مقالة منهجية

التصوير في الوقت الحقيقي من واحدة المهندسة رنا النصوص في الخلايا الحية عن طريق Ratiometric ثنائي الجزيء منارات

DOI:

10.3791/51544

⸱

أغسطس 6, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania, 2Integrated DNA Technologies, Inc.

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منارات ثنائي الجزيء Ratiometric (RBMBs) يمكن استخدامها لصورة واحدة نسخ RNA هندسيا في الخلايا الحية. هنا، نحن تصف إعداد وتنقية RBMBs، والتسليم من RBMBs إلى الخلايا عن طريق microporation والتصوير الفلورسنت النصوص RNA واحدة في الوقت الحقيقي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدى إدراك متزايد أن كلا من التنظيم الزماني والمكاني في التعبير الجيني يمكن أن يكون لها عواقب مهمة على وظيفة الخلية إلى تطوير تقنيات مختلفة لتصور النصوص الفردية RNA في الخلايا الحية واحدة. أسلوب واحد الواعدة التي تمت مؤخرا وصفت تستخدم تحقيقا القائم على قليل النوكليوتيد البصرية، ratiometric منارة ثنائي الجزيء (RBMB)، للكشف عن النصوص RNA التي تم تصميمها لاحتواء أربعة على الأقل يكرر جنبا إلى جنب من تسلسل الهدف RBMB في المنطقة 3'-غير مترجمة. صممت خصيصا لRBMBs تنبعث منها إشارة مشرق الفلورسنت على التهجين إلى RNA مكمل، لكن على خلاف ذلك تبقى مروي. استخدام مسبار الاصطناعية في هذا النهج يتيح صامد، أحمر تحول، والأصباغ العضوية انبعاثاتها للغاية لاستخدامها في التصوير. ربط RBMBs متعددة إلى RNA محاضر النتائج هندسيا في بقع منفصلة مضان عندما ينظر إليها تحت المجهر الفلورسنت واسعة المجال. وبالتالي، فإن حركة النصوص RNA الفردية يمكن تصور بسهولة في الوقت الحقيقي من خلال اتخاذ سلسلة زمنية من الصور الفلورسنت. نحن هنا وصف إعداد وتنقية RBMBs، والتسليم في الخلايا عن طريق microporation والعيش خلية التصوير النصوص RNA واحدة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعبير وتنظيم محاضر RNA هو عملية معقدة وديناميكية هي المسؤولة إلى حد كبير عن السيطرة على سلوك الخلية ومصير. على الرغم من أهمية RNA في فرض وظيفة الخلية كان معروفا لبعض الوقت، غالبا ما يكون من الصعب رسم وصلات واضحة بين الاثنين لأن معظم أدوات التحليل RNA تفتقر إلى القرار المكانية والزمانية اللازمة لالتقاط الأحداث التنظيمية الهامة مثل النسخ انفجار، RNA الاتجار، ومعالجة RNA محلية. وقد أدى ذلك إلى ظهور العديد من التقنيات التي تسمح النصوص RNA الفردية أن تصور في الخلايا الحية في الوقت الحقيقي 1. ولعل أبرز هذه التقنيات تستخدم انصهار بروتين GFP-MS2 لاستهداف RNA التي تم تصميمها لاحتواء يكرر جنبا إلى جنب لموقع ملزمة MS2 في 3'-UTR 2،3. من خلال جلب جزيئات GFP متعددة في مقربة، تظهر النصوص RNA الفردية البقع الفلورسنت ومشرقعبر مضان المجهري. وقد وفرت نظام GFP-MS2 نظرة غير مسبوقة في السلوك RNA، بما في ذلك التصور المباشر وقياسات النسخي انفجار 4،5، كشف فريد التعريب شبه الخلوية والمعالجة 6-9، في الوقت الحقيقي والتصوير النقل RNA 10. ومع ذلك، على الرغم من الإمكانات الهائلة للنظام GFP-MS2، يمكن غير منضم GFP-MS2 البروتينات الانصهار إنشاء إشارة الفلورسنت الخلفية العالية التي تحد من التنوع والنطاق الديناميكي لهذه التقنية. وقد وضعت عدة طرق للحد من هذه الإشارة الخلفية، بما في ذلك التقسيم التحت خلوية من غير منضم GFP-MS2 10، البروتين جزء تكامل 11، وRNA ملزم البروتينات البديلة ويستهدف 12. ومع ذلك، كل هذه الأساليب لا تزال حساسة إلى التعبير النسبي والكلي للهدف RNA والبروتين GFP-MS2 الانصهار.

باعتبارها وlternative إلى أنظمة GFP-MS2، قد استخدمت أيضا منارات الجزيئية للكشف عن النصوص RNA هندسيا مع تكرار جنبا إلى جنب لموقع ملزم التكميلي في 3'-UTR 13،14. منارات الجزيئية هي تحقيقات قليل النوكليوتيد تشكيل دبوس الشعر التي وصفت في نهاية واحدة مع وفاكهه تقضي على الطرف الآخر مع مراسل الفلورسنت. عندما لا تكون ملزمة لاستهداف RNA مراسل الفلورسنت وفاكهه تقضي تبقى على مقربة، مما أدى إلى حالة منخفضة الفلورسنت. على التهجين، ويضطر مراسل الفلورسنت وفاكهه تقضي على حدة ويتم استعادة مضان. على غرار نظام GFP-MS2، ربط منارات الجزيئية متعددة على واحدة النتائج RNA نسخة في بقعة مضيئة الفلورسنت التي يمكن تحديدها بواسطة المجهر مضان. ومع ذلك، من المتوقع أن تكون أقل من ذلك بكثير، وذلك بسبب التكوين مروي من منارات الجزيئية غير منضم مضان الخلفية. للأسف، على الرغم من أن آلية تفعيل ذكية وهو مدرج في متصميم منارة olecular، هناك الآن أدلة متزايدة على أن الغير مهجنة منارات الجزيئية لا تبقى في التشكل عند منعطف حاد أدخلت الخلايا الحية. وبالتالي، فإنها تولد إشارة إيجابية كاذبة أن يخفف كثيرا للإشارة إلى الخلفية. للتغلب على هذا القصور، وضعنا مؤخرا تحقيقا اصطناعي جديد لتصوير RNA في الخلايا الحية، منارات ثنائي الجزيء ratiometric (RBMBs، الشكل 1A) 15،16. وتتكون من شقين RBMBs قليل النوكليوتيد 2'-O-الميثيل التي تشكل هيكل هجين مع ميزات من كلا دبوس الشعر القصير RNA (shRNA) ومنارات الجزيئية. آلية حلقة وتفعيل مضان مشابهة لمنارة الجزيئية، في حين أن نطاق طويل مزدوج تقطعت بهم السبل مع عبء 3'-UU هو أكثر سمة من shRNA. تم تصميم ميزات shRNA لدفع التصدير النووي الذي وجدنا زيادة عمر الخلايا إلى> 24 ساعة، مع الحد الأدنى من تحلل ملحوظ، ويمنع فتح غير محددة من الحلقة. ونتيجة لذلك RBMBs تظهر خلفية إشارة إلى أعلى بكثير من منارات الجزيئية.

تجدر الإشارة إلى أن RBMBs لا يمكن إعدادها باستخدام أليغنوكليوتيد] الحمض النووي، منذ تحقيقات المعتمدة على الحمض النووي لا تمتلك نفس القدرات التصديرية النووية تحقيقات القائم على الحمض النووي الريبي. هيكليا، تم تصميم حلقة RBMB عادة ما بين 15 و 21 قواعد طويلة، لخلق التوازن بين الخصوصية والانتقائية على RNA التهجين. تم تصميم جذع قصير الذي يشكل من نطاقات مكمل النفس اثنين عادة ما يكون 4 القواعد. إذا تم تحديد الجذعية أطول، فإن معدل التهجين بين حلقة RBMB وRNA الهدف هو تباطأ بشكل ملحوظ 17،18. على العكس، عندما يتم تحديد تسلسل الجذعية أقصر درجة حرارة انصهار غالبا ما تكون منخفضة جدا للحفاظ على الهيكل الجذعية حلقة عند 37 درجة مئوية، مما يؤدي إلى إشارة خلفية عالية. خصوصية RBMB هي أيضا حمراءuced كما هو تقصير طول الساق. منذ تسلسل RBMB الجذعية حلقة يمكن أيضا أن تؤثر على الأداء RBMB، فإنه يجب أن يتم اختيار بعناية 19. على وجه الخصوص، ينبغي أن يكون تسلسل حلقة مثالية الحد الأدنى من هيكل الثانوي، هجن لتسلسل RNA مع الحد الأدنى من هيكل الثانوي، وتجنب مواقع الربط البروتين، وتجنب خارج هدف ملزم. التوقعات كل RBMB وRNA هيكل الثانوي يمكن الحصول عليها باستخدام برنامج مثل mfold 20. يمكن تحديد التكميلية خارج المواقع المستهدفة باستخدام أداة بسيطة المحلية تعيين بحث النوكليوتيدات (انفجار). ومع ذلك، بسبب التضارب في توقعات النموذج وصعوبة في تحديد مواقع المتعهدة البروتين، ويجب في نهاية المطاف يمكن التحقق من صحة خصوصية كل RBMBs تجريبيا.

إذا المرغوب فيه، وهو صبغ إشارة غير مروي الذي هو غير حساس للدولة التهجين يمكن أن تضاف إلى RBMB 15. إضافة صبغة مرجعية يمكن للعلاقات العامةأوفيد علامة للتسليم التحقيق واستخدامها للتصوير ratiometric، إذا كانت هناك حاجة قياسات أكثر دقة من إجمالي مضان الخلوية. الأصباغ إشارة تسمح القياسات لتعديلها الاختلافات في الخلفية بسبب خلية الى خلية الاختلافات في التسليم. ومع ذلك، عندما التصوير RNA الفردية النصوص الصبغة المرجعية ليس ضروريا. والجدير بالذكر، أن بعض الأصباغ إشارة تتداخل مع تصدير RBMBs من النواة، مما أدى إلى إشارة الخلفية أعلى قليلا في النواة.

عندما تكون مصممة بشكل صحيح، RBMBs يمكن استخدامها لنسخ صورة RNA الفردية في الخلايا الحية واحدة، إذا تم تصميم الحمض النووي الريبي الهدف لاحتواء أربعة مواقع على الأقل RBMB ملزم (الشكل 1B) 16. RBMBs يمكن تقديمها بكفاءة إلى مجموعة واسعة من أنواع الخلايا عبر microporation، مع قليل من دون التأثير على الخلايا الحيوية 21، والقياسات الكمية في التعبير الجيني يمكن أن تكونحصلت في غضون 30 دقيقة. وعلاوة على ذلك، فإن المنهجية هي حساسة نسبيا لمستويات تركيز RBMB وRNA الهدف، منذ مضان من RBMBs غير منضم تطفئ بكفاءة. هنا نقدم وصفا مفصلا للمنهجية المستخدمة في إعداد وتنقية RBMBs، فضلا عن إجراء عام لتقديم RBMBs في الخلايا الحية عبر microporation والتصوير النصوص RNA واحدة في الوقت الحقيقي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، وصفت قليل النوكليوتيد واحد (RBMB1) في جلساتها 5'النهاية مع مراسل صبغ CF640R ولها تسلسل: 5'- mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC مو mGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC MUMU-3. نطاقات مكمل الذات، مما يؤدي بدوره تشكيل هيكل دبوس الشعر، وبالخط العريض. وصفت قليل النوكليوتيد الثاني (RBMB2) في نهاية 3'مع فاكهه تقضي أيوا الأسود RQ-SP ولديه تسلسل: 5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3.

1. إعداد RBMBs

  1. تدور إجراء سريع للأنابيب تحتوي على RBMB1 وRBMB2 أليغنوكليوتيد]، لضمان قليل النوكليوتيد المجففة في الجزء السفلي من الأنبوب، وresuspend في الدناز وريبونوكلياز خالية من المياه إلى تركيز النهائي من 100 ميكرومتر. على سبيل المثال، ينبغي معلق على 10 عينة من nmole قليل النوكليوتيد في 100 ميكرولتر من المياه.
  2. مياسلدى عودتهم تركيز الدقيق للعينات RBMB1 والأسهم RBMB2 بواسطة الأشعة فوق البنفسجية في مواجهة الطيفي.
    1. مزيج 3 ميكرولتر من العينة RBMB مع 117 ميكرولتر DPBS (بدون الكالسيوم والمغنيسيوم) في أنبوب microcentrifuge.
    2. فارغة لطيفي مع DPBS وقياس الامتصاصية 200-800 نانومتر. ملاحظة: قمة الامتصاصية في 260 نانومتر و 650 نانومتر يجب أن تكون مرئية.
    3. حساب تركيز الأسهم من العينات RBMB على أساس الامتصاصية في 260 نانومتر (أو 650 نانومتر لRBMB1)، وذلك باستخدام المعادلة:
      الأسهم التركيز (M) = A * 260 عامل التخفيف / معامل الانقراض حيث A 260 هو الامتصاصية في 260 نانومتر وعامل التخفيف و40.
      ملاحظة: معامل الانقراض لRBMB يمكن العثور على ورقة المواصفات المقدمة من قبل الشركة المصنعة قليل النوكليوتيد. معامل انقراض CF640R في 650 نانومتر هو 103،000.
  3. مزيج 20 ميكرولتر من 100 ميكرومتر RBMB1، 30 ميكرولتر من 100 ميكرومتر RBMB2، 6 ميكرولتر 10X، عازلة الفوسفات (10X العازلة الفوسفات: 480 ملم K 2 هبو 4، 45 ملي KH 2 PO 4، 140 ملي ناه 2 ص 4، ودرجة الحموضة 7.2) و 4 ميكرولتر الدناز وريبونوكلياز خالية من المياه. احتضان الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: هذا هو عادة كافية لحوالي 50 دراسة.
  4. إعداد العمود اللوني السائل باستخدام 75 الإعدادية الصف Superdex لإزالة أي أليغنوكليوتيد] RBMB2 الغير مهجنة. استخدام 8 مل (0.7 × 20 سم) العمود اللوني السائل مع ~ 4 مل حجم السرير لتنقية صغر حجم المجسات مختلطة.
  5. غسل وتتوازن مع Superdex ~ 50 مل من العازلة الفوسفات 1X باستخدام مضخة محقنة على التوالي في تدفق بمعدل تدفق 0.6 مل / دقيقة. قبل كل من السائل يدخل حجم السرير، ووقف ضخ حقنة، سلخه، وترك السائل المتبقي تمر العمود بفعل الجاذبية.
  6. تحميل الخليط RBMB (60 ميكرولتر) على العمود اللوني.
    1. بعد العينة RBMB لها تمامادخلت السرير، إضافة ببطء 250 ميكرولتر من العازلة الفوسفات آخر 1x إلى الجزء العلوي من السرير لضمان أن العينة كلها قد دخل تماما العمود.
    2. ملء العمود إلى حافة مع العازلة الفوسفات 1X. إغلاق الأعلى، وبدء ضخ حقنة - ينبغي أن تملأ المحقنة مع ~ 50 مل 1X PBS وتشغيل بمعدل تدفق 0.6 مل / دقيقة.
    3. بمجرد أن تقترب RBMB الجزء السفلي من العمود - يمكن عادة العينة RBMB يمكن تصور بسهولة بسبب لون الصبغة دمجها في التحقيق - جمع من خلال تدفق في 2 قطرات في أنبوب microcentrifuge (1.5 مل). وقف جمع عينة مرة واحدة لون داخل أنابيب microcentrifuge يصبح واضحا.
  7. الجمع بين الأنابيب التي تحتوي على عينة RBMB الملونة - عادة 5-6 الأنابيب - وتحميلها إلى جهاز الطرد المركزي فلتر (10،000 ميجاوات قطع). أجهزة الطرد المركزي لعينة في إطار التعاون الإقليمي 10،000 لمدة 20 دقيقة أو حتى حجم المطلوب. ملاحظة: هذه السرعات وأوقات وعادةتسفر عن الحجم النهائي من ~ 30 ميكرولتر.
  8. قياس تركيز الدقيق للعينة RBMB تنقيته بواسطة الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيفي.
    1. يستغرق 3 ميكرولتر من العينة RBMB المركزة وتخلط مع 117 ميكرولتر DPBS في أنبوب microcentrifuge.
    2. فارغة لطيفي مع DPBS وقياس الامتصاصية 200-800 نانومتر. ملاحظة: قمة الامتصاصية في 260 نانومتر و 650 نانومتر يجب أن تكون مرئية.
    3. حساب تركيز الأسهم من RBMB تهجين على أساس الامتصاصية في 650 نانومتر، وذلك باستخدام المعادلة:
      الأسهم التركيز (M) = A * 650 عامل التخفيف / معامل انقرضت حيث A 650 هو الامتصاصية في 650 نانومتر، عامل التخفيف هو 40.
      ملاحظة: معامل الانقراض لCF640R في 650NM هو 103،000 ومعامل الانقراض لأيوا الأسود هو RQ ~ 20،000. معاملات الانقراض هي المضافة وليست حساسة لالتهجين. وبالتالي فإن عينة الأسهم RBMB لديها معامل الانقراض مجتمعة approximatelص 123،000 في 650 نانومتر.
  9. تسمية أنبوب مناسب مع اسم والتركيز وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

2. إعداد بولي د يسين المغلفة 8 جيدا تشامبيريد ساترة

  1. إعداد محلول 0.2 ملغ / مل بولي-D-يسين عن طريق إذابة 5 ملغ بولي-D-يسين (مسحوق مجفف بالتجميد، ز المشع) في 25 مل من الماء المعقم في بيئة معقمة.
  2. إضافة 200 ميكرولتر من 0.2 ملغ / مل من محلول بولي D-يسين إلى كل بئر من ساترة 8 غرف جيدا، في بيئة معقمة.
  3. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 16-18 ساعة في الثقافة هود الخلية.
  4. نضح بولي-D-يسين ويغسل جيدا 3 مرات بالماء المقطر المعقم. ملاحظة: يمكن تخزين الشرائح الغرفة المغلفة في 4 درجة مئوية.

3. التحقيق التسليم

ملاحظة: يجب أن تستخدم نظام خلية تحتوي على التركيبة الجينية متكامل عن RNA مع 4-متتابعة على الأقل مأزقمواقع لRBMB في المنطقة 3'-غير مترجمة (UTR) جي. يجب أن يكون تسلسل الهدف مكملة لحلقة من RBMB. ينصح بأن كعنصر تحكم السلبية، يتم هندستها خط الخلية نفسها للتعبير عن نفس التركيبة الجينية، ولكن من دون تكرار جنبا إلى جنب. في هذا البروتوكول، خط خلية ليفية البشري، HT1080، تم تصميمها للتعبير عن GFP RNA مع يكرر 96، جنبا إلى جنب من تسلسل الهدف RBMB في 3'-UTR. تم تصميم خط الخلية السيطرة للتعبير عن GFP البرية من نوع RNA.

  1. لوحة الخلايا في قارورة T25 في 40-50٪ confluency يوم واحد قبل التسليم التحقيق. ثقافة الخلايا مع وسائل الاعلام DMEM تستكمل مع 1٪ القلم / بكتيريا و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
  2. في اليوم التالي، بدوره على microporator وإعداد المعلمات microporation إلى 950 V، 2 البقول، 25 ميللي ثانية. ملاحظة: لقد تم تحسين هذه المعلمات للخلايا HT1080، لكنها خلية من نوع يعتمد ويمكن أن تكون adjusتيد لأنواع الخلايا الأخرى كما هو موضح في تعليمات الشركة الصانعة.
  3. ملء أنبوب microporation مع 4 مل عازلة كهربائيا ووضعه على محطة microporation.
  4. إخراج عينة من الأسهم RBMB تنقيته وتذويب ذلك. تمييع عدة ميكرولتر لتركيز النهائي من 12 ميكرومتر مع العازلة 1X الفوسفات. هناك حاجة إلى 1 ميكرولتر لكل microporation.
  5. ماصة 1 مل من مستنبت مع FBS ولكن من دون المضادات الحيوية في أنبوب microcentrifuge. ملاحظة: وسوف تستخدم هذه لتعليق الخلايا مباشرة بعد microporation ويمكن وضعها جانبا، بالقرب من جهاز microporation، في الوقت الراهن. سيتم إدراج المضادات الحيوية في وسائل الإعلام ثقافة تقلل من بقاء الخلية بعد microporation.
  6. إزالة وسائل الإعلام ثقافة خلية من الخلايا HT1080 هندسيا (60-80٪ متموجة)، وغسل الخلايا مع 1 مل 2+ الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ DPBS خالية من مرة واحدة، واحتضان مع 1 مل التربسين لمدة 1-2 دقيقة.
  7. وقف trypsinizatioن وذلك بإضافة 1 مل سائل الاعلام DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، دون المضادات الحيوية والفينول الأحمر، ونقل الخلايا إلى قسمين 1.5 مل أنابيب microcentrifuge.
  8. تدور باستمرار خلايا في أنبوب microcentrifuge في 200 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف، في resuspend والجمع بين الكريات خلية في الحجم النهائي من 1 مل DPBS.
  9. يستغرق 10 ميكرولتر من تعليق خلية مختلطة بشكل جيد والاعتماد على الخلايا.
  10. ماصة الخلايا صعودا وهبوطا عدة مرات للتأكد من أنها فرقت جيدا ونقل 300،000 الخلايا مع DPBS جديد في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وتدور باستمرار في 200 x ج لمدة 5 دقائق.
  11. إزالة طاف، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية. Resuspend وبيليه في 11 ميكرولتر العازلة إعادة تعليق وماصة صعودا وهبوطا عدة مرات للتأكد من أن الخلايا الموزعة توزيعا جيدا. تأكد من عدم توليد أي فقاعات الهواء. ملاحظة: سوف فقاعات الهواء يسبب شرارة أثناء microporation ويؤدي ذلك إلى ضعف تسليم RBMB وموت الخلايا.
  12. إضافة 1 ميكرولتر من RBMB المخفف (12 ميكرومتر) ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. مرة أخرى يكون الحرص على عدم توليد أي فقاعات الهواء.
  13. نضح 10 ميكرولتر من خليط من الخلايا RBMB، وذلك باستخدام ماصة microporation، وإدراج ماصة في أنبوب microporation. دفع زر البدء لبدء microporation. ملاحظة: يجب أن يكون هناك فقاعات الهواء مرئية في الطرف.
  14. عندما يظهر على الشاشة من microporator الانتهاء، إزالة ماصة من المحطة، وطرد الخليط 10 ميكرولتر في أنبوب microcentrifuge التي أعدت في وقت سابق، مع 1 مل الثقافة المتوسطة مع FBS ولكن من دون المضادات الحيوية. المزيج بلطف بواسطة أنبوب هزاز جنبا إلى جنب عدة مرات.
  15. تدور الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق ويغسل خلايا مرتين أخريين، في 1 مل الفينول الأحمر مستنبت الحرة مع FBS ولكن من دون المضادات الحيوية، لإزالة أي RBMBs التي لم يتم تسليمها إلى الخلايا. في resuspend مع 400 ميكرولتر الفينول الثقافة الحرة أحمر المتوسطة مع FBS ولكن من دونالمضادات الحيوية.
  16. لوحة الخلايا microporated في بولي-D-يسين المغلفة ساترة غرف 8 جيدا في 200 ميكرولتر لكل بئر أو في confluency المطلوب.
  17. اختياري: إذا كان من المرغوب فيه صورة النواة، إضافة Hoescht 33342 إلى الخلايا في تركيز النهائي من 0.01 ملغ / مل.
  18. وضع ساترة غرف في حاضنة ثقافة الخلية. احتضان الخلايا لمدة 1-2 ساعة قبل التصوير، حتى أن الخلايا لديها الوقت الكافي ليستقر على سطح ساترة. ملاحظة: التصوير لا يمكن أن يؤديها في أقرب وقت 30 دقيقة بعد microporation.

4. الحصول على الصور

  1. بدوره على مرحلة أعلى خلية النظام الحضانة الحية وتتوازن عليه حتى تصل إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، و 75٪ الرطوبة.
  2. بدوره على مصدر الضوء والمجهر الفلورسنت وفتح برنامج Metamorph. ملاحظة: يمكن أيضا حزم برامج أخرى مشابهة من أجل السيطرة المجهر والحصول على الصور يمكن استخدامها.
  3. تطبيق زيت Immersol لالهدف.
  4. نقل ساترة غرف مع الخلايا microporated إلى مرحلة أعلى خلية النظام الحضانة الحية. احتضان النظام مرحلة أعلى حتى درجة حرارة واستقرت مستويات CO 2.
  5. فتح علامة التبويب اكتساب، في مجال البرمجيات Metamorph. انقر فوق زر إظهار لايف للعثور على الميدان، وضبط التركيز تحت الضوء الأبيض وانقر فوق الزر إيقاف لايف.
  6. تحت علامة التبويب اكتساب، وانقر على زر فتح المنبثقة اكتساب تيار، وإعداد المعلمات اقتناء الفيلم المطلوب. الحصول على 150 لقطة باستخدام فلتر Cy5 / CF640R وحفظ الصور على القرص الصلب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بعد وقت قصير من microporation الخلايا HT1080 بحضور RBMBs، RNA النصوص الفردية التي تم تصميمها لاحتواء متعددة RBMB ملزمة مواقع في هم 3'-UTR تظهر البقع الفلورسنت ومشرق عندما التقط بواسطة اسعة المجال المجهري مضان (الشكل 2). بينما النصوص RNA الفردية مع مواقع الربط عدد قليل من أربعة RBMB يمكن تصويرها في الخلايا الحية، وأكثر RBMB المواقع في 3'-UTR ملزمة، وأقوى إشارة الفلورسنت. وعلاوة على ذلك، وأكثر RBMBs التي لا بد أن كل نص يعد يمكن تصور الحمض النووي الريبي قبل فقدان إشا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على صورة واحدة نسخ RNA هندسيا في الخلايا الحية باستخدام المجهر واسعة المجال التقليدي تتطلب إشارة مشرقة وصامد الفلورية لتترافق مع كل نسخة RNA وخلفية منخفضة الفلورسنت المنبعثة من تحقيقات الفلورسنت غير منضم. في هذه الطريقة، يتم التوصل إلى إشارة الفلورسنت مشرق بواسطة التهجين متعددة (تصل إلى 96) على أساس قليل النوكليوتيد تحقيقات الفلورسنت، أي RBMBs، على كل نسخة الرنا. ومع ذلك، عدد قليل من أربعة مواقع الارتباطات تكفي 16. إشارات الجماعية تؤدي إلى بقعة مشرقة الف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعمل الدكتور مارك Behlke والدكتور لينغ هوانغ بواسطة IDT التي تقدم أليغنوكليوتيد] للبيع مشابه لبعض المركبات وصفها في المخطوطة. IDT هو، ومع ذلك، وليس شركة للتداول العام، وأنها شخصيا لا تملك أي أسهم / أسهم في IDT.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل جائزة مؤسسة العلوم الوطنية التوظيف (0953583) والمعهد الوطني للصحة NCI / R21-CA116102، NCI / R21-CA125088، NIBIB / R01-EB012065، NCI / R01-CA157766.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
تقنيات الحياة الخالية من النوكليازAM9932لا توجد تقنيات DPBS Life المعالجة ب DEPC
14190-144No Ca2 + < / sup> و Mg2 + < / sup>
Cary 100 مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية VisAgilent Technologies
فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدةفيشر ScientificP290-500
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةفيشر ScientificP284-500
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةفيشر ScientificS381-500
أنابيب الطرد المركزيالدقيقة Eppendorf223641111.5 مل
عمود الكروماتوغرافياKimble Chase Life Science420400-07200.7 × 20 سم
Superdex 75 الإعدادية الصفGE الرعاية الصحية17-1044-01
مضخة حقنةبرينتري ScientificBS-300
حقنة BD301035بطرف Luer-lok
MilliporeUFC501096ميجاوات 10،000 قطع
الطرد المركزي 5418Eppendorf
Poly-D-lysineSigma-AldrichP7280-5MGمسحوق مجفف بالتجميد ، مشع g
غطاء زجاجي ذو 8 غرفبغرفة فيشر 155409 علميحجم العمل 0.2-0.5 مل
HT1080ATCCCCL-121خط خلايا الساركوما الليفية البشرية
قارورة ثقافة الخليةكورنينج430639 25 سم 2< / sup>
DMEMLife Technologies11965084نسبة عالية من الجلوكوز
DMEM بدون تقنيات الحياةالحمراء الفينول21063029
مصل الأبقار الجنينيسيجما ألدريتشF2442-500ML
Penecillin / StreptomycinLife Technologies15140122
TrypsinLife Technologies253000540.05٪
نظام تعداء النيونLife TechnologiesMPK5000
مجموعة نظام تعداء النيونLife تقنياتMPK1096
مقياس الدمفيشر ساينتفيك02-671-10
Hoescht 33342Life TechnologiesH1399
IX-81 مجهر مضان مقلوبأوليمبوس
SOLA محرك خفيفLumencor
MetamorphMolecular Devicesالتحكم في البرامج مجهر
زيت Immersol 518Fفيشر Scientific12-624-66B
60 مل ، وحدات تصفية الطرد المركزي عالي الجلوكوز Trypsin-EDTA

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tyagi, S. Imaging intracellular RNA distribution and dynamics in living cells. Nat Methods. 6 (5), 331-338 (2009).
  2. Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Mol Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
  3. Dictenberg, J. Genetic encoding of fluorescent RNA ensures a bright future for visualizing nucleic acid dynamics. Trends Biotechnol. 30 (12), 621-626 (2012).
  4. Chubb, J. R., Trcek, T., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Transcriptional pulsing of a developmental gene. Curr Biol. 16 (10), 1018-1025 (2006).
  5. Muramoto, T., Cannon, D., Gierlinski, M., Corrigan, A., Barton, G. J., Chubb, J. R. Live imaging of nascent RNA dynamics reveals distinct types of transcriptional pulse regulation. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (19), 7350-7355 (2012).
  6. Ewers, H., Smith, A. E., Sbalzarini, I. F., Lilie, H., Koumoutsakos, P., Helenius, A. Single-particle tracking of murine polyoma virus-like particles on live cells and artificial membranes. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (42), 15110-15115 (2005).
  7. Forrest, K. M., Gavis, E. R. Live imaging of endogenous RNA reveals a diffusion and entrapment mechanism for nanos mRNA localization in Drosophila. Curr Biol. 13 (14), 1159-1168 (2003).
  8. Weil, T. T., Forrest, K. M., Gavis, E. R. Localization of bicoid mRNA in late oocytes is maintained by continual active transport. Dev Cell. 11 (2), 251-262 (2006).
  9. Yamagishi, M., Ishihama, Y., Shirasaki, Y., Kurama, H., Funatsu, T. Single-molecule imaging of beta-actin mRNAs in the cytoplasm of a living cell. Exp Cell Res. 315 (7), 1142-1147 (2009).
  10. Fusco, D., et al. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living mammalian cells. Curr Biol. 13 (2), 161-167 (2003).
  11. Ozawa, T., Natori, Y., Sato, M., Umezawa, Y. Imaging dynamics of endogenous mitochondrial RNA in single living cells. Nat Methods. 4 (5), 413-419 (2007).
  12. Daigle, N., Ellenberg, J. LambdaN-GFP: an RNA reporter system for live-cell imaging. Nat Methods. 4 (8), 633-636 (2007).
  13. Bogaard, P. T., Tyagi, S. Using molecular beacons to study dispersal of mRNPs from the gene locus. Methods Mol Biol. 464, 91-103 (2009).
  14. Vargas, D. Y., Raj, A., Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Mechanism of mRNA transport in the nucleus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (47), 17008-17013 (2005).
  15. Chen, A. K., Davydenko, O., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Ratiometric bimolecular beacons for the sensitive detection of RNA in single living cells. Nucleic Acids Res. 38 (14), e148(2010).
  16. Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. , (2013).
  17. Tsourkas, A., Behlke, M. A., Bao, G. Structure-function relationships of shared-stem and conventional molecular beacons. Nucleic Acids Res. 30 (19), 4208-4215 (2002).
  18. Tsourkas, A., Behlke, M. A., Rose, S. D., Bao, G. Hybridization kinetics and thermodynamics of molecular beacons. Nucleic Acids Res. 31 (4), 1319-1330 (2003).
  19. Bao, G., Rhee, W. J., Tsourkas, A. Fluorescent probes for live-cell RNA detection. Annu Rev Biomed Eng. 11, 25-47 (2009).
  20. Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Res. 31 (13), 3406-3415 (2003).
  21. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Efficient cytosolic delivery of molecular beacon conjugates and flow cytometric analysis of target RNA. Nucleic Acids Res. 36 (12), e69(2008).
  22. Zhang, X., et al. Quantitative assessment of ratiometric bimolecular beacons as a tool for imaging single engineered RNA transcripts and measuring gene expression in living cells. Nucleic Acids Res. 41 (15), e152(2013).
  23. Ainger, K., et al. Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected into oligodendrocytes. J Cell Biol. 123 (2), 431-441 (1993).
  24. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends Cell Biol. 20 (7), 380-390 (2010).
  25. Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
  26. Rackham, O., Brown, C. M. Visualization of RNA-protein interactions in living cells: FMRP and IMP1 interact on mRNAs. EMBO J. 23 (16), 3346-3355 (2004).
  27. Valencia-Burton, M., McCullough, R. M., Cantor, C. R., Broude, N. E. RNA visualization in live bacterial cells using fluorescent protein complementation. Nat Methods. 4 (5), 421-427 (2007).
  28. Chen, A. K., Behlke, M. A., Tsourkas, A. Avoiding false-positive signals with nuclease-vulnerable molecular beacons in single living cells. Nucleic Acids Res. 35 (16), e105(2007).
  29. Chen, A. K., Tsourkas, A. Imaging RNA in living cells with molecular beacons: current perspectives and challenges. Journal of Innovative Optical Health Sciences. 2 (4), 315(2009).
  30. Nitin, N., Santangelo, P. J., Kim, G., Nie, S., Bao, G. Peptide-linked molecular beacons for efficient delivery and rapid mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e58(2004).
  31. Santangelo, P. J., Nix, B., Tsourkas, A., Bao, G. Dual FRET molecular beacons for mRNA detection in living cells. Nucleic Acids Res. 32 (6), e57(2004).
  32. Altman, R. B., et al. Cyanine fluorophore derivatives with enhanced photostability. Nat Methods. 9 (1), 68-71 (2012).
  33. Kumaraswamy, S., et al. Fluorescent-conjugated polymer superquenching facilitates highly sensitive detection of proteases. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (20), 7511-7515 (2004).
  34. Yang, C. J., Pinto, M., Schanze, K., Tan, W. Direct synthesis of an oligonucleotide-poly(phenylene ethynylene) conjugate with a precise one-to-one molecular ratio. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (17), 2572-2576 (2005).
  35. Lu, J., Tsourkas, A. Imaging individual microRNAs in single mammalian cells in situ. Nucleic Acids Res. 37 (14), e100(2009).
  36. Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA synthesis in mammalian cells. PLoS Biol. 4 (10), e309(2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Ratiometric Bimolecular BeaconRNA ImagingLive Cell MicroscopySize Exclusion ChromatographyMicro Poration DeliveryFluorescent MicroscopyEngineered RNA TargetSynthetic Probe HybridizationReal time RNA TrackingSingle Molecule Detection

مقالات ذات صلة