيط والتبليط الفرعي.
    figure-protocol-12
    انقر هنا لعرض صورة أكبر.
    figure-protocol-13
    انقر هنا لعرض صورة أكبر.
  16. إنشاء ملف التجربة باستخدام المعلمات من الخطوتين 2.14 و 2.15 وتشغيل اقتناء التلقائي.
    figure-protocol-14
    انقر هنا لعرض صورة أكبر.
    figure-protocol-15
    انقر هنا لعرض صورة أكبر.
  17. نقل الصور إلى ملقم بعيد.
    figure-protocol-16
    انقر هنا لعرض صورة أكبر.
  18. تقييم الصور باستخدام برامج تحليل الصور. الكشف عن منطقة الخلية من قناة حمراء بعيدة باستخدام خوارزمية خصائص كثافة بكسل والمنطقة البكتيرية من قناة GFP باستخدام خوارزمية خصائص كثافة بكسل(الشكل 4B).

ملاحظة: يمكن تكييف هذا البروتوكول لفحص مكتبة Mtb متحولة عن طريق استبدال المركبات من قبل المسوخ التعبير عن بروتين الفلورسنت (واحد جيدا / واحد متحولة) (الشكل 1C, انظر أيضا برودين وآخرون. 4). يتم أولا المصنف المسوخ الفلورسنت في الآبار (20 ميكرولتر من تعليق البكتيرية لكل بئر). ثم يتم استرداد البكتيريا من قبل 30 ميكروغرام من تعليق الخلية. بعد الطرد المركزي في 350 x ز لمدة 1 دقيقة، يتم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2. وقت الحضانة و MOI تعتمد على المقايسة. على سبيل المثال ، لتصور الأحداث الخلوية المبكرة مثل تحمض الفسغوسوم ، يمكن إصابة الخلايا لمدة ساعتين مع MOI تتراوح بين 1-20. الليسوسومات ملطخة باستخدام صبغة Lysotracker عند 2 ميكرومتر لمدة 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 ثم يتم تثبيتها إما مع 10٪ الفورمالين أو 4٪ بارافورمالديهايد (PFA). يتم الحصول على الصور Confocal وتحليلها أخيرا باستخدام برامج نصية لتحليل الصور تتميز خوارزميات مناسبة للكشف عن الليسوسومات وتوطين دونالخلوية 4.

3. بروتين الفلورسنت الأخضر التعبير عن الظروف الثقافية للسل البكتريا H37Rv (GFP-H37Rv)

للتخزين على المدى الطويل، تم تجميد GFP-H37Rv في برنامج تلفزيوني D (حوالي 1 × 108 البكتيريا الفطرية لكل قارورة).

  1. Resuspend قارورة واحدة من المخزون المجمد من GFP-H37Rv في قارورة إرلينماير تحتوي على 50 مل من 7H9 مرق المتوسطة تكملها ميدلبروك الزراعة العضوية إثراء 10٪، غليسيرول 0.5٪، توين-80 0.05٪، وهيغروميسين B (50 ميكروغرام /مل).
  2. حضانة 8 أيام عند 37 درجة مئوية.
  3. قياس OD600 من الثقافة GFP-H37Rv.
  4. تمييع الثقافة GFP-H37Rv للحصول على OD600 = 0.1 في مرق 7H9 الطازجة المتوسطة تكملها ميدلبروك الزراعة العضوية إثراء 10٪، غليسيرول 0.5٪، توين-80 0.05٪ وهيغروميسين B (50 ميكروغرام / مل).
  5. احتضان GFP-H37Rv في 37 درجة مئوية لمدة 8 أيام أخرى قبل استخدامها للمقايسة.

4. الإنسان الطرفية خلايا الدم الأحادي تنقية من الدم كله أو بافي معطف إعداد

  1. تمييع الحقيبة الدم 2x في 1X D-PBS (خالية من MgCl2 وCaCl2)تحتوي على 1٪ FBS.
  2. عزل monocytes بواسطة فيكول كثافة التدرج الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 20 دقيقة.
  3. جمع monocytes معزولة.
  4. غسل monocytes 3x مع 1x D-PBS (خالية من MgCl2 وCaCl2)التي تحتوي على 1٪ FBS عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. تركيز الخلايا تصل إلى 1 × 107 خلية / مل.
  6. تنقية الخلايا الأحادية باستخدام الخرز المضغوط 14 المغناطيسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر المواد).
  7. بعد تنقية CD14-monocytes، البذور الخلايا في 1.5 × 106 الخلية / مل في RPMI 1640 تكملها مع 10٪ FBS و 40 نانوغرام / مل من الإنسان الضامة مستعمرة عامل تحفيز (hM-CSF) واحتضان لمدة 4 أيام في 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2.
  8. بعد 4 أيام استبدال المتوسطة مع RPMI 1640 الطازجة تكملها 10٪ FBS و 40 نانوغرام / مل من hM-CSF واحتضان لمدة 2 أيام في 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5٪ CO2.
  9. بعد 6 أيام، يمكن استخدام الخلايا للمقاهية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فحص سيرنا عالي الإنتاجية على نطاق الجينوم

Mtb قادرة على استعمار الخلايا المناعية في المختبر، فضلا عن العديد من الخلايا الظهارية الرئة الأخرى. على سبيل المثال، Mtbقادرة على إصابة وتلف الخلايا الظهارية A549 التي تستخدم عادة كنموذج للخلايا الرئوية من النوع الثاني البشري5-7. تم الإبلاغ عن Dectin-1 كم مستقبلات الخلايا المضيفة المشاركة في امتصاص Mtb ، والاستجابة proinflammatory وتأثير مضاد للبكتيريا على النمو العضلي العضلي داخل الخلية في خلايا A5498

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصف هنا الطرق المطلوبة لإجراء فحص فينوتبيك باستخدام سلالة MTB H37Rv المعبرة عن GFP لإصابة الخلايا المضيفة المسماة بالفلورسنت ، مما يجعلها مناسبة للشاشات عالية المحتوى / عالية الإنتاجية. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على مجموعة واسعة من المركبات، والتحقيقات الفلورية والمسوخ Mtb. لكل بروتوكول موضح أعلاه، يمكن تنفيذ خطوات التثبيت ووضع ال تسميتها المناعية قبل الحصول على الصورة. نحن نستخدم المجهر الفلورسنت المؤتمتة مجهزة عدسة المياه 20X (NA 0.70) أو 60X (NA 1.2) للحصول على الصور. تم تجهيز المجهر confocal مع...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد قدمت الجماعة الأوروبية الدعم المالي لهذا العمل (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901، وMM4TB Grant n° 260872)، والوكالة الوطنية للإعادة إلى الخلايا، والفيدر (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed)، والمنطقة نورد باس دي كاليه. ونحن نعترف بامتنان بالمساعدة التقنية التي يقدمها غاسبار ديلويسون، وإليزابيث فيركمايستر، وأنطونينو بونجيوفاني، وفرانك لافون من منصة BICeL.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ومايكرو. صفيحة سوداء شفافة ، 384 بئرGreiner Bio-One781091127.8 / 86/15 مم مع غطاء ،
CellCarrier 384 بئرPerkinElmer6007550أسود ، قاع شفاف ، مع غطاء ، TC معالج
على شكل حرف V أبيض ، 384 بئر لوحةGreiner Bio-One781280  ؛
شريط مانع للتسرب ، تنفس ، معقمCorning3345  ؛
Lipofectamine RNAiMaxLife Technologies13778150كاشف الإرسال
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما ألدريتش34943  ؛
RPMI 1640 + GlutaMAX-ILife Technologies61870-010وسط زراعة الخلايا
D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2Life Technologies14190-094Dulbecco&# 039; s عازلة فوسفات الملح
D-PBS 1x [+] MgCl2< / sub> / [+] CaCl2< / sub>Life Technologies14190-091Dulbecco &# 039 ؛ s فوسفات الملح عازلة
مصل الأبقار الجنينتقنيات الحياة2610040-79 
Ficoll Paque PLUSDutscher17-1440-03Ficoll لتنقية خلايا الخلايا الوحيدة في الدم المحيطي
CD14 MicroBeads ،Miltenyi130-050-201تنقية الخلايا الوحيدة CD14 +
Human M-CSF ، غرام ممتاز (1000 & mu ؛ ز)Miltenyi130-096-493البلاعم عامل تحفيز
LS أعمدةMiltenyi130-042-401أعمدة لعزل الخلايا الأحادية CD14 +
Tween 80Euromedex2002-Aثقافة البكتيريا
الفطرية الجلسرين عالية النقاء   ؛Euromedex50405-EXزراعة البكتيريا
الفطرية  تخصيب ميدلبروك OADC211886 بيكتون ديكنسونمزرعة البكتيريا الفطرية
7H9Becton-DickinsonW1701Pثقافة البكتيريا
الفطرية Versene 1xLife Technologies15040033حل تفكك الخلايا غير الأنزيمية
DAPILife TechnologiesD1306صبغة النوى
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570صبغة النوى
Syto60Life TechnologiesS11342صبغة النوى / السيتوبلازم
FormalinSigma-AldrichHT5014تثبيت الخلايا
siRNA الذي يستهدف Dectin-1Santa-Cruzsc-63276  ؛
* siGenome * تجمع siRNA غير المستهدف   ؛دارماكونD-001206-14 
ريفامبيسينسيجما ألدريتشR3501المضاد الحيوي
Isoniazid (INH)Sigma-AldrichI3377-50Gالمضاد الحيوي
Hygromycin BLife Technologies10687-010المضاد الحيوي
AmikacinSigma-AldrichA1774المضاد الحيوي
المجهر متحد البؤر الآلي OPERAPerkinElmerالحصول على صورة
كولومبوس 2.3.1 قاعدة بيانات الخادمPerkinElmerنقل البيانات وتخزينها وتحليلها
برنامج Acapella 2.6PerkinElmerالتحليل المستند إلى الصور
برنامج GraphPad Prism5GraphPadالتحليل الإحصائي
Excel 2010Microsoftالتحليل الإحصائي
لوحة معالجة TC البشري مستعمرة حل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
  2. Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
  3. Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
  4. Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
  5. Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
  6. Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
  7. McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
  8. Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
  9. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
  10. Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
  11. Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
  12. Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
  13. Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intracellular Mycobacteria QuantificationHigh throughput ScreeningConfocal MicroscopyGFP expressing MycobacteriumHost Cell InfectionsiRNA Library ScreeningChemical Compound ScreeningAutomated Image AnalysisBacterial Area Per CellDose Response Curve

Related Articles