مقالة منهجية

فحوصات البيوكيميائية لتحليل أنشطة ATP التي تعتمد على لونين إعادة عرض الانزيمات

DOI:

10.3791/51721

⸱

أكتوبر 25, 2014

 ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry & Molecular Biology, Kansas University Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = 'jove_content'> هنا نصف المقايسات الكيميائية الحيوية التي يمكن استخدامها لتوصيف إنزيمات إعادة تشكيل الكروماتين المعتمدة على ATP لقدراتها على 1) تحفيز انزلاق النيوكليوسوم المعتمد على ATP ، 2) الانخراط مع ركائز النيوكليوسوم ، و 3) تحلل ATP بطريقة تعتمد على النيوكليوسوم أو الحمض النووي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
غالبا ما يعمل أعضاء عائلة SNF2 من ATPases

كمكونات لمجمعات إعادة تشكيل الكروماتين متعددة الوحدات الفرعية التي تنظم ديناميكيات النيوكليوسوم وإمكانية الوصول إلى الحمض النووي عن طريق تحفيز إعادة تشكيل النيوكليوسوم المعتمد على ATP. يتطلب تشريح الكيمياء الحيوية لمساهمات الوحدات الفرعية الفردية لهذه المجمعات في تفاعل إعادة تشكيل الكروماتين المعتمد على ATP متعدد الخطوات استخدام فحوصات تراقب إنتاج منتجات التفاعل وتقيس تكوين وسيطات التفاعل. يصف بروتوكول JOVE هذا المقايسات التي تسمح للمرء بقياس الأنشطة الكيميائية الحيوية لمجمعات إعادة تشكيل الكروماتين أو المجمعات الفرعية التي تحتوي على مجموعات مختلفة من الوحدات الفرعية. يتم قياس إعادة تشكيل الكروماتين باستخدام مقايسة انزلاقية للنيوكليوسوم المعتمدة على ATP ، والتي تراقب حركة النيوكليوسوم على جزيء الحمض النووي باستخدام طريقة قائمة على مقايسة تحول الحركة الكهربية (EMSA). يتم قياس نشاط ربط النيوكليوسوم من خلال مراقبة تكوين إعادة تشكيل أحادي النوكليوسومات المرتبطة بالمركب باستخدام طريقة مماثلة قائمة على EMSA ، ويتم فحص نشاط ATPase المعتمد على الحمض النووي أو النيوكليوسوم باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) لقياس معدل تحويل ATP إلى ADP والفوسفات في وجود إما الحمض النووي أو النيوكليوسومات. باستخدام هذه المقايسات ، يمكن للمرء فحص وظائف الوحدات الفرعية لمجمع إعادة تشكيل الكروماتين من خلال مقارنة أنشطة المجمع الكامل بتلك التي تفتقر إلى وحدة فرعية واحدة أو أكثر. يتم استخدام مجمع إعادة تشكيل الكروماتين INO80 البشري كمثال. ومع ذلك ، يمكن تكييف الطرق الموضحة هنا مع دراسة مجمعات إعادة تشكيل الكروماتين الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتشمل المجمعات SNF2 الكروماتين الأسرة على إعادة عرض مثل SNF2 المركزية أتباز فرعية 1،2. ATPases بعض الوظائف مثل SNF2 كإنزيمات فرعية واحدة، في حين يعمل آخرون مثل الوحيدات الحفاز من أكبر المجمعات متعددة فرعية. توضيح الآليات الجزيئية التي فيها كل من مفارز الكروماتين تساهم المجمعات إعادة عرض لأنشطتها يتطلب القدرة على أداء فحوصات البيوكيميائية التي تشريح عملية التجديد.

إعادة عرض النيوكليوسومات ATP التي تعتمد من قبل مجمع INO80 البشري وغيرها من لونين إعادة عرض الانزيمات يمكن تصوره على أنه عملية متعددة الخطوات التي تبدأ مع ملزمة للانزيم إعادة عرض لnucleosomes، تليها تفعيل DNA- و / أو النيوكليوسومات التي تعتمد أتباز، إزفاء للانزيم إعادة عرض على الحمض النووي nucleosomal، وإعادة تموضع في نهاية المطاف nucleosomes 1،2. فهم التفاصيل الجزيئية لعملية إعادة عرض الكروماتين ص تعتمد على ATPequires تشريح للتفاعل إعادة عرض في خطواتها الفردية وتعريف بمساهمات مفارز الفردية للمجمع لونين إعادة عرض لكل خطوة من خطوات التفاعل. مثل هذه التحليلات تتطلب القدرة على تحليل إعادة النيوكليوسومات وغيرها من الأنشطة باستخدام ركائز الجزيئية المحددة في المختبر.

في البروتوكول إن الرب السابق، وصفنا الإجراءات المستخدمة لتوليد INO80 المجمعات إعادة عرض الكروماتين وsubcomplexes مع مكونات فرعية محددة 3. هنا، نقدم ثلاثة فحوصات البيوكيميائية التي تمكن التحليل الكمي للالنيوكليوسومات ملزمة، DNA- والنيوكليوسومات تنشيط أتباز، وأنشطة إعادة النيوكليوسومات المرتبطة بهذه المجمعات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ATP-تعتمد النيوكليوسومات إعادة عرض فحوصات

لقياس ATP-تعتمد الأنشطة النيوكليوسومات إعادة عرض، immunopurified INO80 أو يتم تحضين subcomplexes INO80 مع ATP والركيزة mononucleosomal، الذي يحتوي على جسيم نووي واحد المتمركزة على واحدة من نهاية جزء DNA-BP 216، وصفت P-32. ثم يتعرضون المنتجات رد فعل الكهربائي في المواد الهلامية بولي أكريلاميد الأصلية.

  1. لتوليد ف المسمى "601" جزء DNA 32، تضخيم من pGEM-3Z-601 4 جزء DNA 216 BP تحتوي على 601 تسلسل المواقع النيوكليوسومات-وضع نهاية، وذلك باستخدام [أليغنوكليوتيد 5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG و5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG و إلى الأمام وعكس الاشعال.
    1. انشاء 100 ميكرولتر PCR رد فعل كما هو موضح في الجدول 1.
    2. إجراء تفاعلات PCR في cycler الحرارية باستخدام البرنامج التالي: 1 دقيقة في 96 درجة مئوية، واتباعها!د بنسبة 45 ثانية في 94 درجة مئوية، و 30 ثانية في 57 ° C، 60 ثانية عند 72 درجة مئوية لمدة 30 دورات. تنتهي مع 7 دقائق عند 72 درجة مئوية.
    3. بعد الانتهاء من رد فعل PCR، وإزالة النيوكليوتيدات الفردية عن طريق تمرير المنتجات رد فعل مرتين من خلال الأعمدة تدور nuclease خالية.
    4. تشغيل 5 ميكرولتر من المنتج PCR المنقى في 1.2٪ هلام الاغاروز للتأكد من أن رد فعل PCR إنشاء المطلوب ~ 216 DNA بي بي شظية.
    5. تمييع 5 ميكرولتر من المنتج PCR المنقى 20 أضعاف، وقياس تركيز الحمض النووي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية. ومتوسط ​​العائد هو ~ 40 نانوغرام / ميكرولتر.
    6. قياس النشاط الإشعاعي من 1 ميكرولتر من المنتج PCR المنقى في عداد التلألؤ. تقدير كفاءة التوسيم عن طريق حساب الكلفة لكل ألف / نانوغرام. ومن المتوقع أن تسفر ~ 15،000 نسخة في الدقيقة / 601 نانوغرام من الحمض النووي جزء رد فعل التوسيم الناجح.
  2. نقل nucleosomes خلية هيلا على 601 المسمى DNA باستخدام طريقة التخفيف المتسلسل 5.
    1. مزيج من 2 بمول32 601 شظية مع الحمض النووي المسمى P 6 ميكروغرام من nucleosomes هيلا (المعد كما هو موضح 5) في 50 ميكرولتر من العازلة التي تحتوي على 1.0 M كلوريد الصوديوم، و 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1 ملم EDTA، 0.1 ملي PMSF، و1 ملم DTT واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    2. بالتتابع تمييع الخليط إلى 0.8 M، M 0.6، و 0.4 M كلوريد الصوديوم عن طريق التخفيف مع 12.5 ميكرولتر، ميكرولتر 20.8، و 41.6 ميكرولتر، على التوالي، من 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (8.0 درجة الحموضة)، 1 ملم EDTA، 0.1 ملي PMSF، و 1 ملم DTT، مع الحضانة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية بعد كل تخفيف.
    3. وعلاوة على ذلك تمييع الخليط إلى 0.2 M ثم إلى 0.1 M كلوريد الصوديوم عن طريق إضافة 125 ميكرولتر ثم 250 ميكرولتر من نفس العازلة التي تحتوي على 0.1٪ Nonidet P-40، 20٪ الجلسرين، و 200 ميكروغرام / مل BSA، مع الحضانة 30 دقيقة في 30 ° C بين الأخيرين التخفيفات. تخزين الركيزة mononucleosome في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
  3. أداء النيوكليوسومات انزلاق ردود الفعل ATP-تعتمد في الحجم الإجمالي من 10 ميكرولتر. الجرميةوترد المكونات ction في الجدول 2. منذ تركيز كلوريد الصوديوم الأمثل لINO80 النشاط النيوكليوسومات إعادة عرض هو ~ 50 مم كلوريد الصوديوم (نتائج غير منشورة)، وضبط التركيز الكلي من كلوريد الصوديوم في كل رد فعل ل50 ملم، مع الأخذ في الاعتبار كمية كلوريد الصوديوم الواردة في استعدادات nucleosomes والانزيم.
    1. قبل البدء في إعداد المقايسات، ويلقي المواد الهلامية بولي أكريلاميد الأم (18 × 16 سم). لإعداد جيل واحد يحتوي على 5٪ الأكريلاميد (الأكريلاميد: bisacrylamide 37.5: 1)، TBE 0.5X (45 ملي تريس بورات، 1 ملم EDTA)، 0.01٪ بيرسلفات الأمونيوم (APS)، و 0.001٪ N، N، N'، N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)، خلط المكونات المدرجة في الجدول 3. السماح لهلام تتبلمر لا يقل عن 2 ساعة على RT.
    2. وفي الوقت نفسه، لكل رد فعل يتعين القيام بها، والجمع في قبل المبردة صلكنزد أنبوب microcentrifuge 1.5 مل ~ 20 نانومتر INO80 أو INO80 subcomplex (المعد كما هو موضح 3) مع كمية من العازلة EB100 ( الجدول 4) كافية لإعطاء حجم 4.75 ميكرولتر. على الفور إعادة تجميد أي المتبقية الكسور التي تحتوي على INO80 في الثلج الجاف المجفف أو النيتروجين السائل.
    3. انشاء كوكتيل رئيسية مع بقية المكونات، وزيادة بعامل 'X' (حيث X = العدد الكلي للتفاعلات +3). يتم سرد كمية كل عنصر اللازمة لواحد رد فعل 10 ميكرولتر في الجدول 5. يجب تحجيمها وصفة تصل وفقا لعدد من التفاعلات التي يتعين القيام بها. مزيج جيد من خلال الاستفادة من أنبوب أو عن طريق pipetting صعودا وهبوطا مع Pipetman وتدور الأنبوب لبضع ثوان في microcentrifuge الفوق.
    4. الاستغناء 5.25 ميكرولتر من الكوكتيل رئيسية لكل من أنابيب رد فعل بإعدادها في الخطوة 1.3.2. مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا. بدء التفاعلات عن طريق نقل أنابيب رد الفعل إلى 30 ° C الحرارة أو كتلة ماء الحمام واحتضان لمدة 2 ساعة.
    5. وفي الوقت نفسه، وإعداد "إزالة مزيج" كوكتيل تحتوي على الحمض النووي منافسوnucleosomes، التحجيم من قبل عامل X (X = العدد الكلي للتفاعلات + 4). يتم سرد كمية كل عنصر اللازمة لإعداد 1.5 ميكرولتر إزالة مزيج لفعل واحد في الجدول 6؛ يجب تحجيمها وصفة يصل اعتمادا على عدد من المقايسات التي يتعين القيام بها.
    6. إنهاء ردود الفعل بإضافة 1.5 ميكرولتر من مزيج إزالة. تخلط جيدا، وتدور إلى أسفل، واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى.
    7. وفي الوقت نفسه، قبل تشغيل هلام بولي أكريلاميد الأصلي في وحدة الكهربائي العمودي في 100 فولت لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وذلك باستخدام 0.5X TBE كما يعمل عازلة مع شريط مغناطيسي داخل مجلس النواب للحفاظ على دوران مستمر عازلة.
    8. لتحميل عينة، إضافة 2.5 ميكرولتر من صبغ تحميل تحتوي على TBE 3X، و 30٪ الجلسرين، 0.25٪ برموفينول الأزرق، و 0.25٪ الزيلين Cyanol FF. تخلط جيدا، وتدور لفترة وجيزة العينات، وتحميلها على هلام باستخدام نصائح تحميل.
    9. تشغيل هلام في 200 V ل 4.5 ساعة في 4 درجات مئوية مع دوران العازلة.
    10. للكشف عن إشارة، ونقل هلام إلى كومة من ورقتين من ورق الترشيح. التفاف ورقة الترشيح مع هلام على رأس باستخدام التفاف البلاستيك الشفاف، ثم تعريضها إلى شاشة تخزين الفوسفور في 4 درجة مئوية لمدة الوقت المطلوب.
    11. مسح الشاشة مع نظام الماسح الضوئي التصوير النظير وتحليل البيانات باستخدام البرمجيات المناسبة.

2. Mononucleosome ملزم فحوصات

لفحص تقارب ملزم من مجمع INO80 نظرا لmononucleosomes، إجراء التحول الكهربي التنقل الفحص (EMSA) باستخدام الركيزة mononucleosomal إنشاؤها في الخطوة 1.2.

  1. إعداد رد فعل يمزج لفحوصات ملزمة كما هو موضح لفحوصات إعادة النيوكليوسومات لكن حذفت ATP وإزالة مزيج من التفاعلات؛ احتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. إضافة 2.5 ميكرولتر من صبغ لتحميل كل خليط التفاعل، وتنطبق على هلام بولي أكريلاميد الأصلية التي تحتوي على مادة الأكريلاميد 3.5٪ (الأكريلاميد: مكرر 37.5: 1)، 1٪ الجلسرين، TBE 0.5X، 0.01٪ APS، و 0.001٪ TEMED.
  3. باستخدام 0.5X TBE كما يعمل العازلة، تشغيل هلام في 200 V 2.5 ساعة في 4 درجات مئوية مع دوران العازلة وفضح إلى شاشة تخزين الفوسفور.

3. DNA- والنيوكليوسومات التي تعتمد على فحوصات أتباز

إجراء فحوصات أتباز في مخاليط رد فعل 5 ميكرولتر تحتوي على 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 60 مم كلوريد الصوديوم، 6.6 ملم MgCl 2، 0.8 ملي EDTA، 0.015٪ Nonidet P-40، 2.5٪ الجلسرين، 0.1 ملغ / مل BSA، 1 ملي DTT، 0.1 ملي PMSF، 2 مم ATP، 2 μCi من [α- 32 P] ATP (3،000 تسى / ملمول). لكل مجمع INO80 أو كمية مجمع INO80 أن يعاير إقامة ثلاثة ردود فعل موازية، واحدة تحتوي على عازلة EB100 لقياس DNA- أو جسيم نووي مستقل أتباز، واحدة تحتوي على الحمض النووي بلازميد دائرية مغلقة (5،000 نقطة أساس، ~ 30 نانومتر) لقياس DNA- أتباز المعالين، واحدة تحتوي على هيلا oligonucleosomes (~ 185 نانومتر) لقياس النيوكليوسومات التي تعتمد أتباز. إعداد كافة ردود الفعل على الجليد.

  • لكل رد فعل، والجمع بين 10-50 نانومتر من INO80 أو INO80 subcomplexes immunopurified مع مبلغ EB100 عازلة كافية لإعطاء حجم 2.2 ميكرولتر في مرحلة ما قبل المبردة مشحم 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. على الفور إعادة تجميد أي الكسور التي تحتوي على INO80 في الثلج الجاف المجفف أو النيتروجين السائل.
  • انشاء كوكتيل الرئيسي. يتم سرد كمية كل عنصر اللازمة لفعل واحد في الجدول 7. توسيع نطاق صفة من خلال زيادة بمعامل 3 (X + 2) +1، حيث X = عدد الاستعدادات INO80 أن يعاير.
  • لإعداد تحتوي العازلة "المولوتوف الفرعية" فقط، DNA، أو nucleosomes، الاستغناء 2.5 (X + 2) ميكرولتر من الكوكتيل الماجستير في ثلاثة أنابيب منفصلة. إضافة 0.3 (X + 2) ميكرولتر من EB100 إما مغلقة DNA البلازميد دائري (1.5 ميكروغرام / ميكرولتر)، أو هيلا oligonucleosomes (1.5 ميكروغرام / ميكرولتر) وتخلط جيدا.
  • الاستغناء 2.8 ميكرولتر من الكوكتيل الفرعي المناسب للأنابيب رد فعل تحتوي على الانزيم الذي أنشئ في الحادي وEP 3.1. ماصة بلطف صعودا وهبوطا إلى المزيج؛ تجنب إدخال فقاعات.
  • لبدء التفاعلات، نقل أنابيب رد الفعل إلى 30 ° C كتلة الحرارة.
  • بعد 5، 15، 30، و 60 دقيقة من الحضانة، بقعة 0.5 ميكرولتر من كل خليط التفاعل اللوني في الصعود إلى طبقة السليلوز polyethyleneimine رقيقة (TLC) لوحة (20 × 10 سم) في خط مستقيم 1.5 سم على الأقل من الحافة السفلى . العودة فورا أنابيب رد فعل على 30 ° C الحرارة كتلة يمكن أن تؤخذ نقاط زمنية متعددة لذلك من أنبوب واحد. بعد اكتشاف، تجف لوحات TLC باستخدام مجفف ضربة.
  • نقل لوحات TLC إلى غرفة زجاجية تحتوي على ما يكفي 0.375 فوسفات البوتاسيوم M (3.5 درجة الحموضة) للسماح لل0.5 سم السفلى من لوحة TLC إلى أن يغطس في الحل.
  • تغطية الغرفة، ووضع حتى أمام الطور السائل تصل إلى الجزء العلوي من لوحات TLC. الفورية الجافة لوحات بدقة باستخدام مجفف ضربة.
  • فضح لوحات TLC المجففة إلى شاشة الفوسفور التخزين في RT.مسح الشاشة مع نظام الماسح الضوئي التصوير النظائر وتحديد مقدار المشعة الركيزة ATP والمنتجات ADP.
  • لحساب كمية ATP تحلل، مضاعفة ATP تحلل٪ من كمية ATP موجودة في بدء خليط التفاعل باستخدام الصيغة التالية: بمول تحلل ATP = 10 ATP بمول في بدء رد فعل خ [ADP / (ATP + ADP)]

    • الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    وتشير الأرقام نتائج ممثلة من فحوصات البيوكيميائية المستخدمة لتوصيف الأنشطة INO80، بما في ذلك النيوكليوسومات انزلاق (الشكل 1) وملزمة (الشكل 2) المقايسات وDNA- أو المقايسات أتباز تعتمد على النيوكليوسومات (الشكل 3).

    التجربة هو مبين في الشكل 1 يقارن قدرة المجمعات INO80 سليمة تنقيتها من خلال FLAG-Ies2 أو FLAG-INO80E وINO80 subcomplexes تنقيتها من خلال...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    لضمان إعادة النيوكليوسومات والأنشطة أتباز نلاحظ في المقايسات تعتمد على النشاط التحفيزي المجمعات INO80، وليس على إعادة تلويث و / أو الأنزيمات أتباز، فإننا النيوكليوسومات الفحص بشكل روتيني ويعيد النشاط أتباز من الإصدارات نشطة حفاز المجمعات INO80، طهروا في بالتوازي مع النوع البري INO80 باستخدام نفس الإجراء. عنصر تحكم رد الفعل السلبي تفتقر ATP ينبغي أيضا أن يؤديها عندما يعاير النشاط إعادة النيوكليوسومات لاختبار وجود تلوث ATP و / أو أنشطة إعادة ATP-المستقلة، والتي يمكن أن تعقد تفسير ال...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

    شكر وتقدير

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    العمل في مختبر المؤلفين مدعوم بمنحة من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (GM41628) وبمنحة لمعهد ستورز للبحوث الطبية من صندوق هيلين نيلسون للأبحاث الطبية في مؤسسة مجتمع مدينة كانساس الكبرى.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    كوكتيل مثبط البروتيازSigmaP8340
    10x تفاعل PCR عازلة   ؛روش للعلوم التطبيقية 11435094001
    روش تاك DNA Polymeraseروش للعلوم التطبيقية 11435094001
    NucAway Nuclease-free Spin Columns AmbionCat. # AM10070
    ATP فائق النقاء USB / Affymetrix77241 25 UM
    زلاليم مصل البقر  سيجماA9418 
    40٪ أكريلاميد / مكرر 37.5: 1Amresco0254-500ML
    للحيوانات المنوية من سمك السلمون Sonicated   ؛GE Healthcare27-4565-01
    10٪ بيرسلفات الأمونيوم (APS)Thermo Scientific17874
    benzonase  نوفاجينكات. رقم 70664
    dCTP ، [&alpha ؛ -32< / sup>P] - 6,000 Ci / mmolPerkinElmerBLU013Z250UC
    PCR الحرارية cycler PTC 200MJ ResearchPTC 200
    وحدة الرحلان الكهربائي العمودي HoeferSE600X-15-1.5
    مشحمة 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة   ؛كوستار3207
    شاشة تخزين الفوسفور الديناميكا الجزيئية63-0034-79
    ورق ترشيح 3 ممWhatman 28458-005VWR
    Typhoon PhosphorImager برنامج GE Healthcare8600
    ImageQuantألواح زجاجية GE Healthcarever2003.02
    TLC ، PEI-Cellulose FMillipore5725-7
    Immobilon-FL Transfer Membrane 7 × 8.4MilliporeIPFL07810
    مقياس مسح للأغراض العامة مع نافذة طرفية أو فطيرة مسبار GM (Geiger-Mueller)BiodexModel 14C
    DNA

    المراجع

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Clapier, C. R., Cairns, B. R. The biology of chromatin remodeling complexes. Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).
    2. Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
    3. Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes. , (2013).
    4. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).
    5. Owen-Hughes, T., et al. Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes. Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).
    6. Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor. Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).
    7. Jin, J., et al. A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex. Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).
    8. Chen, L., et al. Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling. Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).
    9. Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF. Cell. 97 (7), 833-842 (1999).
    10. Polach, K. J., Widom, J. Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics. Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).
    11. Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol. 22 (20), 7147-7157 (2002).
    12. Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site. Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).
    13. Gottschalk, A. J., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (33), 13770-13774 (2009).
    14. Clapier, C. R., Cairns, B. R. Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes. Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).
    15. Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry. 33 (27), 8262-8271 (1994).
    16. Luk, E., et al. Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome. Cell. 143 (5), 725-736 (2010).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    ATPase INO80

    مقالات ذات صلة