Method Article

تمكين أكذوبة موسع الأيض التنميط

DOI:

10.3791/51200

⸱

February 3rd, 2014

 ,  ,  , 
1Centre for Process Systems Engineering, Department of Chemical Engineering and Chemical Technology, Imperial College London, 2Centre for Synthetic Biology and Innovation, Division of Molecular Biosciences, Imperial College London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد وصف لكيفية معايرة نقل الطاقة الرنين فورستر أجهزة الاستشعار البيولوجية المتكاملة (أكذوبة) لالتنميط الأيضية في الموقع. وأكذوبة يمكن أن تستخدم لقياس مستويات الخلايا الأيض مساعدة noninvasively في تطوير نماذج التمثيل الغذائي والإنتاجية العالية فحص ظروف العمليات الحيوية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في عصر البيولوجيا الحاسوبية، ونظم تجريبية جديدة عالية الإنتاجية اللازمة من أجل تعبئة وصقل النماذج بحيث يمكن التحقق من صحة لأغراض التنبؤية. مثالي مثل هذه الأنظمة سيكون حجم منخفضة، ما يحول دون أخذ العينات والتحليلات المدمرة عندما تكون البيانات بالطبع الوقت التي يمكن الحصول عليها. ما هو مطلوب هو في أداة رصد الوضع الطبيعي الذي يمكن إبلاغ المعلومات اللازمة في الوقت الحقيقي وnoninvasively. خيارا للاهتمام هو استخدام الفلورسنت، وأجهزة الاستشعار البيولوجية في الجسم الحي كما صحفيين تركيزات داخل الخلايا القائم على البروتين. ويستند واحد من فئة معينة في الجسم الحي أجهزة الاستشعار التي وجدت تطبيقات في المستقلب الكمي على نقل الطاقة الرنين فورستر (الحنق) بين اثنين من البروتينات الفلورية متصلة بواسطة مجال ملزم يجند. الحنق أجهزة الاستشعار البيولوجية المتكاملة (أكذوبة) ويتم إنتاج جوهري في خط الخلية، لديهم أوقات الاستجابة السريعة وتشا بهم الطيفيةracteristics تغيير على أساس تركيز المستقلب داخل الخلية. في هذه الورقة، وصفت طريقة لبناء الهامستر الصينية المبيض (شو) خطوط الخلايا التي تعبر عن جوهري على أكذوبة للالجلوكوز والجلوتامين ومعايرة أكذوبة في الجسم الحي في الثقافة خلية دفعة من أجل تمكين الكمي مستقبل تركيز المستقلب داخل الخلايا. يوضح البيانات من تغذيها دفعة CHO الثقافات الخلية أن أكذوبة كان قادرا في كل حالة للكشف عن التغير الناتج في تركيز داخل الخلايا. باستخدام إشارة الفلورسنت من أكذوبة ومنحنى المعايرة التي شيدت سابقا، تم تحديد تركيز الخلايا بدقة ما أكده مقايسة الأنزيمية المستقلة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

رصد المستقلب لها تطبيقات مختلفة في التجهيز البيولوجي، بما في ذلك عملية التنمية، وسائل الإعلام وتصميم الأعلاف، والهندسة الأيضية. تتوفر لقياسات تركيز أساليب مختلفة من خلال استخدام الأنزيمية 1، 2 الكيميائية، أو المقايسات ملزمة 3. خيارا للاهتمام هو استخدام الفلورسنت، وأجهزة الاستشعار البيولوجية في الجسم الحي كما صحفيين من تركيز الخلايا الأيض الأساسية القائمة على البروتين. في المقايسات حجم منخفضة للغاية، مضان هو أداة مريحة كما التصغير يحسن فعلا نسبة 4،5 إشارة إلى الضوضاء وأجهزة الاستشعار القائم على البروتين المشفرة وراثيا يمكن أن لا معنى الكواشف الخارجية ضرورية لتحليل المستقلب. تتكون نقل الطاقة الرنين فورستر (الحنق) أجهزة الاستشعار من اثنين من البروتينات الفلورية متصلة بواسطة مجال ملزم يجند. الحنق هو نقل nonradiative الطاقة من المانحين الصورة متحمس لمتقبل الفلورسنت جزيء المستخدمان إد على مقربة (<100). انشقاق يجند أو ملزم يؤدي إلى تغيير متعلق بتكوين جزئي في أجهزة الاستشعار، والتي، بدورها، يؤدي الى تغيير في القرب من fluorophores، مما يؤدي إلى تغيير في كفاءة الحنق يقاس التغير في طيف الانبعاث. ويتم إنتاج أجهزة الاستشعار البيولوجية الحنق المتكاملة (أكذوبة) جوهري في خط الخلية وتتغير خصائصها الطيفية استنادا إلى تركيز المستقلب داخل الخلية. أكذوبة ديهم أوقات الاستجابة السريعة مما يجعلها مثالية لأخذ القياسات لنماذج ديناميكية 6. وتشمل التطبيقات السابقة رصد احدة 7-9 ومتعددة 10 الأيض وتوفير بيانات عن توزيع 11 الزمانية المكانية. يمكن إنشاء أكذوبة في طرازين: آبو ماكس، حيث يجند ملزمة يعطل القرب من fluorophores خفض نقل الطاقة وآبو مين، حيث يجند ملزمة يجلب fluorophores اثنين في اتصال أوثق (الشكل 1).

_content "> في هذا العمل، ويرد على بروتوكول لبناء الهامستر الصينية المبيض (شو) خطوط الخلايا التي تعبر عن جوهري على أكذوبة لأيض الجلوكوز أو الجلوتامين. يتم تأسيس منهجية لمعايرة أجهزة الاستشعار في الجسم الحي لتمكين الكمي المستقبل قياسات تركيز المستقلب داخل الخلايا، كما وردت في الشكل 2. وبناء على هذا، فإن تركيز الجلوكوز داخل الخلايا أو الجلوتامين يمكن تحديد في تغذية على دفعات CHO الثقافات الخلية، التي تمت إضافتها المغذيات اثنين في تركيزات عالية في العملية. النتائج إثبات أن استخدام إشارة الفلورسنت من أكذوبة ومنحنى المعايرة التي شيدت سابقا، التنبؤ بدقة من تركيز الخلايا هو ممكن، على نحو ما أكده مقايسة الأنزيمية المستقلة. يوفر هذا الأسلوب مزايا كبيرة على التقنيات التحليلية الحالية لأنه موسع ومنخفضة التكلفة وبسرعة، وإعطاء إشارة في الوقت الحقيقي من الأكاذيب التي يمكن أن تكون الاثنينitored في جميع أنحاء الثقافة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خلية الخط إحياء وصيانة

  1. إحياء الخلايا CHO في 9 مل CD-CHO المتوسطة تستكمل مع 8 مم L-الجلوتامين و 10 مل / L 100X هيبوزانتين / ثيميدين ملحق (كاملة متوسطة النمو).
  2. أجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
  3. resuspend الخلايا في 10 مل من الطازجة المتوسطة النمو الكامل.
  4. إزالة عينة 1 مل وتحديد تركيز خلية قابلة للحياة بواسطة المجهر الضوئي باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد طريقة الصبغة في عدادة الكريات.
  5. بدء الثقافة في مناطق ذات كثافة البذر من 3 × 10 5 خلية / مل في 125 مل يهز القوارير.
  6. الحفاظ على الثقافة في حاضنة عند 37 درجة مئوية، جو مرطب من 5٪ CO 2، على منصة تهتز المدارية الدورية عند 120 دورة في الدقيقة.
  7. ثقافة فرعية كل 3-4 أيام في المتوسط ​​النمو الكامل في مناطق ذات كثافة البذر من 2 × 10 5 خلية / مل.

2. ترنسفكأيشن من الخط الخليوي مع البلازميد Containing وجهاز الاستشعار البيولوجي الجيني

  1. إعداد الحمض النووي البلازميد باستخدام طقم تنقية البلازميد على نطاق واسع.
  2. الحفاظ على الخلايا في الظروف الملائمة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2) 12-24 ساعة قبل ترنسفكأيشن لضمان تقسيم الخلايا بنشاط في وقت ترنسفكأيشن.
  3. عد الخلايا باستخدام التريبان الأزرق الاستبعاد طريقة صباغة، ثم إعداد حجم العمل من 20 مل من خلية ثقافة في 125 مل قارورة يهز بتركيز 1 × 10 6 خلية / مل.
  4. استخدام عدة ترنسفكأيشن مناسبة للخط الخلوي في الاستخدام. سوف الحمض النووي البلازميد نسبة الكواشف ترنسفكأيشن أن تعتمد على خط الخلية والنواقل. فمن المستحسن أن هذا هو الأمثل من خلال اختبار مجموعة من النسب داخل النطاق المحدد من قبل الشركة المصنعة قبل إجراء transfections النهائي. أيضا الحفاظ على ثقافة واحدة على الأقل السيطرة السلبية التي تحتوي على الخلايا ولكن لا الحمض النووي.
  5. احتضان لمدة 4 أيام في وضع ثابت ثم نقل إلى SHAKIمنصة نانوغرام الدورية عند 125 دورة في الدقيقة.
  6. إضافة المضادات الحيوية المناسبة لاختيار البلازميد إلى تركيز مناسب وفقا لما يحدده منحنى القتل. في هذه الدراسة، تم إضافة zeocin إلى تركيز النهائي من 400 ميكروغرام / مل للاختيار من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل.
  7. تغيير وسائل الإعلام في الفترة الفاصلة الوقت المناسب للخط الخلوي، إضافة المضادات الحيوية في كل مرة، إلى أن توفي الخلايا في السيطرة بشكل جيد.
  8. استخدام الآبار معظم متموجة من التقدم إلى اهتزاز الثقافات.
  9. إنشاء بنك للخلايا من خلال تجميد الخلايا في قارورة المبردة التي تحتوي على 10 7 خلايا قابلة للحياة في 1 مل من مزيج التجميد. في هذا العمل، وهذا يتكون من 92.5٪ متوسط ​​النمو 7.5٪ وثنائي ميثيل سلفوكسيد.

3. دفعة وبنك الاحتياطي الفيدرالي على دفعات المنحنى نمو الخلايا

  1. اتبع التعليمات لصيانة الخلية أعلاه لإنشاء مزارع الخلايا ثلاث نسخ من الخلايا CHO transfected في 250 مل يهز قوارير مع حجم العمل من 50 مل.
  2. الحفاظ على cultuالدقة في حاضنة ترطيب الخلايا عند 37 درجة مئوية، مع 5٪ CO 2، على منصة تهتز المدارية الدورية عند 125 دورة في الدقيقة، وإزالة 4.1 مل عينات من كل ثقافة ينمو بمعدل 24 ساعة فترات.
  3. استخدام 100 ميكرولتر من العينة لتحديد تركيز خلية وخلية حيوية قابلة للحياة مع التريبان الأزرق طريقة صبغ الاستبعاد.
  4. كرر حتى يتم تقليل تركيز خلية قابلة للحياة إلى الصفر.
  5. تكرار لمزارع الخلايا فدان على دفعات المكمل مع كمية مناسبة من الجلوكوز أو الجلوتامين في يوم 6 إلى استعادة تركيزاتها إلى القيم الأولية من 36 ملم و 4 ملم على التوالي. فمن المستحسن أن الثقافات تحكم إضافية يتم الاحتفاظ أيضا، التي يجب أن تتغذى على نفس حجم (12 مل في هذه الحالة) من الماء النقي.

4. الحنق نسبة القياسات

  1. تأخذ 2 مل من العينات يوميا بإزالتها في الخطوة 3.2 أعلاه وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  2. Resuspأنهى بيليه خلية في 2 مل من الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). نقل ذلك في لوحة 6 جيدا وإضافة عينة فارغة لا تحتوي على خلايا لواحد أيضا.
  3. قياس مستويات مضان الأزرق والأصفر على الفور في الطول الموجي الإثارة من 430/435 نانومتر، وانبعاث موجات من 465/435 نانومتر (الأزرق) و520/510 نانومتر (الصفراء).
  4. حساب نسب الحنق (نسبة مضان الصفراء الكشف عن أكثر من مضان الكشف الأزرق).

5. المستقلب فحوصات

  1. تأخذ 2 مل من العينات يوميا بإزالتها في الخطوة 3.2 أعلاه وأجهزة الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف.
  2. resuspend الكرية خلية في 3 مل الجليد الباردة PBS وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 100 x ج لمدة 5 دقائق.
  3. إزالة طاف و resuspend بيليه خلية في 3 مل PBS الباردة الجليد على النحو الوارد أعلاه. يصوتن العينة 5X لمدة 3 دقائق في كل نبضة من 15 ثانية على و15 ثانية قبالة. عند هذه النقطة، الخلية اضافيةقد يتم تجميد سنت اذا شئت.
  4. استخدام عدة فحص الجلوكوز المناسب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة على عينات من مستخلصات الخلية إلى تحديد تركيز الجلوكوز داخل الخلايا (انظر الجدول مواد).
    ملاحظة: استخدام المعايير المناسبة لبناء منحنى القياسية. في هذا العمل، تراوح تركيز المعايير بين 0-100 ملم.
  5. باستخدام قراءات للمعايير، وبناء منحنى القياسية وإيجاد معادلة خطية من الأنسب (في هذه الحالة: ذ = 1310.51x - 723.43 حيث y هو القراءة الامتصاصية وx هو تركيز الجلوكوز).
  6. حساب تركيزات الجلوكوز باستخدام منحنى القياسية واتخاذ التخفيف في الاعتبار. ومن ثم يمكن حساب تركيز الجلوكوز داخل الخلايا باستخدام هذه المعادلة:
    figure-protocol-1
    لخلايا CHO، تم حساب حجم خلية واحدة باستخدام قطرها 12 ميكرومتر خلية من 12 سوب>.
  7. استخدام عدة الجلوتامين الفحص المناسب وفقا لتعليمات الشركة المصنعة على عينات من مستخلصات الخلية إلى تحديد تركيز الجلوتامين داخل الخلايا (انظر الجدول مواد).
    ملاحظة: استخدام المعايير المناسبة لبناء منحنى القياسية. في هذا العمل، وتركيز المعايير تراوحت بين 0-2 ملم.
  8. كما هو الحال في 5.5 أعلاه، وبناء منحنى المعايرة (في هذه الحالة ذ = 203.1x 17.1 + حيث y هو القراءة الامتصاصية وx هو تركيز الجلوكوز)
  9. باستخدام منحنى القياسية، وحساب تركيز الجلوتامين من العينات، مع التخفيف في الاعتبار. ويمكن حساب تركيز الجلوتامين داخل الخلايا باستخدام المعادلة (1) أعلاه.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويقدم لمحة عامة عن منهجية في الشكل 2. في العمل الواردة في هذه الوثيقة، و transfected الخلايا CHO مع ناقلات أكذوبة وخطوط الخلايا مستقرة وتم اختيار عند ضغط المضادات الحيوية من 400 ميكروغرام / مل zeocin. لذا تم إنشاء اثنين من خطوط الخلايا مستقرة منفصلة معربا جوهري الجلوكوز والجلوتامين أجهزة الاستشعار. الشكل 1 يصور تكوينات اثنين من أجهزة الاستشعار المستخدمة في هذه الدراسة. ويستند جهاز استشعار الجلوكوز على مبدأ آبو ماكس والبلازميد المقابلة هو pRSET-FLI...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأكذوبة تمكين في الجسم الحي والكميات الموضع من الجزيئات الرئيسية في، في هذه الحالة المغذيات منظم النمو، وإزالة الشكوك الناجمة عن التبريد وأساليب الاستخراج. تشير النتائج أن هناك علاقة جيدة بين إشارة أكذوبة وتركيزات داخل الخلايا في نطاق 1-5 ملم للجلوكوز و0.3-2 ملي لالجلوتامين. في دفعة ثقافة الخلية CHO، واجهت هذه التركيزات في الأسي والقرطاسية، وأوائل مراحل الانخفاض. المراحل الأسي وثابتة هي الأكثر أهمية من حيث تصميم استراتيجيات التغذية المناسبة، وبالتالي است...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الأستاذ ولف فرومر (معهد كارنيجي للعلوم في جامعة ستانفورد) لتوفير يرجى لنا مع الجلوكوز الحنق البلازميد والدكتور أوفه Ludewig (جامعة هوهنهايم) لتتكرم تزويد الجلوتامين الحنق بناء مصنع في pUTKan التعبير النواقل. ويتم تمويل AB بواسطة برنامج منح دراسية BBSRC الأولوية المستهدفة. دعم كلا CK وKP بواسطة RCUK الزمالات في المستحضرات الصيدلانية البيولوجية المعالجة. ويود أيضا أن أشكر CK ونزا الحيوية للحصول على الدعم المالي. ويدعم مركز البيولوجيا الاصطناعية والابتكار بسخاء من قبل EPSRC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CHO-S CellsLife Tecnologies11619-012سيختلف خط الخلية اعتمادا على أهداف الدراسة
pCDNA4 / TO vector   ؛يمكن تحقيق Life Tecnologies
TransIT-PRO TransIT-PRO TransfectionReagent Mirus BioMIR 5700باستخدام أي طريقة مناسبة لخط الخلية قيد الدراسة
ZeocinInvivogen
CD-CHO mediumLife Technologies10743-011يعتمد وسط نمو الخلية على الخلايا قيد الدراسة
100x HT SupplementLife تقنيات11067-030
L-Glutamine 200 mM (100x) ، LiquidLife Technologies25030032
InfinitePRO 200 قارئ لوحةTecanFLx800TBIيمكن استبدال أي قارئ لوحة مضان 96 بئرا يمكنه الوصول إلى الأطوال الموجية المطلوبة
مرشحات لقارئ الألواحTecan30000463
Maxiprep Plasmid Purification KitQiagen12163يمكن استبدال أي مجموعة مناسبة
Amplex Red الجلوكوز / الجلوكوز أوكسيديز مجموعةفحص InvitrogenA22189يمكن استبدال أي مجموعة مناسبة
EnzyChrom  مجموعة فحص الجلوتامينالفحصالحيوي EOAC-100يمكن استبدال أي مجموعة مناسبة
مقياس الدم المحسن من نيوباورحاضنة فيشر ScientificMNK-420-010N
 نويرNU-5510E
أنظمة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
  2. Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
  3. Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
  4. Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
  5. Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
  6. Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
  7. Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
  8. Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
  9. Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
  10. Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
  11. Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
  12. Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
  13. Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
  14. Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
  15. Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
  16. Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

FRET Integrated Biological SensorsIntracellular Metabolite ProfilingChinese Hamster Ovary CellsFluorescence Resonance Energy TransferNoninvasive Biosensor MonitoringFed Batch Cell CultureGlutamine Glucose DetectionPlasmid Transfection SelectionFluorescence Ratio MeasurementEnzymatic Assay Validation

Related Articles