يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الأوعية الدموية نقل الجينات من الدعامات المعدنية السطوح عن طريق ناقلات الفيروسة الغدانية مربوط من خلال المتحللة عبر linkers

9.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/51653

⸱

أغسطس 12, 2014

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, The Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

في هذه المقالة

ملخص

تشير هذه الدراسات إلى الارتباط القابل للانعكاس لناقلات الجينات الفيروسية الغدية بالأسطح المعدنية الخالية من الطبقات من الدعامات والأقراص الشبكية النموذجية. يؤدي الإطلاق المستمر للجزيئات الفيروسية المختصة بالتنبيغ المعتمد على التحلل المائي للروابط المتقاطعة المستخدمة في تثبيت النواقل إلى تعبير دائم للجينات المعدلة وراثيا خاصة بالموقع في الخلايا الوعائية وفي الشرايين الدعامات.

الملخص

في الدعامات عودة التضيق يقدم من المضاعفات الرئيسية لإجراءات إعادة التوعي القائم على الدعامات المستخدمة على نطاق واسع لإعادة تدفق الدم من خلال قطاعات ضاقت حاد في الشرايين التاجية والطرفية. الدعامات اللف قادرة على إطلاق الانضباطي الجينات مع النشاط المضاد للrestenotic قد يقدم استراتيجية بديلة لاستخدامها في الوقت الحاضر يبلغ حجمه الدعامات المخدرات. من أجل تحقيق الترجمة السريرية، ويجب أن يبلغ حجمه الدعامات الجينات تظهر حركية يمكن التنبؤ بها، يجمد الدعامة الجين إطلاق النواقل والتنبيغ في مواقع محددة من الأوعية الدموية، مع تجنب الاستجابة الالتهابية المفرطة التي ترتبط عادة مع طلاء البوليمر المستخدمة في فخ المادي للناقلات. وتصف هذه الورقة منهجية مفصلة لcoatless الربط ناقلات الجينات الفيروسة الغدانية إلى الدعامات على أساس ملزمة عكسها من الجسيمات الفيروسة الغدانية إلى polyallylamine البايفوسفونيت (PABT) -modified المقاوم للصدأ السطح الصلب عبر المتحللة-linkers عبر (HC). عائلة مناستخدمت bifunctional (amine- وثيول رد الفعل) HC بمتوسط ​​ر 1/2 من استر المائي في سلسلة تتراوح بين 5 و 50 أيام لربط النواقل مع الدعامات. وعادة ما يتم تنفيذ الإجراء ناقلات الشلل في غضون 9 ساعة، ويتكون من عدة خطوات: 1) حضانة العينات المعدنية في محلول مائي من PABT (4 ساعة). 2) deprotection الجماعات ثيول المثبتة في PABT مع تريس (2 carboxyethyl) الفوسفين (20 دقيقة). 3) التوسع في القدرة على رد الفعل ثيول من سطح المعدن عن طريق تفاعل مع العينات polyethyleneimine derivatized مع pyridyldithio (PDT) مجموعات (2 ساعة). 4) تحويل مجموعات PDT إلى التجولات مع dithiothreitol (10 دقيقة). 5) تعديل الفيروسات الغدية مع HC (1 ساعة). 6) تنقية جزيئات الفيروسة الغدانية تعديلها من قبل الحجم استبعاد العمود اللوني (15 دقيقة) و 7) من تجميد الجسيمات ثيول رد الفعل الفيروسة الغدانية على السطح الصلب thiolated (1 ساعة). هذا الأسلوب له تطبيق واسع محتمل خارج الدعامات،من خلال تسهيل الهندسة سطح الأجهزة bioprosthetic لتعزيز توافق مع الحياة من خلال توصيل الجينات بوساطة الركيزة للخلايا تفاعل المواد الأجنبية مزروع.

المقدمة

ويعوق فعالية العلاج الجيني كطريقة علاجية بواسطة القدرة استهداف الفقراء من ناقلات العلاج الجيني 1،2. عدم وجود نتائج الاستهداف المناسبة في مستويات فرعية علاجية من التعبير التحوير في الموقع المستهدف ويؤدي إلى نشر واسعة من ناقلات إلى أجهزة غير المستهدفة 3، بما في ذلك المسؤولين عن تصاعد الاستجابات المناعية ضد كل من ناقلات والمنتجات العلاجية المشفرة 4، 5. واحد يعني إمكانية للتعويض عن الاختلاط تنبيغ وتعزيز الاستهداف هو إدخال ناقلات الجينات في الموقع المطلوب في شكل يحول دون نشرها مجانا عبر الدم واللمف. عادة، وتعتمد هذه الجهود على أنظمة تسليم عن طريق الحقن إما محليا تتألف من ناقلات فيروسية أو غير الفيروسية ممزوجة مع الليفين، والكولاجين أو حمض الهيالورونيك هيدروجيل المصفوفات 6-10 القادرة على الحفاظ عابر ناقلات الجينات في موقع الحقن بواسطة entrapping جسديا عشرم في شبكة البوليمرية.

آخر نموذج المقبولة عموما للعلاج بالجينات محلية يستخدم تجميد ناقلات الجينات على سطح الأجهزة التعويضية مزروع 11،12. وتستخدم يزرع الطبية الدائمة (اللف، الشعب الهوائية، الدعامات المسالك البولية والجهاز الهضمي، وأجهزة ضبط نبضات القلب والمفاصل الاصطناعية، تنسجم الجراحية وأمراض النساء، الخ.) سنويا في عشرات الملايين من المرضى 13. في حين فعالة بشكل عام، وهذه الأجهزة عرضة للمضاعفات التي تسيطر عليها كافية الممارسات الطبية الحالية 14-17. زرع الأجهزة التعويضية فرصة فريدة لتكون بمثابة وكيل لمنصات العلاج الموضعي العلاج الجيني. من وجهة نظر الدوائية، اشتقاق سطح يزرع الطبية بجرعات منخفضة نسبيا من إدخال النتائج ناقلات الجينات في تحقيق كل من تركيزات عالية من المحلية ناقلات الجينات على الزرع / واجهة الأنسجة وتباطؤ حركية رغبتهمالقضاء ص من هذا الموقع. نتيجة لإقامة مطولة وتعزيز امتصاص من قبل السكان الخلية المستهدفة، ناقلات تجميد يقلل من انتشار ناقلات الجينات. وبالتالي يتم تقليل التلقيح غير مقصود من الأنسجة غير المستهدفة.

وقد تم تنفيذ الربط سطح ناقلات الجينات على المواد الحيوية القابلة للزرع (وهو ما يسمى أيضا باسم بوساطة الركيزة توصيل الجينات أو المرحلة الصلبة توصيل الجينات) في خلية ثقافة والحيوانية التجارب باستخدام كل محددة (ضد مستضد 18-20، 21،22، أفيدين البيوتين) و23-26 (تهمة، فان دير فال) التفاعلات غير محددة. المرفق التساهمية من ناقلات على سطح الجهاز مزروع وقد اعتبرت سابقا غير وظيفية منذ روابط قوية بشكل مفرط مع السطح تحول دون استيعاب ناقلات بواسطة الخلايا المستهدفة. مؤخرا وقد تبين أن هذا القيد يمكن التغلب عليها من خلال استخدام المتحللة بشكل عفوي عبر رابط تستخدم تيتراتبها بين السطح المعدني معدلة من الدعامات والبروتينات قفيصة من ناقلات الفيروسة الغدانية 27،28. وعلاوة على ذلك، فإن معدل إطلاق النواقل ودوام التعبير التحوير في المختبر وفي الجسم الحي يمكن التضمين مع استخدام المتحللة linkers عبر اظهار حركية مختلفة من التحلل 28.

وتقدم هذه الورقة بروتوكول مفصلة للمرفق التساهمية عكسها من ناقلات الفيروسة الغدانية لتنشيط سطح معدني ويدخل في الإعداد التجريبية مفيدة لدراسة الأحداث التي تلت ذلك التنبيغ في المختبر في العضلات الملساء والخلايا البطانية مثقف والحية في نموذج الفئران من السباتي الدعامات قسطرة .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد و Cy3 المسمى اتش للتجارب الإصدار

  1. تعليق 2 × 10 12 جزيئات الإعلان الفارغ (حوالي 2 × 10 11 وحدة المعدية) في 650 ميكرولتر من كربونات / بيكربونات عازلة (مصرف البحرين المركزي، ودرجة الحموضة 9.3).
  2. حل محتويات القارورة 1 (0.2 ملغ) من رد الفعل، أمين صبغة الفلورسنت (و Cy3 (NHS) 2) في 1 مل مصرف البحرين المركزي لتركيز النهائي من 0.2 ملغ / مل.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من محلول الصبغة لتعليق الفيروس، دوامة لمدة 5 ثانية واحتضان لمدة 1 ساعة عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز (100-200 دورة في الدقيقة).
  4. تتوازن 20 مل سيفاروز 6B العمود مع برنامج تلفزيوني. إضافة 750 ميكرولتر من تعليق و Cy3 المسمى الإعلان قطرة من الحكمة إلى وسط السرير هلام.
  5. بعد تعليق الفيروسي يتخلل الراتنج، وإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني. تجاهل شطافة.
  6. إضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني وجمع شطافة في وعاء زجاجي المسمى. كرر هذه الخطوة جمع ما مجموعه عشرة 0.5 مل الكسور 10X.
  7. عشر الفحصه جمع الكسور بواسطة القياس الطيفي (260 و 280 نانومتر) لمحتوى الحمض النووي الفيروسي.
  8. تجميع الكسور التي تحتوي على أكثر من 10٪ من مجموع (مجموع F1 خلال F10) الكثافة الضوئية (OD) في 260 نانومتر. ملاحظة: عادة الكسور F3، F4، F5، F6 ويتم تجميع ومختلطة.
  9. إعادة فحص الكسور المجمعة مختلطة بواسطة القياس الطيفي (260 و 280 نانومتر) وفحص بواسطة التألق (550 EX / 570 م نانومتر) لمحتوى الحمض النووي الفيروسي وو Cy3 المسمى البروتين قفيصة، على التوالي. ملاحظة: منحنى المعايرة و Cy3 (NHS) 2 تغطي مستعدة مجموعة 10 -9 -10 -13 مول / لتر ويعاير fluorimetrically على نفس لوحة والكسور المجمعة.
  10. حساب العائد الفيروس المسمى وكثافة العلامات. نفترض أن جسيمات 1.19 × 10 12 فيروس / مل يتوافق مع 1 OD حدة ل1 سم طول المسار 29. استخدام الصيغة: العائد = [(OD 260nm /1.19)*10 12 * مبلغ V / الإدخال الإعلان] * 100، حيث، 260nm OD هو دي البصريnsity من صياغة المجمعة في 260 نانومتر و V هو حجم صياغة المجمعة (مل) لحساب العائد الانتعاش اعلان (٪). استخدام الصيغة: وصفها الكثافة = C * 6.02 * 10 23 / ​​(OD 260nm /1.19)*10 12، حيث C هو تركيز و Cy3 من صياغة المجمعة (الشامات / مل) و260nm OD هو الكثافة البصرية للصياغة في المجمعة 260 نانومتر لحساب متوسط ​​الكثافة و Cy3 العلامات. ملاحظة: انتعاش نموذجية من الفيروس المسمى هو> 70٪ من الجرعة الإدخال. كثافة العلامات هي 600-800 جزيئات fluorophore في جسيمات الفيروس واحد.
  11. قسامة و Cy3 المسمى الإعلان فارغة إلى أجزاء أصغر (عادة 5 × 10 11 الجسيمات) مناسبة لإطلاق التجارب الفردية. يحدد البروتوكول الحالي استخدام الإعلان و Cy3 المسمى فقط في التجربة الاصدار: ملاحظة. تتم جميع الدراسات التنبيغ خارجا مع نواقل غير المسمى.

2. تفعيل عينات المعادن

  1. غسل ث المقاوم للصدأالى teel شبكة الأقراص أو الدعامات الفولاذ المقاوم للصدأ على التوالي في الأيزوبروبانول (5 دقائق × 2) وكلوروفورم (5 دقائق × 2) في 55 درجة مئوية مع اهتزاز (100 دورة في الدقيقة). إزالة المذيب.
  2. تسخين العينات لمدة 30 دقيقة على حرارة 200 درجة مئوية.
  3. حل polyallylamine البايفوسفونيت مع تثبيت مجموعات ثيول الكامنة (PABT 27،28،30) في الماء (1-2٪ ث / ت) في 72 درجة مئوية مع اهتزاز (100 دورة في الدقيقة). ضبط درجة الحموضة إلى 4.5-5 مع KHCO 3.
  4. احتضان عينات معدنية في حل PABT لمدة 2-4 ساعة عند 72 درجة مئوية مع اهتزاز (100-200 دورة في الدقيقة). ملاحظة: قد يكون توقف الإجراء في هذه المرحلة. العينات مستقرة لمدة 3 أيام في 4 درجات مئوية.
  5. شطف العينات ثلاث مرات بالماء المقطر المزدوج (DDW).
  6. كشف عينات لتريس (2 carboxyethyl) الفوسفين (TCEP، 15 ملغ / مل في 0.1 م العازلة الخليك) لمدة 15 دقيقة عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز (100-200 دورة في الدقيقة).
  7. شطف 5X نزع الغاز في أحواض دبي الجافة العالمية.
  8. كشف العينات إلى 2٪ polyethyleneimine مع مجموعات pyridyldithio تثبيت (PEI PDT 27،28،30) في نزع الغاز أحواض دبي الجافة العالمية في جو الأرجون لمدة 2 ساعة عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز (100-200 دورة في الدقيقة). ملاحظة: قد يكون توقف الإجراء في هذه المرحلة. العينات مستقرة لمدة 2 أسابيع في 4 درجات مئوية.
  9. شطف العينات ثلاث مرات مع أحواض دبي الجافة العالمية.
  10. كشف العينات إلى 10 ملغ / مل dithiothreitol / أحواض دبي الجافة العالمية لتحويل مجموعات pyridyldithio إلى التجولات.
  11. شطف 5X نزع الغاز مرة أخرى في أحواض دبي الجافة العالمية.

3. اتش التنشيط والمعادن الشلل السطحية

  1. تعليق 5 × 10 11 الجسيمات إما الإعلان EGFP أو الإعلان لوك (حوالي 5 × 10 10 وحدات المعدية) في 487،5-495 ميكرولتر من كربونات / بيكربونات عازلة (مصرف البحرين المركزي، ودرجة الحموضة 9.3). ملاحظة: للحصول على الدراسات الإفراج عنهم، استخدام 5 × 10 11 من الإعلان و Cy3 المسمى جزيئات فارغة (ضبط مستوى الصوت إلى 487،5 حتي 495 ميكرولتر مع مصرف البحرين المركزي).
  2. حل HC مع اختلاف معدلات التحلل 28 [(بسرعة (ر 1/2 = 5 د)، انتقالية تربط بين (ر 1 /2 = 12 د) وببطء (ر 1/2 = 50 د) HC، أي RHC، IHC أو SHC. الشكل 1] أو غير المتحللة عبر رابط (NHC)، سلفو-LC-SPDP في مصرف البحرين المركزي في 20 ملي.
  3. على الفور إضافة 5-12.5 ميكرولتر من الحل عبر رابط إلى تعليق فيروس لإجمالي حجم 500 ميكرولتر (200-500 ميكرومتر تركيز النهائي من عبر رابط)، دوامة واحتضان لمدة 1 ساعة عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز (100- 200 دورة في الدقيقة).
  4. تتوازن 20 مل سيفاروز 6B العمود مع نزع الغاز 5 ملي EDTA / PBS (EPBS). إضافة قطرة قطرة 500 ميكرولتر من تعديل عبر رابط، تعليق الإعلان إلى وسط السرير الراتنج.
  5. إضافة 5 مل من نزع الغاز EPBS. تجاهل شطافة.
  6. إضافة 0.5 مل من نزع الغاز EPBS وجمع شطافة في وعاء زجاجي المسمى. كرر هذه الخطوة 10 مرات جمع ما مجموعه عشرة كسور 0.5 مل.
  7. تحديد OD من الكسور جمعها باستخدام القياس الطيفي في 260 و 280 نانومتر، وتحويل OD إلى التتر فيروس (1.19 × 10 12 / مل corresponds إلى 1 OD) 29.
  8. تجميع الكسور التي تحتوي على> 10٪ من الفيروس مزال (ملاحظة: عادة، والكسور F3-F6). تكرار عيار الفحص الطيفي لتعليق المجمعة.
  9. نقل تعليق الفيروسي إلى القارورة مع عينات معدنية تنشيط (وفقا لل2.11). احتضان في جو الأرجون لمدة 1 ساعة عند 28 درجة مئوية مع اهتزاز (100-200 دورة في الدقيقة). ملاحظة: يتم استخدام مزيد من عينات المعادن المربوطة الإعلان، والتي تم الحصول عليها في هذه الخطوة في الافراج التنبيغ والتجارب اللاحقة الموصوفة في أقسام بروتوكول 5-7.

4. الكمي للالمرتبط السطحية المتجهات الإعلان بواسطة PCR

  1. إعداد صيغ تنسجم مع يجمد سطح الإعلان EGFP المربوطة عبر NHC، حالات العسر الشديد، وIHC RHC (ن = 3 لكل نوع) كما هو موضح في الفقرتين 2 و 3.
  2. استخدام عدة QIAamp DNA مايكرو لعزل الحمض النووي الفيروسي. وضع تنسجم بشكل فردي في أنابيب بلاستيكية 1.5 مل تحتوي على 200 ميكرولتر من خليط مكون من 180 ميكرولتر من ATL بuffer و 20 ميكرولتر من بروتين K (وكلاهما من عدة). إضافة كمية معروفة من الجزيئات الإعلان EGFP (كمعايير لمنحنى المعايرة) في أنابيب منفصلة تحتوي على نفس الخليط. احتضان عند 56 درجة مئوية خلال الليل دون أن تهتز.
  3. إضافة 200 ميكرولتر من العازلة AL (من المجموعة)، ومزيج من قبل vortexing، إضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  4. نقل خليط من كل أنبوب على عمود فردي MinElite (من مجموعة) وتدور في 8،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. شطف الأنابيب التي تحتوي على شبكة مع 180 ميكرولتر من العازلة ALT الطازجة، إضافة إلى الأعمدة منها وتدور في 8،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. تجاهل eluates.
  5. إضافة 500 ميكرولتر من AW1 عازلة (من مجموعة) في الأعمدة وتدور بسرعة 8000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. تجاهل eluates.
  6. إضافة 500 ميكرولتر من AW2 عازلة (من مجموعة) في الأعمدة وتدور بسرعة 8000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
  7. تجاهل eluates.
  8. تدور في 14،000 دورة في الدقيقة لمدة 3 دقائق إضافية أونتيل الأعمدة جافة تماما. تجاهل eluates.
  9. إضافة 50 ميكرولتر من المياه MilliQ الصف في الأعمدة. تدور في 14،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. جمع 50 ميكرولتر من شطافة من كل عمود في أنبوب جمع الأفراد (من المجموعة).
  10. يعد حل PCR ميكس ماجستير من خلال الجمع بين يتكاثر مما يلي (12.5 ميكرولتر من الطاقة الخضراء PCR SYBR ميكس ماجستير، 0.63 ميكرولتر من 10 ميكرومتر EGFP الشعور التمهيدي [5'- ACG TAA ACG دول مجلس التعاون الخليجي ACA AGT TC -3 ']، 0.63 ميكرولتر من 10 ميكرومتر EGFP مكافحة الشعور التمهيدي [5'- AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3 ']، 6.3 ميكرولتر من المياه MilliQ الصف). مضاعفة هذه الكميات من قبل عدد من ردود الفعل المخطط بما في ذلك الضوابط "لا DNA".
  11. تحميل 5 ميكرولتر من الإعلان EGFP DNA (من الخطوة 4.8) و 20 ميكرولتر من PCR ميكس ماجستير في الآبار ثلاث نسخ من MicroAmp البصرية لوحة رد فعل 96-جيدا. ختم لوحة مع MicroAmp بصري لاصق السينمائي. تدور لوحة عند 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء.
  12. وضع لوحة في وعاء من محرك 7500 PCR في الوقت الحقيقي. في القائمة الرئيسية لل7500 نظام SDS البرمجيات (V1.4 أو أعلى) حدد "إنشاء تجربة جديدة". انقر على "التالي". في "معالج تجربة جديدة" شاشة اختيار SYBR الأخضر من القائمة التمرير إلى أسفل وانقر على زر "إضافة". انقر على "التالي" للحصول على تخطيط لوحة. تسليط الضوء على جميع الآبار لتحليلها، تحديد SYBR الأخضر. تسليط الضوء على التوالي لم آبار المراقبة الحمض النووي، DNA معايير الإعلان EGFP والمجهولة، ووضع علامة عليها باستخدام التسميات منها من القائمة التمرير إلى أسفل.
  13. التبديل إلى علامة التبويب الصك. حدد "إضافة مرحلة التفكك"، تغيير حجم جيد من الافتراضي إلى 50 ميكرولتر 25 ميكرولتر. انقر فوق ابدأ.
  14. تحليل النتائج باستخدام PCR بعد التحقق من ملخص لQC القيم المتطرفة وغيرها من المخالفات.

5. الإصدار حركية المتحللة الصليب المربوطة-رابط المتجهات الجسيمات من نموذج للصدأ شبكة

  1. غسل العينات شبكة derivatized مع الإعلان و Cy3 المسمى عبر RHC، IHC، SHC وNHC (كما في 3.9) في 1٪ BSA / PBS (1 ساعة × 3) مع اهتزاز (100-200 دورة في الدقيقة).
  2. باستخدام ملقط غرامة معقمة، ضع تنسجم في الآبار الفردية لوحة 96 جيدا مملوءة مسبقا مع 200 ميكرولتر من شطف العازلة (0.1٪ BSA / 0.1٪ توين 20 / PBS).
  3. التقاط صور من الفلورسنت جزءا أساسيا من كل شبكة. تسجيل إعدادات المجهر وكاميرا CCD المستخدمة للحصول على الصورة.
  4. مقايسة لوحة fluorimetrically (550 EX / 570 م) في وضع المسح الضوئي بشكل جيد مع الحد الأقصى. استخدام الآبار تنسجم مع غير derivatized كعنصر تحكم الخلفية.
  5. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (50 دورة في الدقيقة).
  6. في أوقات محددة سلفا (1-30 أيام المدى) نضح شطف العازلة دون إزعاج تنسجم وإضافة 200 ميكرولتر من العازلة شطف الطازجة. كرر الخطوات من 4،3-4،5 بعد استبدال المخزن المؤقت.

6. تنبيغ من مثقف سلليرة سورية من قبل شبكة يجمد-المتجهات الإعلان

  1. غسل EGFP الإعلان - أو -derivatized الإعلان لوك تنسجم ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني العقيمة لمدة 5 دقائق مع اهتزاز (100 دورة في الدقيقة).
  2. باستخدام ملقط معقم غرامة إزالة الأقراص شبكة واحدة تلو الأخرى وبشكل فردي وضعها في الآبار من 96 لوحة جيدا مع نوع من الخلايا في المصالح في المرحلة سجل النمو.
  3. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، في 5٪ CO 2.
  4. استخدام فحص منها غير محطة نقطة النهاية (المجهر الفلورسنت، لقياس التألق EGFP أو التصوير تلألؤ بيولوجي لوسيفيراز) لتحديد مدى والتوزيع المكاني للتعبير الجينات في الآبار.
  5. اختياريا، متوسطة البديل لبرنامج تلفزيوني لزيادة حساسية مقايسة التألق (485/535 نانومتر) إذا كان من المتوقع انخفاض التعبير EGFP. ملاحظة: إذا تم تجهيز مقياس التألق مع القدرة على المسح الضوئي بشكل جيد، وقراءة لوحة في وضع المسح الضوئي بشكل جيد لتقييم التوزيع المكاني للخلايا في الآبار، معربا عن EGFP. الصرف PBS لمتوسطة بعد الانتهاء من التألق.
  6. صورة الخلايا transduced في الآبار تنسجم مع الإعلان EGFP -eluting (سواء الكامنة والبعيدة للشبكة) باستخدام مجموعة فلتر FITC. التقاط صور تمثيلية في 40-200X التكبير. تسجيل الضبط الدقيق للمجهر الفلورسنت وكاميرا CCD المستخدمة لاقتناء الصور.
  7. إضافة 5 ميكرولتر من الأسهم وسيفيرين في برنامج تلفزيوني (10 ملغ / مل) مباشرة إلى الآبار مع الإعلان لوك -eluting تنسجم إلى تركيز النهائي من 500 ميكروغرام / مل واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 10 دقيقة قبل التصوير تلألؤ بيولوجي . نضح وسائل الإعلام واستبدالها مع خالية من وسيفيرين سائل الاعلام بعد التصوير.
  8. المقايسات نقطة النهاية كرر في أوقات محددة سلفا (تصل إلى 2 أسابيع) لدراسة حركية مراسل التعبير الجيني التالية بوساطة الركيزة نقل الجينات.

7. التحقق من القدرة تنبيغ المحفوظة في النقاط تأخر الوقت

  1. إعداد الإعلان EGFP ديتنسجم rivatized باستخدام RHC، IHC، SHC وNHC لناقلات الربط (كما في 2،1-2،11 و3،1-3،9) ووضع على حدة تنسجم في الآبار من 96 لوحة جيدا مع 60-80٪ الخلايا البطانية الأورطي الأبقار متكدسة (BAEC ).
  2. تحليل تنبيغ مثقف BAEC مع شبكة يجمد الإعلان EGFP في 1 و 2 أيام بعد وضع شبكة باستخدام المجهر مضان والتألق (حسب 6،4-6،5).
  3. 48 ساعة بعد بدء التنبيغ غسل الآبار التي تحتوي على شبكة مع برنامج تلفزيوني مرتين.
  4. إضافة 200 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين / EDTA إلى كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز (100 دورة في الدقيقة). غسل 3X مع برنامج تلفزيوني.
  5. استخدام المجهر الفلورسنت والتألق للتأكد من إزالة كاملة لجميع خلايا EGFP الايجابية المرتبطة تنسجم.
  6. passaged البذور الطازجة BAEC في الآبار تنسجم مع صدر جزئيا في 60-80٪ كثافة البذر الأولية (2-2،7 × 10 4 خلايا / جيد).
  7. احتضان لوحة في CO 37 درجة مئوية و 5٪ 2 لفترات محددة من الوقت (1-10 أيام) قبل تقييم الأحداث التنبيغ "الجديدة" بواسطة المجهر الفلورسنت والتألق.

8. الدعامة نشر السباتي في نموذج فأر من الدعامات القسطرة يبلغ حجمه الإعلان

  1. جميع الإجراءات الحيوان الموصوفة في هذا البروتوكول مطابقة للوائح الاتحادية على استخدام الحيوانات المختبرية وتمت الموافقة من قبل IACUC من مستشفى الاطفال في فيلادلفيا. التمسك الظروف جراحية معقمة يتم تعقيم الأوتوكلاف جميع الصكوك. لضمان العقم المستمر يعمل على تعقيم حبة بين استخدام الصكوك في ما يصل إلى خمسة حيوانات متتالية.
  2. إعداد الإعلان لوك -eluting الدعامات وفقا ل2،1-2،11 و3،1-3،9. تخزين الدعامات derivatized الفيروس في برنامج تلفزيوني العقيمة عند 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 24 ساعة قبل استخدامها.
  3. تخدير الذكور سبراغ داولي الفئران (400-450 ز) مع حقن IP من الكيتامين (100 ملغ / كلغ)، وزيلازين (5 ملغ / كلغ). ديتيرمينى عمق التخدير بواسطة مخلب استجابة قرصة وتوترية العضلات. تطبيق مرهم للعين الطبيب البيطري لمنع جفاف القرنية والصلبة. ملاحظة: استنشاق التخدير مع 4٪ و 2٪ الأيزوفلورين (1 لتر / دقيقة) لإحداث والمحافظة على التخدير، على التوالي، من الممكن ولكن يعوق حرية الوصول إلى منطقة الرقبة من الحيوان وبالتالي لا ينصح للمستخدم عديم الخبرة.
  4. إعادة تقييم عمق التخدير عن طريق قرصة أخمص قدميه. ويحلق جو معقم و مطهر الإعدادية الرقبة ومنطقة الصدر العلوية. إدارة المضادات الحيوية (سيفازولين و 20 مغ / كغ، IM)، مسكن (ميلوكسيكام؛ 0.5 مغ / كغ، SC) والمالحة (10 مل / كغ، SC). يقثطر الوريد الذيل مع G قسطرة 24 وإدارة الهيبارين (200 وحدة دولية / كغ، IV). ملاحظة: جرعة من 10 ملغ / كغ (IM) انروفلوكساسين (Baytril) يمكن استخدامها بدلا من سيفازولين. تجنب استخدام المضادات الحيوية التي تفتقر إلى النشاط الكبير ضد البكتيريا إيجابية الجرام. يمكن استخدام 10-15 مغ / كغ كاربروفين (Rimadyl) بدلا من ميلوكسيكام بمثابة مسكن وقائية. المسكنات المخدرة (ه.G. والمورفين والبوبرينورفين) ينبغي تجنبها بسبب خصائص الاكتئاب التنفس الخاصة بهم.
  5. إجراء شق خط الوسط من خلال الجلد والرقبة رباط. استخدام تقنيات تشريح حادة لعزل الأيسر الشريان السباتي الخارجي. التعادل قبالة الشريان السباتي الخارجي في موقع ودود الأكثر القاصي. تطبيق ربطة مؤقت الانزلاق إلى أصل الشريان السباتي الداخلي.
  6. جعل 2 ملم شق في بضع الشريان الأيسر الشريان السباتي الخارجي.
  7. ادخال القسطرة فوغارتي 2 الفرنسية في الشريان السباتي المشترك من خلال شق في الشريان السباتي الخارجي. تضخيم غيض من القسطرة بمحلول ملحي وتمرير 3X من قوس الأبهر إلى التشعب السباتي من أجل تعرية البطانة.
  8. حرك قطعة من الأنبوب (1.04 ملم OD، 0.99 ملم ID) عبر القسطرة فوغارتي وإلى الشريان السباتي المشترك. سحب القسطرة فوغارتي.
  9. جبل وتجعيد ولوك الإعلان -derivatized الدعامة فوق البالون ل1.5مم قسطرة القسطرة. إدراج الدعامات من خلال أنابيب تفلون وتقدم عليه في منتصف مقطع من الشريان السباتي المشترك. تجنب فرك الدعامة ضد سفينة أو أنبوب الجدار.
  10. نشر في الدعامة 12 أجهزة الصراف الآلي لمدة 30 ثانية وسحب القسطرة قسطرة.
  11. التعادل قبالة الشريان السباتي الخارجي الأقرب إلى الموقع بضع الشريان والافراج عن ربطة مؤقت على الشريان السباتي الداخلي.
  12. إصلاح الجرح المنطوق في طبقات مع تشغيل 4.0 Vicryl خياطة والتيلة الجلد.
  13. استرداد الحيوان على وسادة الاحترار حتى الإسعافية والعودة إلى قفصه معزولة. في حين لا علامات الألم أو عدم الراحة وعادة ما عرضت من قبل الحيوانات اللاحقة للعمليات الجراحية وراء 12 ساعة الأولى بعد العملية، والنظر في تمديد العلاج ميلوكسيكام (0.5 ملغم / كغم، SC يوميا) لمدة 72 ساعة.

9. ضوء بارد من التصوير الشرياني التعبير الجيني

  1. في نقطة زمنية محددة سلفا (1 يوم - 3أسابيع المدى) بعد نشر الازاله stent الجينات في الشريان السباتي المشترك، تخدير الفئران باستخدام تخدير استنشاق الأيزوفلورين (2-4٪ الأيزوفلورين في الأكسجين).
  2. إزالة الدبابيس الجراحية، جو معقم و مطهر إعداد الموقع وإعادة فتح الجرح المنطوق. باستخدام حادة الوصول تشريح، وإعادة كسب لالشريان السباتي المشترك اليسار وفصلها عن العصب المبهم والأنسجة الضامة المجاورة.
  3. إعداد خليط من 50 ملغ / مل وسيفيرين في برنامج تلفزيوني و 25٪ بلورونيك F-127 في برنامج تلفزيوني (1: 4 ت / ت) وتخزينها على الجليد. ملاحظة: تقدم هذه الصيغة كحل لزج عند 4 درجة مئوية، وعلى الفور تتحول إلى هلام على اتصال مع الأنسجة عند 37 درجة مئوية.
  4. تطبيق 200 ميكرولتر من المبرد وسيفيرين / خليط بلورونيك مباشرة إلى الجزء الظاهر من الشريان السباتي المشترك وتحقق هلام صلابة.
  5. وضع الحيوان في موقف ضعيف في غرفة التصوير لجهاز IVIS الطيف والحفاظ على التخدير الأيزوفلورين مع قناع الوجه.
  6. في acquisitiالسيطرة على نافذة لوحة (الحياة صورة، الإصدار 4.2 أو أعلى) اختيار موقف "B" (6.6 سم الكاميرا الاعتراض بعد) وbinning عامل "المتوسطة" من القوائم المنسدلة بعنوان "مجال الرؤية" و "binning"، على التوالي. اكتب في "2.5 سم" في مربع الارتفاع الموضوع. اختيار "دقيقة" كوحدة من الوقت في مربع "زمن التعرض"، واختيار قيمة عددية "2".
  7. ثلاث دقائق بعد تطبيق وسيفيرين / هلام بلورونيك، بدء الحصول على الصور من خلال النقر على الزر "الحصول" على الشاشة. ملاحظة: صورة اكتساب الوقت يمكن أن تختلف 1-6 دقيقة اعتمادا على قوة الإشارة المتوقعة.
  8. بعد الحصول على الصورة، وغسل هلام قبالة مع المياه المالحة وربت الفضاء المحيط بالشرايين مع معقمة الشاش والقطن تطبيقها.
  9. إغلاق الجرح مع Vicryl خياطة وغذائيا رئيسيا الجلد.
  10. استرداد الحيوانية والعودة إلى قفصه. تكرار التصوير في وقت لاحق رنقاط IME لدراسة دوام التعبير الشرايين الناجمة عن ناقلات الإعلان، وثبتوا الدعامات.
  11. بدلا من ذلك، نفذ التصوير بعد إدارة النظامية من وسيفيرين. تخدير الحيوان والإعدادية وفقا 9،1-9،2. يقثطر الوريد الذيل مع G القسطرة والقسطرة 24 آمنة مع الشريط الجراحية.
  12. يعد حل من وسيفيرين في برنامج تلفزيوني (50 ملغ / مل) وحقن 1 مل من محلول عن طريق القسطرة على مدى فترة 10 ثانية. واحدة دقيقة بعد حقن بدء الحصول على الصور كما في 9،7-9،8. ملاحظة: معدل الحقن أسرع (<10 ثانية) يمكن أن يثير النشاط الحجز وتوقف التنفس. يجب أن يتم التخلص من الحيوان لو المضبوطات أو توقف التنفس تحدث أثناء التصوير.
  13. اتبع الخطوة 9.10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تجارب ناقلات الإصدار

الربط ناقلات الفيروسة الغدانية على سطح يزرع، بما في ذلك أجهزة التدخلية مثل الدعامات اللف، الذي يقارب متجه إلى موقع المرض، وتفادي جزئيا عدم وجود الاستهداف الجسدي النواقل. ومع ذلك، لتكون قادرة على تحقيق الآثار العلاجية عبر تنبيغ الأنسجة المستهدفة، ويجب أن يتم الافراج عن ناقلات من السطح (الشكل 2). وقد افترض استخدام المتحللة linkers عبر السماح 1) المرفق الفعال لل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يصف بروتوكول المعروضة طريقة التشغيلي للالركيزة بوساطة توصيل الجينات التي تحققت من خلال مرفق عكسها من ناقلات الفيروسة الغدانية إلى coatless أسطح الفولاذ المقاوم للصدأ. بينما وضعت لغرض معين من العلاج الجيني القائم على دعامات من عودة التضيق الوعائي، هذه التقنية لها تطبيقات أوسع في مجالات الحيوية، ويزرع الطبية الحيوية والعلاج الجيني.

على الرغم من أن الدراسات المقدمة واستخدمت فقط الفولاذ المقاوم للصدأ باعتبارها ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

تم دعم تطوير البروتوكول والدراسات المقدمة في هذه الورقة جزئيا من خلال منح تطوير علماء جمعية القلب الأمريكية (I.F. 0735110N و MC 10SDG4020003) ، ومنحة المعهد الوطني الأمريكي للقلب والرئة والدم HL 72108 (RAJL) ، والمعهد الوطني الأمريكي للقلب والرئة والدم T32 007915 (SPF). تم التبرع بقسطرة رأب الأوعية الدموية من قبل NuMED (هوبكينتون ، نيويورك). ويود أصحاب البلاغ أن يشكروا المساعدة التي قدمتها السيدة سوزان كيرنز في مجال السكرتارية.

شكر وتقدير

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة للإفصاح عنها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
316 أقراص شبكية من الفولاذ المقاومElecton Microscopy SciencesE200-SS
Generic 304-grade دعامات من الفولاذ المقاومللصدأ Laserageطلب
AdeGFP< / sub>جامعة بنسلفانيا ناقلات كورAD-5-PV0504
AdLuc< / sub>جامعة بنسلفانيا ناقلات كورAD-5-PV1028
AdEMPTY< / sub> جامعةبنسلفانيا ناقلات كورA858
Cy3 (NHS) 2< / sub>GE HealthcarePA23000
Sepharose 6BSigma-Aldrich6B100-500ML
الأشعة فوق البنفسجية 96 بئر لوحاتCostar3635
الفلورومتري 96 بئرCostar3915
ثقافة الخلايا 96 لوحة بئر فالكون353072
تريس (2-كربوكسي إيثيل) فوسفين هيدروكلوريد (TCEP) بيرسثيرمو ساینتيك20490
ديثيوثريتول (DTT) بيرسثيرمو ساینتفيك20290
sulfo-LC-SPDPبيرس ثيرمو ساینتفيك21650
أجهزة الطيف الضوئي الجزيئية  SpectraMax 190
أجهزة الطيف الفلوريالجزيئيةSpectraMax Gemini EM
حاضنة شاكر مداريVWR1575R
فرن تدفق الهواء الأفقيShel Lab1350 FM
Centra-CL2 أجهزة الطرد المركزي شركة المعدات الدولية426
خلاط دوامة رقميةفيشر ثيرمو ساينتيك02-215-370
Eclipse TE300 مجهر مضاننيكون & nbsp ؛كاميرا TE300
DC 500 CCDLeicaDC-500
7500 نظام PCR في الوقت الحقيقيالأنظمة الحيوية التطبيقيةغير متوفرة
محطة التلألؤ البيولوجي IVIS SpectrumPerkins-Elmerغير متوفرة
ملح ثنائي البوتاسيوم EDTASigma-AldrichED2P
الألبومين البقري الكسر V (BSA)فيشر ثيرمو ساينتيك.BP1600-100
Tween-20Sigma-AldrichP1379
ملقط Dumontأدوات العلوم الدقيقة11255-20
A10 خط الخلية ATCCCRL-1476
الخلايا البطانية الأبهرية البقريةLonzaBW-6002
Luciferin ، ملح البوتاسيومالتكنولوجيا الحيوية الذهبيةLUCK-1Ge
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيومGibco14190-136
مصل الأبقار الجنينيGemini Bio-Products100-106
محلول البنسلين / الستربتومايسينجيبكو11540-122
DMEM ، ارتفاع نسبة الجلوكوزCorning cellgro10-013-CV
0.25٪ Trypsin / EDTAGibco25200-056
QIAamp DNA micro kitQiagen56304
Power Sybr Green PCR Master MixAppliedBiosystems 4367659
MicroAmp البصرية 96 بئر لوحة التفاعلالتطبيقية الأنظمة الحيويةN8010560
MicroAmp فيلم لاصق بصريتطبيق Biosystems4360954
Cephazolin & nbsp ؛Apotexغير متوفر
Loxicom (Meloxicam)Norbrookغير متوفر
Heparin الصوديومAPP المستحضرات الصيدلانيةغير متوفرة
Ketavet (الكيتامين)VEDCOغير متوفر
Anased (Xylazine)  Lloidغير متوفر
Forane (Isoflurane)   ؛باكسترغير متوفر
ملقط قزحية موريا المنحنيأدوات العلومالدقيقة 11370-31
ملقط منحني فائق الدقةأدوات العلوم11152-10
دومون # 5 ملقطأدوات العلوم الدقيقة11252-20
مقص زنبركي فاناسأدوات العلوم الدقيقة15018-10
مقص ناعم - ToughCutأدوات العلوم الدقيقة14058-09
مقص جراحيأدوات العلوم الدقيقة14101-14
خياطة فيكريل (5-0)خياطة EthiconJ385
(4/0 حرير)  أدوات العلوم الدقيقة18020-40
مشابك خياطة ميشيلأدوات العلوم الدقيقة12040-02
موسع الجرح (منظار عين لانكستر)KLS Martin34-149-07
معقم الخرز الساخنأدوات العلومالدقيقة 18000-45
قضيب مشبك خياطة ميشيلأدوات العلوم الدقيقة112028-12
Insyte Autoguard 24 G IV قسطرةبيكتون ديكنسون381412
2F قسطرة فوغارتيإدواردز علوم الحياة120602F
أنابيب تفلونVention041100BST
قسطرة PTAطلب
وسادات شاشكيندال للرعاية الصحية9024
قضيبات القطنتصنيع WOD1003
سالينباكستر281321
حقنة 10 مل (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309604
1 مل حقنة (Luer-Lok)Beckton-Dickinson309628
Clippers مع شفرة # 40Oster   ؛78005-314
الشريط الجراحي Transpore3MMM 15271
مرهم Puralube البيطريPharmadermغير متوفر
للصدأ مخصص مصل الدقيقة خيط مخصص

المراجع

  1. Boeckle, S., Wagner, E. Optimizing targeted gene delivery: chemical modification of viral vectors and synthesis of artificial virus vector systems. AAPS J. 8, E731-E742 (2006).
  2. Waehler, R., Russell, S. J., Curiel, D. T. Engineering targeted viral vectors for gene therapy. Nat Rev Genet. 8, 573-587 (2007).
  3. Campos, S. K., Barry, M. A. Current advances and future challenges in Adenoviral vector biology and targeting. Curr Gene Ther. 7, 189-204 (2007).
  4. Bangari, D. S., Mittal, S. K. Current strategies and future directions for eluding adenoviral vector immunity. Curr Gene Ther. 6, 215-226 (2006).
  5. Barry, M. A., et al. Systemic delivery of therapeutic viruses. Curr Opin Mol Ther. 11, 411-420 (2009).
  6. De Laporte, L., Shea, L. D. Matrices and scaffolds for DNA delivery in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 59, 292-307 (2007).
  7. Gustafson, J. A., Price, R. A., Greish, K., Cappello, J., Ghandehari, H. Silk-elastin-like hydrogel improves the safety of adenovirus-mediated gene-directed enzyme-prodrug therapy. Mol Pharm. 7, 1050-1056 (2010).
  8. Kidd, M. E., Shin, S., Shea, L. D. Fibrin hydrogels for lentiviral gene delivery in vitro and in vivo. J Control Release. 157, 80-85 (2012).
  9. Lei, Y., et al. Incorporation of active DNA/cationic polymer polyplexes into hydrogel scaffolds. Biomaterials. 31, 9106-9116 (2010).
  10. Lei, Y., Rahim, M., Ng, Q., Segura, T. Hyaluronic acid and fibrin hydrogels with concentrated DNA/PEI polyplexes for local gene delivery. J Control Release. 153, 255-261 (2011).
  11. Jang, J. H., Schaffer, D. V., Shea, L. D. Engineering biomaterial systems to enhance viral vector gene delivery. Mol Ther. 19, 1407-1415 (2011).
  12. Salvay, D. M., Zelivyanskaya, M., Shea, L. D. Gene delivery by surface immobilization of plasmid to tissue-engineering scaffolds. Gene Ther. 17, 1134-1141 (2010).
  13. Moss, A. J., Hamburger, S., Moore, R. M., Jeng, L. L., Vol Howie, L. J. Advance Data. 191, National Center for Health Statistics Vital and Health Statistics. (1991).
  14. Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface). Med Prog Technol. 14, 205-224 (1988).
  15. Santerre, J. P., Woodhouse, K., Laroche, G., Labow, R. S. Understanding the biodegradation of polyurethanes: from classical implants to tissue engineering materials. Biomaterials. 26, 7457-7470 (2005).
  16. Tang, L., Eaton, J. W. Inflammatory responses to biomaterials. Am J Clin Pathol. 103, 466-471 (1995).
  17. Zimmerli, W., Sendi, P. Pathogenesis of implant-associated infection: the role of the host. Semin Immunopathol. 33, 295-306 (2011).
  18. Fishbein, I., et al. Bisphosphonate-mediated gene vector delivery from the metal surfaces of stents. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 159-164 (2006).
  19. Levy, R. J., et al. Localized adenovirus gene delivery using antiviral IgG complexation. Gene Ther. 8, 659-667 (2001).
  20. Ma, G., et al. Anchoring of self-assembled plasmid DNA/anti-DNA antibody/cationic lipid micelles on bisphosphonate-modified stent for cardiovascular gene delivery. Int J Nanomedicine. 8, 1029-1035 (2013).
  21. Hu, W. W., Lang, M. W., Krebsbach, P. H. Development of adenovirus immobilization strategies for in situ gene therapy. J Gene Med. 10, 1102-1112 (2008).
  22. Jang, J. H., et al. Surface immobilization of hexa-histidine-tagged adeno-associated viral vectors for localized gene delivery. Gene Ther. 17, 1384-1389 (2010).
  23. Bengali, Z., Shea, L. D. Gene Delivery by Immobilization to Cell-Adhesive Substrates. MRS Bull. 30, 659-662 (2005).
  24. Holmes, C. A., Tabrizian, M. Substrate-mediated gene delivery from glycol-chitosan/hyaluronic acid polyelectrolyte multilayer films. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 524-531 (2013).
  25. Pannier, A. K., Wieland, J. A., Shea, L. D. Surface polyethylene glycol enhances substrate-mediated gene delivery by nonspecifically immobilized complexes. Acta Biomater. 4, 26-39 (2008).
  26. Wang, C. H., Pun, S. H. Substrate-mediated nucleic acid delivery from self-assembled monolayers. Trends Biotechnol. 29, 119-126 (2011).
  27. Fishbein, I., et al. Local delivery of gene vectors from bare-metal stents by use of a biodegradable synthetic complex inhibits in-stent restenosis in rat carotid arteries. Circulation. 117, 2096-2103 (2008).
  28. Fishbein, I., et al. Adenoviral vector tethering to metal surfaces via hydrolyzable cross-linkers for the modulation of vector release and transduction. Biomaterials. 34, 6938-6948 (2013).
  29. Mittereder, N., March, K. L., Trapnell, B. C. Evaluation of the concentration and bioactivity of adenovirus vectors for gene therapy. J. Virol. 70, 7498-7509 (1996).
  30. Forbes, S. P., et al. Modulation of NO and ROS production by AdiNOS transduced vascular cells through supplementation with L-Arg and BH4: Implications for gene therapy of restenosis. Atherosclerosis. 230, 23-32 (2013).
  31. Niinomi, M., Nakai, M., Hieda, J. Development of new metallic alloys for biomedical applications. Acta Biomater. 8, 3888-3903 (2012).
  32. Brito, L. A., Chandrasekhar, S., Little, S. R., Amiji, M. M. Non-viral eNOS gene delivery and transfection with stents for the treatment of restenosis. Biomed Eng Online. 9, 56(2010).
  33. Egashira, K., et al. Local delivery of anti-monocyte chemoattractant protein-1 by gene-eluting stents attenuates in-stent stenosis in rabbits and monkeys. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, 2563-2568 (2007).
  34. Ohtani, K., et al. Stent-based local delivery of nuclear factor-kappaB decoy attenuates in-stent restenosis in hypercholesterolemic rabbits. Circulation. 114, 2773-2779 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Sprague Dawley
الأوعية الدموية نقل الجينات من الدعامات المعدنية السطوح عن طريق ناقلات الفيروسة الغدانية مربوط من خلال المتحللة عبر linkers
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.