تحجيم إنتاجية عالية التحديد من المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية-عرض فاجي

ملخص

ووصف الأسلوب مع مرافقة البصرية لإجراء قابلة لل، التحديدات إنتاجية عالية من اندماجي المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية عرض فج ضد المئات من مولدات المضادات في وقت واحد. باستخدام هذا النهج الموازي، ونحن قد عزل شظايا الأجسام المضادة التي تظهر تقارب عالية وخصوصية لمستضدات المتنوعة التي وظيفية في المناعية القياسية.

الملخص

الطلب على الأجسام المضادة التي تلبي احتياجات كل من تطبيقات البحوث الأساسية والسريرية عالية، وسوف تزيد بشكل كبير في المستقبل. ومع ذلك، فمن الواضح أن التقنيات التقليدية ليست وحيدة النسيلة وحدها تصل إلى هذه المهمة. وقد أدى ذلك إلى تطوير أساليب بديلة لتلبية الطلب على جودة عالية والكواشف تقارب المتجددة لجميع العناصر يمكن الوصول إليها من بروتيوم. ولتحقيق هذه الغاية، وقد وضعت أساليب إنتاجية عالية لإجراء مختارات من المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية عرض فج للتطبيقات التي تنطوي على مستضدات متنوعة والأمثل لإنتاجية السريع والنجاح. هنا، يتم وصف بروتوكول في التفاصيل التي توضح مع مظاهرة الفيديو اختيار موازية من الحيوانات المستنسخة فاب-فج من المكتبات التنوع عالية ضد مئات الأهداف باستخدام معالج السائل اليدوي 96 قناة أو النظام الآلي الروبوتات. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن لمستخدم واحد تولد المئات من مولدات المضادات،تحديد الأجسام المضادة لهم بالتوازي والتحقق من صحة الأجسام المضادة ملزمة في غضون 6-8 أسابيع. يسلط عليها الضوء هي: ط) شكل مستضد قابلة للحياة، والثاني) توصيف مستضد الاختيار، الثالث) الخطوات الحاسمة التي تؤثر في اختيار من الحيوانات المستنسخة محددة وعالية تقارب، والرابع) سبل فعالية اختيار رصد ومرحلة مبكرة الأجسام المضادة استنساخ التوصيف. مع هذا النهج، لقد حصلنا على شظايا الأجسام المضادة الاصطناعية (فابز) إلى العديد من الفئات المستهدفة بما في ذلك مستقبلات غشاء مسار واحد، الهرمونات تفرز بروتين، والبروتينات داخل الخلايا متعددة المجالات. يتم تحويل هذه الشظايا بسهولة إلى الأجسام المضادة كامل طول وتم التحقق من صحة لعرض تقارب عالية وخصوصية. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت لتكون وظيفية في مجموعة متنوعة من المناعية القياسية بما في ذلك غرب النشاف، ELISA، المناعي الخلوي، مناعي وفحوصات ذات الصلة. وهذه المنهجية تسريع اكتشاف الأجسام المضادة، وفي نهاية المطاف يقربنا من تحقيق هدف سو توليد الطاقة المتجددة، والأجسام المضادة ذات جودة عالية للبروتيوم.

المقدمة

مع بداية عصر ما بعد الجينوم، وتوافر الكواشف ملزمة عالية الجودة لتوصيف وتعدل البروتينات ضروري لفتح البحوث الجديدة والسبل العلاجية. تستمر الأجسام المضادة لتكون حاسمة لكلا الباحثين الأكاديميين والصناعية، والبحوث الأساسية وأدوات التشخيص والعلاجات المحتملة. ليس من المستغرب، فقد كان هناك نمو هائل من شركات تطوير الأجسام المضادة العقد، ومعظمها تعتمد على التقنيات التقليدية هجين لتوليد الأجسام المضادة مخصصة. ومع ذلك، في المختبر التحديد باستخدام مكتبات الضد-عرض فج أصبحت تكنولوجيا بديلة قوية يمكن أن توفر مزايا فريدة والنجاح حيث التقنيات التقليدية يمكن أن تواجه القيود ^{1 و 2.}

في ضوء طلب كبير على الأجسام المضادة ذات جودة عالية كما أدوات البحث، وهما التحديات الرئيسية لتوليد الأجسام المضادة المتجددة هي 1) الإنتاجية الاختيار و2) مركبات مستضدailability. ووصف عدد من الجماعات الآن في خطوط الأنابيب اختيار المختبر تهدف إلى زيادة الإنتاجية ومعدل تحديد الأجسام المضادة. هذه الأوصاف بالتفصيل مجموعة متنوعة من النهج قابلة للحياة أن تشمل اختيار إما على كامل طول تستهدف ^3،4، أو هيكليا المجالات ^5،6،7 ذات الصلة، سواء باستخدام ^6،8 أو ^3،4 مخططات مستضد تجميد لوحة المستندة على أساس حبة. وبالإضافة إلى ذلك، حققت تزايد اعتماد تقنيات التوليف الجيني ⁹ جيل مستضد المنهجي، ولا سيما من المجالات معزولة، معقول فعالة من حيث التكلفة، ويمكن أن يحتمل التخفيف من صعوبة في الحصول على كميات كافية من النقى كامل طول مستضد. باستخدام تقنيات اثنين جنبا إلى جنب، ولقد ابتكر خط أنابيب مكتفية ذاتيا وتوليد المستضدات تحجيم واختيار الأجسام المضادة التي من شأنها تمكين العزلة موازية من الأجسام المضادة لمجموعات كبيرة من المجالات المستضد أعرب وتسهيل تطوير الكاشف لتشاracterizing فئات كاملة من البروتينات المرتبطة هيكليا أو وظيفيا.

من أجل تحقيق هذا الهدف، وهو خط أنابيب المتكاملة التي تم تطويرها من الأزواج في تحديد سيليكون والمجالات مستضد التعبير عنه، والتوليف الجيني والتعبير البكتيرية عالية الإنتاجية من المستضدات وعرض فج التحديدات الأجسام المضادة قابلة للتطوير. هذا الخط يتطلب البنية التحتية الأساسية الوحيدة المتاحة لمعظم مختبرات علوم الحياة (بما في ذلك المكتبات الأجسام المضادة التي تكون متاحة على نحو متزايد من خلال ترخيص أو اتفاق نقل المواد)، ولكن هو أيضا قابلة للالتشغيل الآلي للاستخدام على نطاق صناعي. باستخدام هذا البروتوكول، فمن الممكن لتوليد مئات من المجالات مستضد الموسومة تقارب، وعزل روتيني شظايا الأجسام المضادة محددة للغاية لكثير من هذه المستضدات.

وقد أظهرت تكنولوجيا العرض فج التوافق تظاهر مع مجموعة واسعة من صيغ المؤتلف تقارب كاشف بما في ذلك القوات المسلحة البوروندية، scFv، والمجالات اناث مستقلة ومجموعة متزايدة من "الأطر البديلة" صغيرة (المصممة ankyrin تكرار البروتينات (DARPINS)، فبرونيكتين (الجبهة الوطنية)، وأكثر المجالات lipocalin ^10). وتقتصر المناقشة في هذا المثال إلى عزل فاب شظايا الأجسام المضادة، على الرغم من أنه يفترض هذه الأساليب يمكن أن تتكيف مع أنواع أخرى من المكتبات. باستخدام هذه التكنولوجيا، فابز مع انخفاض nanomolar تقارب للمشاريع الصغيرة، الموسومة المجالات بما في ذلك المجالات بروتين عامل النسخ، المجالات SH2، وقد تم اختيار البروتينات وغيرها ملزم RNA بنجاح، وكثير منها ربط بروتين كامل طول ووظيفية في المناعية مثل المناعي ، مناعي والمناعية. الأهم من ذلك، استنساخ ملزمة المؤتلف قابلة للتجديد بالكامل ويمكن إعادة لدت-من التعبير يبني عبر البكتيرية طرح زيادة إنتاج الاتساق، استنساخ والفعالية من حيث التكلفة، وبالتالي تبرير حساب دقيق التحقق من صحة استنساخ.

في هذا البروتوكول الاضافيocol والفيديو المصاحب، وأثبتت الأساليب الأساسية لاختيار الأجسام المضادة من المكتبات عرض فج باستخدام المجالات مستضد يجمد. هذه طريقة معينة توظف المجالات البروتين الموسومة GST ثبتوا عن طريق الامتزاز السلبي في لوحات microwell، على الرغم من علامات أخرى ^11،12،13 وصيغ اختيار ^13،14،2 كما تم استخدامها بنجاح. الاعتبارات الهامة لإعداد وإجراء التحديدات مع مراقبة مواز من المعلمات اختيار تهدف إلى تحديد وعزل أجسام مضادة نسيلي المخصب خصيصا من أجل التحقق مفصلة.

البروتوكول

1. مستضد الجيل

ملاحظة: المجالات مستضد يمكن توليفها واستنساخ من قبل مجموعة متنوعة من الباعة التجارية إلى-IPTG محرض التعبير بناء المناسب.

1. تحويل بنيات التعبير إلى المختص كيميائيا، T1-فج مقاومة، BL21 E. خلايا القولونية عن طريق خلط 10 نانوغرام من ترميز الحمض النووي في 20 ميكرولتر من 1X KCM على الجليد في 96 لوحة PCR جيدا تليها إضافة 20 L الخلايا المختصة كيميائيا.
2. احتضان الخليط خلية / الحمض النووي على الجليد لمدة 20 دقيقة، في RT لمدة 10 دقيقة ثم على الجليد مرة أخرى لمدة 2 دقيقة قبل إنقاذ مع 100 ميكرولتر من قبل تحسنت مرق السوبر الأمثل مع الجلوكوز (SOC) وسائل الاعلام، وتغطي مع لوحة ختم تنفس وتهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على 200 دورة في الدقيقة في 2.5 سم شاكر المداري.
3. لوحة 5 ميكرولتر من الخلايا تحولت إلى لوريا، BERTANI (LB) / لوحات أجار تستكمل مع كربنيسيلين (100 غرام / مل)، وتنمو O / N للحصول على المستعمرات واحدة تستخدم لتوليد الأسهم الجلسرين.
4. تطعيم 1 مل من 2YT وسائل الإعلام / الكربوهيدرات مع 5 ميكرولتر الأسهم الجلسرين وتنمو لمدة 12 ساعة على 37 درجة مئوية في كتلة 96 بئر عميق جيدا مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة في 2.5 سم شاكر المداري.
5. تطعيم NZY media15 (تستكمل مع الجلوكوز 0.05٪، 2٪ اللاكتوز، و 100 غرام / مل كربنيسيلين) مع 1:40 التخفيف من هذه الثقافة، ثم يهز لمدة 6-8 ساعة عند 30 ° C و 200 دورة في الدقيقة في 2.5 سم المدار شاكر.
6. البكتيريا بيليه وتنقية البروتينات المستضدية في الإنتاجية العالية في لوحة مرشح 96-جيدا تحتوي على 100 ميكرولتر من الراتنج ني NTA حسب protocols16،17 المنشورة سابقا.
7. تحديد تركيز البروتينات تنقيته بواسطة برادفورد ملزم صبغ assay18 وتوصيف لحجم ونقاء من قبل الانفصال والتصور من 10-50 ميكروغرام مع Coomassie وصمة عار على جل SDS-الصفحة (انظر الشكل 2).
   ملاحظة: في هذه المرحلة البروتينات يمكن وصفها بمزيد من الأساليب التي تقيم البروتين تجميع ¹⁹ أو للطي ²⁰ تبعا لطبيعة مستضد ومتطلبات خط أنابيب الاختيار.

2. إعداد والمعايرة للمكتبة فاجي

1. اختيار مستعمرة واحدة من مقاومة للفج T1 E. القولونية الخلايا في 1 مل من وسائل الإعلام 2YT تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل التتراسيكلين.
2. وبمجرد إنشاء نمو الخلايا بصريا، وتمييع الثقافة في حجم أكبر من 2YT تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل التتراسيكلين لضمان وجود كمية كافية من الخلايا للعدوى (عادة 45 ميكرولتر في مكتبة التخفيف، انظر أدناه).
3. إعداد مكتبة للاستخدام من قبل عجل فج من عازلة تخزين مع 1/5 من حجم تعقيمها 20٪ PEG-8000، و 2.5 M كلوريد الصوديوم (PEG-كلوريد الصوديوم) تفرخ على الجليد لمدة 30 دقيقة والتكوير عجل فج بواسطة الطرد المركزي عند 12،000 ز س.
4. تجاهل طاف و resuspend عجل فج في حجم مناسب من 1X PBS الرقم الهيدروجيني 7.4، 0.2٪ BSA و 0.05٪ توين (PBT)، وتعديل رس تركيز فج المناسب لتحديدات (إذا لزم الأمر) لضمان تغطية مكتبة كافية. راجع الخطوة 2.9 ومناقشة.
5. تمييع لفج قسامة 5 ميكرولتر في 45 ميكرولتر من 1X PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 في العقيمة لوحة متعددة جيدا، مزيج، وإنشاء سلسلة من التخفيفات 10 أضعاف في المخزن نفسه.
6. إضافة 5 ميكرولتر من كل فج التخفيف إلى 45 ميكرولتر من T1 مقاومة للفج E. القولونية الخلايا في النمو المرحلة السجل (OD ₆₀₀ = 0.4-0.8) في لوحة multiwell آخر، وتغطي مع ختم تنفس واحتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في 2.5 سم شاكر المداري.
7. لوحة 5 ميكرولتر من الخلايا المصابة من كل من الآبار إلى لوحة آغار قبل تحسنت تستكمل مع 100 غرام / مل كربنيسيلين وتنمو O / N عند 37 درجة مئوية حتى المستعمرات مرئية.
8. حساب مجموع فج / مل على النحو التالي:
   فج / مل = عدد المستعمرات على لوحة كربنيسيلين في معظم تمييع عينة × 200 × 10 ^ط (حيث ط = الحد الأقصى الأسطواناتنوفمبر من التخفيفات في المستعمرات التي هي واضحة).
9. لتحديد عدد الآبار مستضد المغلفة لضمان تغطية التنوع مكتبة، وحساب على النحو التالي:
   عدد الآبار مستضد المغلفة المطلوب =
   تغطية أضعاف المطلوب * التنوع مكتبة
   # من فج لكل 100 ميكرولتر

3. اختيار الأجسام المضادة من المكتبات-عرض فاجي

3.1) مستضد الشلل

1. لتجنب تجميد أذاب دورات التي يمكن أن تؤثر على نوعية المستضد وتسهيل التخفيفات، وإعداد البروتين لوحة الأسهم مستضد تطبيع إلى 100X تركيزات العمل (على سبيل المثال، 500 غ مل /) وقسامة في لغير ملزم لوحات 96-جيدا.
2. إعداد لوحات المغلفة مستضد من حلول البروتين الاسهم يوم واحد قبل كل جولة من الاختيارات عن طريق تمييع لوحات من الأسهم مع برنامج تلفزيوني.
3. معطف 96-جيدا عالية لوحات البوليسترين ملزم بروتين مع 100 ميكرولتر من بروتين المستضد GST الموسومة أو سلبي السيطرة عrotein (GST، BSA، neutravidin، الخ) في 5 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني. يهز في 250 دورة في الدقيقة 4 ° CO / N على شاكر صفيحة ميكروسكوبية.
4. إزالة حل البروتين من microplates المغلفة، منع لوحات المغلفة مستضد واختيار السلبية مع 200 ميكرولتر العازلة حظر (0.2٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X درجة الحموضة 7.4) ويهز في 250 دورة في الدقيقة في RT لمدة 1-2 ساعة.
5. بعد حظر، تغسل الصحون المغلفة البروتين منع اربع مرات مع 200 ميكرولتر من 1X PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 مع 0.05٪ توين (PT) العازلة إما يدويا أو باستخدام غسالة صفيحة ميكروسكوبية الآلي.

3.2) مكتبة ما قبل التخليص ومستضد فج الحضانة

1. المستنفدة لمكتبة عدم (أو طلال أبوغزاله)، عرض فج الضد جزء استنساخ ملزمة محددة عن طريق نقل 100 ميكرولتر (10 ¹² فج) من مكتبة فج مستعدة في المخزن PBT لعدد من الآبار المغلفة مع البروتين السيطرة سلبي أو خالية العلامة تقارب البروتين (على سبيل المثال، GST) أي ما يعادل عدد الأهداف واحتضان فجفي الآبار لمدة 1-2 ساعة على RT مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: باسم بديل أو وسائل إضافية لاختيار السلبية، الحضانة ويمكن أيضا أن يؤديها في وجود فائض (5-25 ميكرومتر) البروتين القابلة للذوبان العلامة تقارب (على سبيل المثال، GST) لمواصلة إزالة ملزم العلامة الحيوانات المستنسخة وتعزيز الانتعاش من هدف محدد استنساخ ملزمة.
2. نقل فج طاف من اختيار السلبية لوحات المغلفة مستضد واحتضان لمدة 1-2 ساعة على RT مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة لالتقاط من الحيوانات المستنسخة ملزمة محددة.
3. إزالة فج غير منضم وغسل الآبار للصفيحة ميكروسكوبية 8-15 مرات مع العازلة PT إما يدويا أو باستخدام غسالة صفيحة ميكروسكوبية. إزالة الزائد غسل العازلة فقط قبل شطف.

3.3) شطف، العدوى وفاجي التضخيم

1. في وقت مبكر يوم التحديدات، واختيار مستعمرة واحدة من مقاومة للفج T1 E. القولونية الخلايا في 1 مل من وسائل الإعلام 2YT تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل التتراسيكلين وينمو بمعدل 37 ° C وايعشر اهتزاز في 200 دورة في الدقيقة في شاكر المداري 2.5 سم أو ما يعادلها.
2. وبمجرد إنشاء نمو الخلايا ويمكن أن ينظر إليه من قبل العين، وزيادة حجم وسائل الاعلام مع 2YT تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل التتراسيكلين لضمان وجود كمية كافية من الخلايا للعدوى (عادة 100 ميكرولتر في اختيار جيد).
3. تنمو الخلايا حتى لOD يتم التوصل إلى ₆₀₀ من 0.4-0.8 (حوالي 5-7 ساعة)، ثم إلى أزل فج المربوطة إضافة 100 ميكرولتر من الخلايا إلى لوحة مستضد غسلها ويهز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
4. إضافة M13K07 المساعد فج إلى تركيز النهائي من 1 × 10 ¹⁰ وت م / مل واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
5. نقل الخلايا إلى 1.2 مل من 2YT تستكمل مع 150 ميكروغرام / مل كربنيسيلين و 75 ميكروغرام / مل الكاناميسين في 96-جيدا كتلة بئر عميق مع V-القاع وتنمو O / N عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة في 2.5 سم شاكر المداري.

3.4) إعداد فج وجولات متكررة من SELECنشوئها

1. البكتيريا بيليه بواسطة الطرد المركزي عند 4،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
2. خلط كميات متساوية من supernatants فج من لوحات تكرار في أنبوب صغير 96-جيدا العقيمة صفيحة ميكروسكوبية الصندوق الأزرق، تحييد مع حجم ^عشر 1/10 من 10X PBT والمزيج. جولات كرر اختيار (بدءا من الخطوة 3.1.1) لمدة 3-4 جولات أو حتى لوحظ تخصيب (انظر الأقسام 4. و7.) مقارنة مع البروتين السيطرة سلبي.
   ملاحظة: في الجولات الأولى من الاختيار عندما لا يتوقع الكبير / تخصيب اكتشاف (أي الجولات 1 و 2)، وتحديد حجم المدخلات والمخرجات فج عيارات (الموصوفة في القسم 7 و نتائج ممثل هو موضح في الشكل 3) قد تكون مفيدة في ضمان تركيزات الدنيا فج لتحديدات ناجحة (الموصوفة في مناقشة) وأكثر ملاءمة من ELISAs المجمعة.

4. توصيف من قبل مجمع ELISA

1. معطف 96-كذلك نسبة عالية من البروتين مأزقلوحات البوليسترين جي مع 100 ميكرولتر من GST الموسومة بروتين المستضد أو البروتين السيطرة السلبية (GST، BSA، neutravidin الخ) في 2 ميكروغرام / مل حسب القسم 3.1 ويهز في 4 درجات CO / N.
2. إزالة المستضد الزائد، ومنع لوحة مع 200 ميكرولتر من عرقلة العازلة مع اهتزاز لمدة 1-2 ساعة على RT في 250 دورة في الدقيقة على شاكر صفيحة ميكروسكوبية وغسل أربع مرات مع 200 ميكرولتر عازلة PT إما باليد أو بواسطة الآلية لوحة غسالة.
3. تطبيق 100 ميكرولتر من طاف فج (المخفف 1: 10-1: 20 في المخزن PBT)، ويهز في 250 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة في RT، وغسل لوحة ثماني مرات مع 200 ميكرولتر عازلة PT.
4. إضافة 100 ميكرولتر من مكافحة M13-HRP (1: 5،000 في المخزن PBT). يهز في 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في RT، ثم يغسل لوحة ست مرات مع 200 ميكرولتر عازلة PT ومرتين مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
5. تطبيق 100 ميكرولتر من 1: 1 TMB الركيزة وتطوير ل5-15 دقائق (أو حتى وضعت اللون كبير)، ثم وقف رد فعل من جانب إضافة 100 ميكرولتر من 1 MH ₃ PO ₄ وقراءة لوحة في 450 نانومتر.
6. بشكل عام، والإثراء في برك فج يمكن ملاحظة في جولات 3-4 كنسبة من محددة ملزمة مقابل غير محددة وملزمة لل> 2 (انظر الشكل 4)
   ملاحظة: من المفيد الإشارة إلى إشارة ملزمة المطلقة التي عالية على البروتين العلامة تقارب يشير إلى إثراء المجلدات العلامة محددة (بدلا من المجلدات الهدف)، وهذا إشارة ملزمة المطلقة عالية على البروتين السيطرة سلبي يشير إثراء غير محددة أو " "اللاصقة لزجة.

5. استنساخ التحديد، التسلسل وتوصيف

5.1) عزل واحدة النسخ فاب-فج

1. لعزل الحيوانات المستنسخة الفردية لتسلسل وتوصيف، تصيب حجم ^عشر 1/10 تجمع فج تضخيمها في لT1 مقاومة للفج E. القولونية الخلايا في مرحلة النمو سجل (OD ₆₀₀ = 0.4-0.8) في الدور السفلي لوحة microtiter، وتغطي مع breathaبلي ختم لوحة واحتضان مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C.
2. إعداد 10 أضعاف التخفيفات المسلسل في وسائل الإعلام و2YT لوحة بها على لوحات أجار منفصلة تستكمل مع 100 غرام / مل كربنيسيلين.
3. اختيار المستعمرات واحد في 450 ميكرولتر من وسائل الإعلام 2YT / الكربوهيدرات تستكمل مع 1 × 10 ⁹ M13K07 فج / مل وتنمو O / N في مصغرة أنبوب 96 معقمة جيدا صفيحة ميكروسكوبية المربع الأزرق احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
4. البكتيريا بيليه من خلال الدوران في 4،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
5. نسيلي فج طاف يمكن استخدامها لالتسلسل من الحيوانات المستنسخة فاب-فج (كما هو موضح في القسم 5.4) أو نسيلي ELISAs لتحديد خصوصية ضد المستضدات يجمد (كما هو موضح في القسمين 5.3 و ²¹⁾ التي تظهر نتائج ممثلة في الشكل ملزمة المباشر 5.

5.2) التعبير من الحيوانات المستنسخة فاب لتوصيف

1. بعد استنساخ في لبريد المناسبناقلات xpression (انظر مناقشة)، واختيار واحد E. القولونية المستعمرات تحولت مع التعبير يبني في ل1 مل من 2YT وسائل الإعلام / الكربوهيدرات في لوحة 96 بئر عميق جيدا باستخدام معقم مسواك أو ماصة طرف وتنمو لمدة 12-16 ساعة عند 37 ° C مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. ويمكن القيام بذلك إما يدويا أو مع منقار مستعمرة الآلي.
2. ¹⁵ نقل 40 ميكرولتر من تنامي ثقافة إلى 1.5 مل من وسائل الإعلام NZY تستكمل مع الجلوكوز / اللاكتوز / الجلسرين في 96 كتلة deepwell كذلك في منهجية الدارس وآخرون.
   ملاحظة: بالتناوب، والخلايا يمكن زراعتها لمدة 3-4 ساعة (OD 0،8-1،0) في غير تستكمل وتعبير البروتين الناجم عن إضافة 1 ملم IPTG.
3. تغطية كتلة الثقافة (s) مع ختم تنفس والتعبير عن استنساخ فاب لمدة 6-8 ساعة عند 30 ° C مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة. لوحات تدور في 4،000 x ج لمدة 15 دقيقة لتكوير الخلايا البكتيرية، وإزالة طاف، بطانات مع ختم احباط وتجميد الكريات في -20 درجة مئوية حتى تحلل.
4. تحرير فابز أعرب من الكريات جمعها مع 100 ميكرولتر من تحلل العازلة (تريس حمض الهيدروكلوريك 50 مم، 200 مم كلوريد الصوديوم، 1.25٪ تريتون X-100 درجة الحموضة 8.0 مع 1mg / مل الليزوزيم و 10 U benzonase / مل الثقافة ومثبطات الأنزيم البروتيني) وتهتز لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
5. إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي عند 4،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وجمع طاف المحللة الخام لاستخدامها في توصيف الأولي للخصوصية التي كتبها لوحات ELISA (انظر القسم 5.3).

5.3) توصيف استنساخ كتبها المباشر ملزم نسيلي فاب ELISA

1. شل مستضدات كما هو موضح في القسم 3.1 بدلا aliquotting 30 ميكرولتر من 2 ميكروغرام / مل مستضد في برنامج تلفزيوني إلى الآبار من 384 لوحة جيدا. يمكن تخطيطات مستضد القائم على رباعية في لوحة تسهيل نقل الكاشف عند استخدام 96 القائم على قناة رؤساء الاستغناء. غسل وكتلة لوحات ELISA حسب القسم 3.1.
2. لست] مسح تم جمعها من القسم 5.2 يمكن تطبيقها مباشرة على مستضد يجمد لإيفاluation ملزمة. احتضان 30 ميكرولتر من المحللة لكل بئر لمدة 15 دقيقة في RT مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: يمكن بالتناوب تنقية فاب البروتين استنساخ يتم استخدامها من قبل تمييع إلى 10 ميكروغرام / مل في المخزن PBT وتطبيق 30 ميكرولتر من كل نسخة إلى الآبار سدت تحتوي على المستضد أو سلبي البروتين السيطرة (GST، BSA الخ) وتطوير بنفس الطريقة وصفه أدناه. بالتناوب، ويمكن أيضا فاب-فج يتم استخدامها من قبل تمييع 10 ميكرولتر من فج طاف (الموصوفة في القسم 5.1) في 20 ميكرولتر عازلة PBT (1: 3)، والكشف عن الأجسام المضادة مع مكافحة M13-HRP (الموصوفة في خطوات 4،4-4،5)
3. إزالة المحللة الزائد وغسل الآبار إما يدويا أو باستخدام لوحة الآلي غسلها 8X مع 100 ميكرولتر من العازلة PT وإزالة عازلة الزائد.
4. احتضان 30 ميكرولتر من 1: 5،000 التخفيف من الثانوي الأجسام المضادة لمكافحة FLAG في المخزن PBT لمدة 30 دقيقة في RT مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة.
5. غسل وتطوير وقياس وفقا أقسام 4،3-4،5.
   ملاحظة: ممثل النتائجوتظهر توضح استنساخ ملزمة على حد سواء محددة وغير محددة في الشكل (5).

5.4) تسلسل استنساخ

1. إعداد مزيج الرئيسي PCR كما هو مبين في الجدول 2.
2. إضافة 2 ميكرولتر من القالب PCR المناسب (إما فج طاف أو إعادة علقت واحدة المستعمرة التي تحتوي على phagemid البكتيرية) إلى 20 ميكرولتر من PCR مزيج الرئيسي أعد مع الاشعال المناسبة في الآبار لوحة PCR.
   ملاحظة: هناك حاجة يمزج سيد منفصلة للتسلسل كل من سلسلة الجينات الثقيلة والخفيفة.
3. تشغيل رد فعل PCR باستخدام المعلمات المدرجة في الجدول 2 - إعدادات PCR.
4. تحقق من نجاح للتفاعل PCR عن طريق خلط 5 ميكرولتر من رد فعل مع الانتهاء من صبغ تحميل على هلام الاغاروز 1٪ تستكمل مع وصمة عار التصور الحمض النووي والتصوير على نقل transilluminator 300 نانومتر.
5. إضافة 2 ميكرولتر من الناتج PCR إلى 10 ميكرولتر من الماء المعقم تحتوي على 0.2. ميكرولتر كل من نوكلياز خارجية والقلوية الروبيان الفوسفاتيز واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تليها تثبيط انزيم في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإزالة الاشعال الزائدة استعدادا لالتسلسل.

6. تحجيم لالآلي مختارات

6.1) القائم على ماصة المناولة السائلة

1. إعداد 1٪ (ث / ت) الأزرق برموفينول في الماء وإزالة جزيئات غير قابلة للذوبان باستخدام 0.45 مل التصفية.
2. لتحديد نطاق الخطي للالامتصاصية على قارئ لوحة، وإعداد 1: 1،000 التخفيف من 1٪ برموفينول حل الأزرق في الماء، والاستمرار مع اثنين أضعاف التخفيفات المتسلسلة (مجموع 16 التخفيفات).
3. نقل 100 ميكرولتر من كل تخفيف إلى أسفل 96 لوحة جيدا مسطحة وقراءة الامتصاصية في 590 نانومتر. مؤامرة الامتصاصية المطلق مقابل عامل التخفيف واختيار التخفيف في منتصف إلى نهاية عالية من مجموعة خطية للاختبارات لاحقة.
4. إضافة برموفينول الأزرق للماء أو إلى حل الفعليالتي سيتم pipetted بناء على التخفيف المختارة في الخطوة السابقة بكميات كافية لpipetting للثلاثة 96 لوحات جيدة، بالإضافة إلى حجم القتلى في الخزان.
5. معايرة pipettor على قناة واحدة لتقديم حجم اختبار من قبل pipetting الماء على التوازن التحليلي (100 ميكرولتر من المياه تزن 100 ملغ في RT).
6. باستخدام pipettor معايرة، ونقل حجم اختبار من الحل مصبوغ للا يقل عن ثلاثة آبار لأسفل 96 لوحة جيدا مسطحة وقراءة الامتصاصية الخاصة بهم في 590 نانومتر، في ثلاث نسخ.
7. تزن ثلاثة مسطحة القاع 96 لوحات جيدا فارغة على الميزان التحليلي وتسجيل كتلها.
8. ماصة حجم اختبار من الخزان إلى كل من الثلاثة 96 لوحات جيدة وقياس الامتصاصية الخاصة بهم في 590 نانومتر، في ثلاث نسخ.
9. تزن كل لوحة وحساب الفرق في الكتلة.
10. أولا، تقييم ما إذا كانت الامتصاصية في كل بئر موحدة ضمن مجموعة من التسامح (على سبيل المثال، +/- 5٪) ومدى توافقهم مع الالامتصاصية الإلكترونية التي حصلت عليها اليد pipetting لمع pipetman معايرة. إذا قنوات معينة هي الإفراط باستمرار أو في إطار تقديم (على سبيل المثال انظر الشكل 6)، اتبع إجراءات إصلاح وكرر الإجراء تقييم حتى جميع القنوات تسليم كميات موحدة.
11. ثانيا، حالما يتم تأكيد كل قنوات لإيصال كميات موحدة، والتحقق من دقة هذا الحجم عن طريق حساب متوسط ​​الفارق الشامل، لكل بئر. على سبيل المثال، فإن مجموعة معالج السائل معايرة تماما لمدة 100 ميكرولتر تقديم 9.60 غرام من الماء لكل لوحة، أو 0.10 غرام من الماء لكل بئر. وإذا كان حجم الحقيقي هو تسليم باستمرار فوق أو تحت حجم المقصود، ومن ثم يمكن تطبيق معامل التصحيح، أي برمجة 110 ميكرولتر من أجل تقديم فعلا 100 ميكرولتر.
    ملاحظة: للحصول على كميات صغيرة، على سبيل المثال، 10 ميكرولتر، استخدم عشرة أضعاف أكثر الأزرق برموفينول في حل مصبوغ، وقبل قسامة 90 ميكرولتر من الماء إلى لوحات جيدة 96 من جهة، للتأكد من أن ABsorbances هي للقياس وسقوط في مجموعة خطية.

6.2) الآلي غسل لوحة

1. شل هدف إيجابي والبروتينات السيطرة السلبية في آبار منفصلة من 96 microplates جيدا (اثنين من لوحات لكل حالة لفحصها) كما هو موضح في القسم 3.1.
2. حجب المواقع غير الملزمة محددة من الحضانة مع عرقلة الحل لساعة واحدة على RT.
3. إضافة متطابقة مأخوذة 100 ميكرولتر من 10 ¹³ وت م / مل حل فاب-فج في PBT لجميع الآبار في جميع لوحات ملزمة استهداف واحتضان مع الإثارة لطيف في RT لمدة 2 ساعة.
4. غسل اثنين من لوحات وفقا لكل حالة، لوحة واحدة للعدوى والمعايرة وصفيحة واحدة للELISA.
5. تقييم فعالية غسل عن طريق العدوى المباشرة إلى البكتيريا والمعايرة (كما هو موضح في القسم 3.3 (دون إضافة M13K07) و7.2.1) أو التطوير مع مكافحة M13 HRP الضد والركيزة اللونية (كما هو موضح في القسم 4).
6. عيارات فج الابام سوف يستنسخ محددة غالبا ما تسفر في حدود 10 ⁵ -10 ⁷ فج / مل من البروتين الذي يجمد ضد استنساخ يربط على وجه التحديد. بعض المتبقية ملزم لبروتين سيطرة سلبية (على سبيل المثال، BSA) أمر متوقع وعموما 10 ² -10 ⁵ فج / لوحظ مل، ولكن عيارات منخفضة جدا (أي.، <10 ¹⁾ يمكن أن يشير غسل صرامة بشكل مفرط، والتي يمكن التنازل مجموعة مختارة.
7. لفج ملزمة يحددها ELISA، مقارنة الإشارات ملزمة المطلقة للبروتينات الإيجابية والسلبية التحكم لتحديد ما إذا كان غسل الروبوتية ما يعادل أنشئت النتائج غسل اليدين (الشكل 7).

6.3) إزالة التلوث لوحة غسالة

1. لبدء تشغيل بروتوكول إزالة التلوث لفحصها.
   ملاحظة: نوصي باستخدام ما لا يقل عن ضعف حجم الخط الكلي، ورئيس ونقع رئيس غسالة لمدة 5 دقائق في 0.5٪ هيبوكلوريت الصوديوم، الاب المخفف الطازجالتبييض التجاري OM (عادة 6٪ هيبوكلوريت الصوديوم).
2. رئيس ونقع رئيس غسالة لمدة 5 دقائق في معقم (تعقيمها) المياه وأخيرا، رئيس النظام حتى خطوط مليئة الهواء.
3. رئيس الخطوط مع الماء المعقم أو غسل العازلة.
4. غسل العقيمة صفيحة ميكروسكوبية 96 جيدا مرة واحدة، وترفع من غسالة وختم مع معقم لوحة الختم. هذا هو لوحة التحكم قبل التلوث.
5. قسامة 100 ميكرولتر من O / N تضخيم ثقافة فج طاف لجميع الآبار من 96 لوحة جيدا.
6. غسل لوحة تحتوي على فج مرة واحدة، ثم إزالة من غسالة وختم بختم طبق من البلاستيك أو احباط. هذا هو لوحة تحكم التلوث.
7. تنفيذ بروتوكول إزالة التلوث التي يجري اختبارها. في هذا المثال، كرر الخطوات من 6.3.1 و6.3.2.
8. غسل صفيحة ميكروسكوبية العقيمة مرة واحدة، ثم إزالة من غسالة والختم. هذا هو لوحة اختبار إزالة التلوث.
9. لوحة 50 ميكرولتر من مرحلة سجل E. القولونية إلى لوحات المعايرة. هذا هو ما قبل infecلوحة تحكم نشوئها.
10. فضها قبل التلوث، التلوث وإزالة التلوث لوحات 96-جيدا وإضافة 100 ميكرولتر من E. القولونية في مرحلة النمو، مرحلة السجل لجميع الآبار، وذلك باستخدام نصائح جديدة للكل بئر.
11. ختم واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في 200 دورة في الدقيقة.
12. لوحة 50 ميكرولتر من الخلايا المصابة من ثلاثة آبار عشوائية من كل لوحة 96-جيدا إلى 10 سم لوحات 2YT / الكربوهيدرات واحتضان عند 37 درجة CO / N.
13. نقل 50 ميكرولتر من الخلايا المصابة من جميع الآبار من كل لوحة لوحات بئر عميقة تحتوي على 1 مل 2YT بالإضافة إلى 100 غ / مل كربنيسيلين لكل بئر وتنمو O / N عند 37 درجة مئوية.
14. كرر بروتوكول إزالة التلوث وترك غسالة خطوط تجف.
    ملاحظة: لا O / N النمو على لوحات أو في الوسط السائل ينبغي مراعاتها على السيطرة ما قبل الإصابة، ومراقبة ما قبل التلوث أو اختبار إزالة التلوث لوحات. ينبغي مراعاتها العديد من المستعمرات والنمو على لوحة تحكم تلوث؛ إذا لم يكن كذلك، أي استنتاجات حول فعاليةويمكن إجراء بروتوكول إزالة التلوث. من الناحية المثالية، فإن لوحات إزالة التلوث تسفر عن أي مستعمرات ولا O / N النمو في أي من الآبار في O / لوحات N. ويمكن زيادة التشدد في بروتوكول إزالة التلوث مع تركيزات التبييض أعلى وأطول نقع مرة ودورات إضافية.

7. الإدخال / الإخراج المعايرة

7.1) معايرات فج الإدخال

1. تمييع قسامة 5 ميكرولتر من فج إلى 50 ميكرولتر مع PBS العقيمة التي تمت تصفيتها وتخلط.
2. إعداد التسلسلي 10 أضعاف التخفيف في برنامج تلفزيوني العقيمة التي تمت تصفيتها إلى 10 ¹⁰ استخدام متعدد القنوات ماصة أو pipettor 96 قناة.
3. تطعيم 5 ميكرولتر من فج مخففة في 45 ميكرولتر من مقاومة للفج T1 E. خلايا القولونية في مرحلة سجل النمو (OD 0،6-0،8)، واحتضان مغطاة ختم تنفس لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C.
4. لوحة 5 ميكرولتر من الخلايا المصابة الدخول إلى LB / لوحة أجار تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل كربنيسيلين واحتضان O / N لر 37 ° C.
5. ويمكن تقدير تركيز فج من العينة الأكثر المخففة التي تظهر المستعمرات وفقا لحسابات بالتفصيل في القسم 2.8.

7.2) الناتج فج Pitrations

1. وبعد شطف من متجهة لوحة فج من خلال إضافة E. القولونية الخلايا، تمييع قسامة 5 ميكرولتر من الخلايا المصابة فج إلى 50 ميكرولتر مع وسائل الإعلام 2YT تعقيمها
2. إعداد التسلسلي التخفيف 10 أضعاف في وسائل الإعلام 2YT تعقيمها إلى 10 ⁶ باستخدام ماصة متعدد القنوات أو 96 قناة pipettor.
3. لوحة 5 ميكرولتر من الخلايا المصابة إلى لوحة أجار تستكمل مع 100 ميكروغرام / مل كربنيسيلين واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
4. ويمكن تقدير تركيز فج من العينة الأكثر المخففة التي تظهر المستعمرات وفقا لحسابات بالتفصيل في القسم 2.8.
   ملاحظة: في كلتا الحالتين (أي المدخلات والمخرجات فج عيارات، مقارنة مع أرقام مستعمرة على كل من التتراسيكلين (إجمالي سلل رقم) والكانامايسين (المساعد فج عيار) يمكن أيضا أن تكون غنية بالمعلومات.

النتائج

وقد تم استخدام بروتوكول الموصوفة هنا لعزل شظايا الأجسام المضادة لمجموعة متنوعة من كلا structurally- والمتعلقة ظيفيا المجالات مستضد من اندماجي-عرض فج المكتبات فاب بشكل متواز. القضايا المتعلقة توافر مستضد يمكن التحايل، في كثير من الحالات، من خلال تحديد سيليكون في المجالات مستضد التعبير عنه التي هي مناسبة لاختيار الأجسام المضادة ^23. وذلك بربط المستضد التعبير لاختيار الأجسام المضادة داخل نفس المختبر (الشكل 1) يصبح ممكنا لبناء خط أنابيب المتكاملة، التي المعل...

المناقشة

عند إجراء التحديدات في الأجسام المضادة في المختبر، وهما المحددات الأساسية لنجاح الاختيار هي 1) عزل أهداف المستضدات مطوية جيدا لاختيار عليه و2) توفر وظيفية مكتبة تنوع الأجسام المضادة عالية. في كثير من الحالات، وتوافر كميات كافية من مطوية جيدا، بروتين كامل طول يمكن الحد. نهج واحد للتغلب على هذا القيد هو استخدام المجالات التي تم تحديدها من تحليل بيوينفورمتيك ²² و مركبة للالإدراج في ناقلات التعبير البكتيرية مع علامة تقارب المناسبة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
المواد
نيو برونزويك Innova44 شاكر حاضنة قابل للتكديس	Eppendorf	M1282-0004
Liquidator 96 قناة نظام ماصة يدوي منضدة	Anachem Ltd	LIQ-96-200
Microplate shaker	VWR	12620-926
ThermoScientific Sorvall ST-40 جهاز طرد مركزي منضدة	المنتج الحراري	75004525
ELx405 حدد غسالة Microplate Deep	Biotek	ELX405USD
روبوت اختيار العاثيات الآلي عالي الإنتاجية	المخصص S & P Robotics
أنبوب الصقر البلاستيكي المخروطي: 50 مل	VWR	21008-178
أنبوب الصقر المخروطي البلاستيكي: 15 مل	VWR	89039-668
Axygen 1.7 مل أنابيب الطرد المركزي	الدقيقة Corning	MCT-175-LC
96-well / 384-well Maxisorp لوحة	Sigma	M9410-1CS
Corning 96-well V-bottom كتلة	البئر العميقCorning	3960
Axygen Mini-tube 96 جيدا صندوق أزرق معقم	Corning	AXY-MTS-06-C-R-S
فيلم ختم للوحة لاصقة قابلة للتنفس	VWR	60941-084
الكواشف
	رقم		كتالوج الشركة
البولي إيثيلين جلايكول	Bioshop	PEG800.1
مستخلص الخميرة	Bioshop	YEX401.1
bio-tryptone	Bioshop	TRP402.1
N-Z أمين	سيجما	C7290
الجلوكوز	سيجما	G8270-1KG
اللاكتوز	Bioshop	LAC234
الجلسرين	Bioshop	GLY001.500
carbenicillin   ؛	Bioshop	CAR544.10
كاناميسين	بيوشوب	KAN201.25
التتراسيكلين	Bioshop	TET701.25
Tween 20	Bioshop	TWN510.500
أحادي القاعدة فوفات البوتاسيوم	Bioshop	PPM302.1
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة	Anachemia	84486-440
كلوريد الصوديوم		Bioshop SOD001.10
كلوريد البوتاسيوم	Bioshop	POC308.1
كلوريد الكالسيوم	Bioshop	CCL302.500
كبريتات المغنيسيوم	EMD	MX0070-1
كلوريد المغنيسيوم	Bioshop	MAG510.500
NH4< / sub>Cl	Amresco	0621-1KG
Na2< / sub>SO4< / sub>	Bioshop	SOS513.500
أجار	Bioshop	AGR001.500
SybrSafe DNA gel stain	Invitrogen	S33102
حمض الفوسفوريك	Acros Organics	201140010
ليزوزيم	Bioshop	LYS702.25
البنزوناز	نوفاجين	71205
Triton X-100		Bioshop	TRX506.500
كوكتيل مثبط البروتياز أقراص	روش	11 836 170 001
راتنج Ni-NTA	Qiagen	1018240
1,000x العاثية المساعدة (M13K07) مخزون (1013< / sup> عاثية لكل مل) NEB		N0315S
HRP مترافق الجسم المضاد الخاص ب M13 (مضاد ل M13-HRP).	GE Healthcare	27-9241-01
ركيزة TMB: امزج كميات متساوية من TMB و H2< / sub>O2< / sub> ركيزة بيروكسيداز   ؛	KPL	50-76-00
dNTPs	Biobasic	DD0056
Taq polymerase	Genscript	E00007
Exonuclease	GE Healthcare   ؛	EZ0073X-EZ
روبيان قلوي فوسفاتيز	GE للرعاية	الصحية E70092Z-EZ