يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

العزلة وإثراء الإنسان الدهنية المشتقة من خلايا انسجة لتعزيز تكون العظم

11.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52181

⸱

يناير 12, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Department of Surgery, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Stanford University School of Medicine, 2Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يمكن تعريف عدم تجانس النسخ داخل الخلايا اللحمية البشرية المشتقة من الدهون على مستوى الخلية المفردة باستخدام علامات سطح الخلية والجينات العظمية. نصف بروتوكولا يستخدم قياس التدفق الخلوي لعزل مجموعات الخلايا الفرعية ذات الإمكانات العظمية المتزايدة ، والتي يمكن استخدامها لتعزيز إعادة بناء الهيكل العظمي القحفي الوجهي.

الملخص

تعتبر >jove_content<الخلايا اللحمية الوسيطة المشتقة من نخاع العظام (BM-MSCs) المعيار الذهبي لتطبيقات هندسة الأنسجة القائمة على الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، يمكن أن ترتبط العملية التي يجب حصادها من خلالها بأمراض كبيرة في موقع المانحين. في المقابل ، تكون الخلايا اللحمية المشتقة من الدهون (ASCs) أكثر وفرة ويسهل حصادها ، مما يجعلها بديلا جذابا ل BM-MSCs. مثل BM-MSCs ، يمكن أن تتمايز ASCs إلى خلايا سلالة عظمية ويمكن استخدامها في تطبيقات هندسة الأنسجة ، مثل البذر على السقالات لاستخدامها في عيوب الهيكل العظمي القحفية الوجهية. يتم الحصول على ASCs من الجزء الوعائي اللحمي (SVF) للأنسجة الدهنية المهضومة ، وهو مزيج غير متجانس من الخلايا العصفية العصفية ، والخلايا البطانية الوعائية والجدارية ، وخلايا العضلات الملساء ، والخلايا المحيطة ، والخلايا الليفية ، والخلايا المنتشرة. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن ملف تعريف علامة السطح ل ASCs مشابه لملف BM-MSCs. على الرغم من العديد من التقارير المنشورة التي تنشئ علامات للنمط الظاهري ل ASC ، لا يزال هناك نقص في الإجماع حول الملامح التي تحدد الخلايا العظمية في هذه المجموعة غير المتجانسة. يصف هذا البروتوكول كيفية عزل واستخدام مجموعة سكانية فرعية من ASCs ذات القدرة العظمية المحسنة لإصلاح عيوب الجلسنة ذات الحجم الحرج.

المقدمة

الطبيعة غير المتجانسة لمجموعات الخلايا الجذعية لم تفهم تماما بعد ولا تزال تشكل عائقا رئيسيا أمام تطوير التطبيقات العلاجية الفعالة سريريا القائمة على الخلايا الجذعية. تتمثل إحدى الطرق الأكثر شيوعا لتوصيف مجموعة غير متجانسة من الخلايا الجذعية في استخدام طريقة فرز الخلايا ، مثل فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) ، لفصل الخلايا بناء على ملفات تعريف تعبير العلامات السطحية. عندما تصبح طرق الفرز أكثر تعقيدا ، يصبح من الممكن تحديد مجموعات سكانية فرعية وظيفية أكثر تميزا للخلايا. أصبحت التقنيات القائمة على الموائع الدقيقة تستخدم بشكل متكرر في تحليل التعبير الجيني على مستوى الخلية الواحدة. يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي متعدد الإرسال (qPCR) داخل شريحة الموائع الدقيقة بتحليل نسخ خلية واحدة عالي الدقة وفعال وموثوق. 1-5

في دراسة سابقة باستخدام التنميط النسخي أحادي الخلية ل 48 جينا ، لوحظ عدم تجانس نسخي كبير بين ASCs. 6 ومع ذلك ، أظهر توزيع الجينات MSX2 و BMP-5 و BMP-7 و ALP و OCN و RUNX2 ارتباطا قويا بمجموعة من الخلايا التي تمتلك ملامح نسخ عالية العظم. لعزل الخلايا وفقا لملف تعريف التعبير الجيني العظمي هذا ، تم ربط أنماط التعبير عن المستضد السطحي بأنماط النسخ وتم اكتشاف التعبير عن علامة السطح للإنجلولين (CD105) لاحقا ليرتبط ارتباطا وثيقا بإمكانات التمايز العظمي المحسنة ل ASCs. بغض النظر عن تعبير CD105 ، فإن التعبير عن المستقبل السطحي Thy-1 (CD90) ، وهو بروتين غشائي مرتبط بالجليكوزيل فوسفاتيديلينوزيتول الذي أظهر سابقا من قبل Chen et al. ليكون مرتبطا بالخلايا العظمية ، كان مرتبطا أيضا بالتعبير الجيني العظمي. 6،7 توفر هذه النتائج الفرصة لعزل مجموعات سكانية فرعية بشكل مستقبلي داخل مجموعة أكبر غير متجانسة من ASCs مع زيادة القدرة العظمية لتطبيقات هندسة أنسجة العظام القائمة على الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تم الحصول على جميع عينات المرضى للموافقة المسبقة عن، وتم استعراض البروتوكولات التجريبية والمعتمدة من قبل جامعة ستانفورد مجلس المراجعة المؤسسية (بروتوكول # 2188 و # 9999).

1. عزل خلية والثقافة:

  1. الحصول على الأنسجة الدهنية تحت الجلد الإنسان من المرضى من النساء الأصحاء تمر lipoaspiration الاختيارية من البطن، الجناح، و / أو منطقة الفخذ تحت تخدير موضعي / عام. تأكد من أن مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) الموافقة قد تم الحصول عليها عن بروتوكول لعزل ASCS من الأنسجة البشرية، واتباع احتياطات السلامة المؤسسية بينما كان يعمل مع مثل هذه المواد.
  2. للحصول على صندوق التبرعات الخاص من الأنسجة الدهنية lipoaspirated، وغسل لأول مرة lipoaspirate ثلاث مرات مع أحجام متساوية من 1X العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). نضح بعناية وتجاهل الطبقة المائية أسفل.
  3. إعداد العازلة كولاجيناز الهضم: 0.075٪ النوع الأول كولاجيناز في لهانكمحلول ملحي متوازن (HBSS). إعداد عازلة FACS: 2٪ FBS، 1٪ P188 و 1٪ القلم بكتيريا في برنامج تلفزيوني. تصفية كل من حلول باستخدام المتاحة تجاريا 0.22 ميكرون حجم المسام تدفق سريع مرشح polyethersulfone.
  4. لهضم الأنسجة الدهنية غسلها، إضافة حجم مساو من كولاجيناز عازلة الهضم ووضع سفينة الهضم بشكل آمن في حمام مائي تهتز لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية (حوالي 180 يهز / دقيقة).
    ملاحظة: فمن الأفضل لاستخدام أكبر حجم الوعاء الهضم مما هو مطلوب، وهذا يسمح للهضم القصوى خلال الهز (أي 250 مل من العازلة كولاجيناز الهضم، 250 مل من الأنسجة الدهنية غسلها في قارورة معقمة 1L).
  5. تحييد النشاط الأنزيمي بإضافة حجم مساو من العازلة FACS والسماح للجلوس على RT لمدة 5 دقائق. وبعد ذلك، الطرد المركزي في 233 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  6. نضح بعناية وتجاهل طاف، مع الحرص على عدم تعكير صفو عالية الكثافة SVF بيليه.
  7. resuspend الكرية في 5-10 مل من RT الأحمرخلية تحلل العازلة، استنادا إلى حجم بيليه. ترك حل للجلوس على RT لمدة 5 دقائق والطرد المركزي في 233 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
  8. نضح طاف و resuspend بيليه بإضافة 5-10 مل من وسائط النمو التقليدي، استنادا إلى حجم بيليه (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة [DMEM] / 10٪ FBS / 1٪ البنسلين الستربتومايسين حل [القلم بكتيريا]).
  9. تعليق تصفية من خلال 100 ميكرون خلية النايلون مصفاة لإزالة الحطام الخلوي.
  10. الطرد المركزي في 233 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف دون الإخلال بيليه.
  11. resuspend الكرية في 5-10 مل من وسائط النمو التقليدي، استنادا إلى حجم بيليه.
  12. ضع 2 × 10 6 خلايا في طبق ثقافة 15 سم القياسية وإقامة الثقافات الأولية O / N عند 37 درجة مئوية / 21٪ O 2، 5٪ CO 2. الحفاظ على المستويات دون متموجة لمنع التمايز عفوية في 37 ° C / 21٪ O 2، 5٪ CO 2 في وسائل الاعلام النمو.
    كثافة خلية في كامل ملاحظة:متموجة 15 سم لوحة ما يقرب من 4-6 × 10 6 خلايا.

2. تلطيخ

  1. ASCS الثقافة في متوسطة النمو التقليدي عند 37 درجة مئوية / 21٪ O 2، 5٪ CO 2، لمدة 36 ساعة قبل تلطيخ / الفرز.
  2. ASCS رفع من لوحات ثقافة استخدام Accutase (وفقا للبروتوكول الشركة المصنعة).
  3. غسل خلايا مرة واحدة مع FACS العازلة (PBS مع 2٪ FBS و 1٪ القلم بكتيريا).
  4. الطرد المركزي في 233 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  5. تجاهل طاف دون الإخلال بيليه. resuspend الخلايا في 0.5-1 مل من العازلة FACS (اعتمادا على عدد الخلايا وكمية من الأجسام المضادة المطلوبة).
    ملاحظة: حجم التعليق الخلية، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة الأجسام المضادة FACS، ويحدد تركيز الأجسام المضادة. ومع ذلك، المعايرة تركيز الأجسام المضادة، وذلك باستخدام تركيز الانطلاق من 1: 100، وينصح عادة إذا كان هذا هو المرة الأولى لاستخدام الأجسام المضادة.
  6. عد العدد الإجمالي للالخلايا باستخدام عدادة الكريات.
  7. الاحتياطي 100 UL مأخوذة في 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي التي تستخدم في عينة غير ملوثين والضوابط أحادية اللون (وفقا لعدد من الأجسام المضادة الفلورسنت المستخدمة).
  8. إضافة الاجسام المضادة المناسبة fluorescently المسمى (بتركيزات محددة سلفا، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة)، واحتضان لمدة 20-30 دقيقة على الجليد، محمية من الضوء.
    1. لتسمية حيوانية عظمي المنشأ: تمييع مكافحة CD90 (APC CD90 مكافحة الإنسان (Thy1)) أو مكافحة CD105 (FITC مكافحة الإنسان CD105 (endoglin)) في المخزن FACS إلى تركيز 01:50.
    2. لتسمية السكان الخلية الأخرى (على سبيل المثال، المكونة للدم والخلايا البطانية): تمييع مكافحة CD45 (مكافحة CD45 الإنسان والمحيط الهادئ الأزرق)، ومكافحة CD34 (مكافحة الإنسان CD34 APC)، و / أو مكافحة CD31 (مكافحة CD31 الإنسان PE ) في FACS العازلة إلى تركيز 01:50.
    3. إذا لم تكن تستخدم الأجسام المضادة مترافق مباشرة، واستخدام الأجسام المضادة الأولية المعقدة البيروكسيديز مع-streptavidin مترافق الثاني المناسبةالأجسام المضادة آرى، مثل Streptavidin PE-Cy7، في التخفيف من 1: 100.
  9. بعد مرور فترة الحضانة، وغسل الخلايا مرتين: ملء الأنابيب مع FACS العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 233 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وطاف الشفط.
  10. resuspend الخلايا في 400-500 ميكرولتر FACS العازلة ومرشح عينات من خلال 70 ميكرون خلية النايلون مصفاة لإزالة كتل الخلية.
  11. نقل الخلايا المسمى في أنابيب FACS مع كبار تصفية والاحتفاظ بعينات على الجليد لمدة التحليل.

3. تنشيط الإسفار الفرز خلية

ملاحظة: الخطوات التالية ولاية معرفة سابقة في الخلية مضان تنشيط الفرز (FACS) أو مساعدة من أحد الفنيين المهرة.

  1. باستخدام برنامج FACS المناسبة والمؤامرات تحليل تصميم لدراسة مبعثر إلى الأمام (FSC)، والجانب مبعثر (SSC)، فيكوإيريترين (PE) -Texas الأحمر، الأزرق المحيط الهادئ، فلوريسئين ثيوسيانات (FITC)، Allophycocyanin (APC) وأي استخدام fluorophore أخرىد لتسمية الخلايا.
  2. قبل تحميل في فارز الخلية، لفترة وجيزة دوامة كل عينة إلى resuspend الخلايا.
  3. تبدأ مع تحليل العينة غير ملوثين من أجل وضع بوابات بالنسبة لمجموع السكان الخلية، لاستبعاد الحطام الخلوي، وتحديد خط الأساس تألق ذاتي.
  4. إضافة يوديد propidium (PI) على عينة غير ملوثين وتحليلها من أجل رؤية السكان من الخلايا الحية داخل مجموع السكان الخلية. بناء بوابة حول هذه الفئة من السكان.
  5. تحليل عينة سيطرة أحادية اللون لكل تألقي من أجل وضع تعويض مضان.
  6. تحليل العينة الملون لتحديد موقف من البوابات للفرز.
  7. إضافة إلى PI العينة الملون من أجل وصمة عار الخلايا الميتة.
  8. فرز السكان الخلية المسمى. ترتيب إما إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي أو أنابيب مخروطية (15 مل) التي تحتوي على مستنبت.
  9. وقف الفرز مرة واحدة وقد تم الحصول على الكمية المطلوبة من خلايا يدويا.
  10. لناFACS جي، إجراء فحص النقاء من خلال تحليل جزء صغير (على سبيل المثال، 500 خلية) من سكان الخلية المكتسبة.
    ملاحظة: هذه الخطوة تؤكد على نقاء السكان الخلية فرزها. من الناحية المثالية، ينبغي أن يكون النقاء أكبر من 90-95٪.
  11. خلايا الطرد المركزي في 233 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية التالية مباشرة الانتهاء من الفرز وresuspend في 1 مل من المتوسط ​​الطازجة تحتوي على 10٪ FBS.
    ملاحظة: يمكن زيادة كمية سائل الإعلام المستخدمة على أساس حجم الخلية بيليه.
  12. لوحة على لوحات الجيلاتين المغلفة لتحسين بقاء الخلية. اعتمادا على محصول خلية النهائي، لوحة 300،000 الخلايا لكل بئر في لوحة 6 جيدا، 100،000 الخلايا لكل بئر في لوحة 12-جيدا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

باستخدام CD90 كعلامة للخلايا مع تعزيز النتائج تكون العظم في عزلة من سكان عالي التخصيب من ASCS الإنسان (الشكل 1A، 1B). كانت ملطخة ASCS مع باسيفيك بلو-مترافق CD45 مكافحة الإنسان، FITC مترافق CD105 مكافحة الإنسان، وAPC-مترافق CD90 مكافحة الإنسان. بعد الفرز، وكان مستوى من النقاء أكبر من 98٪، كما كميا عن طريق تحليل ما بعد الفرز.

تحديد مجموعات من الخلايا استنادا لمحات النسخي يسمح لعزل المحتملين اثنين م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

حاليا، وعزل مجموعات سكانية فرعية متجانسة من ASCS من صندوق التبرعات الخاص من الأنسجة الدهنية لجسم الإنسان لا يزال يشكل تحديا على الرغم من الهدف المرغوب فيه. عزلة المجموعات السكانية الفرعية ASC الموالية للالمكونة للعظم أمر مرغوب فيه بشكل خاص، كما مثل هذه الخلايا يمكن استخدامها لدراسة تشكيل والتوازن من الأنسجة العظمية. ومع ذلك، فإن صندوق التبرعات الخاص من الأنسجة الدهنية المرافئ عدم تجانس كبير فيما يتعلق كبح قدرة الخلايا وإمكانية التمايز. 11 والأساس الجزيئي لهذا التجانس لا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

أي من الكتاب لديهم مصلحة مالية في أي من المنتجات والأجهزة وأو المخدرات المذكورة في هذه المخطوطة. أي من الكتاب لديه أي مصلحة مالية المتنافسة لتقديم تقرير.

شكر وتقدير

وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للبحوث الصحية منحة R01-DE021683-01 والمعاهد الوطنية للبحوث الصحية منحة R01-DE019434 إلى MTL. وأيد زمالة أبحاث معهد هوارد هيوز الطبي لMTCDCW من قبل فرانكلين مارتن كلية زمالة ACS البحوث، ومختبر Hagey للأطفال الطب التجديدي، وجائزة معهد بحوث صحة الطفل بجامعة ستانفورد كلية إجابات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب مخروطية يمكن التخلص منها 250 ملكورنينج (توماس ساينتفيك)2602A43
بنسلين ستربتومايسين (10,000 وحدة / مل)جيبكو15140-122
DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، مكمل جلوتاماكسجيبكو10566-016
PBS ، درجة الحموضة 7.4جيبكو10010-023
بيتادين - مطهر بوفيدون / محلول اليودPurdue   ؛PFC-67618015017
محلول الملح المتوازن من هانك ، 1XCellgro21-023-CV
مصل الأبقار الجنينية ، معتمد ، من أصل أمريكيGibco16000-044
كولاجيناز من  المطثية هيستوليتيكومسيجما-ألدريتشC0130-5G
ACCUTASE حل انفصالالجذعيةتقنيات الخلايا الجذعية 7920
APC ماوس مضاد للإنسان CD90BD Pharmingen559869
FITC ماوس مضاد للإنسان CD105 (إندوغلين) BDPharmingen561443
مضاد للإنسان CD45 eFluor 450 (استبدال أزرق المحيط الهادئ)  eBioscience48-9459-41
مكافحة الإنسان CD34 APCeBioscience17-0349-41
مكافحة الإنسان CD31 (PECAM-1) PEeBioscience12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7eBioscience25-4317-82
BD FACS Aria II أداةBD Biosciences
BD FACSDiva SoftwareBD Biosciences
الخلايا

المراجع

  1. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 121, 1217-1221 (2011).
  2. Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. Microfluidic large-scale integration. Science. 298, 580-584 (2002).
  3. Warren, L., Bryder, D., Weissman, I. L., Quake, S. R. Transcription factor profiling in individual hematopoietic progenitors by digital RT-PCR. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 17807-17812 (2006).
  4. Warren, L. A., et al. Transcriptional instability is not a universal attribute of aging. Aging Cell. 6, 775-782 (2007).
  5. Aalami, O. O., et al. Applications of a mouse model of calvarial healing: differences in regenerative abilities of juveniles and adults. Plast Reconstr Surg. 114, 713-720 (2004).
  6. Levi, B., et al. CD105 protein depletion enhances human adipose-derived stromal cell osteogenesis through reduction of transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) signaling. The Journal of biological chemistry. 286, 39497-39509 (2011).
  7. Chen, X. D., Qian, H. Y., Neff, L., Satomura, K., Horowitz, M. C. Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage. J Bone Miner Res. 14, 362-375 (1999).
  8. Malladi, P., Xu, Y., Yang, G. P., Longaker, M. T. Functions of vitamin D, retinoic acid, and dexamethasone in mouse adipose-derived mesenchymal cells. Tissue engineering. 12, 2031-2040 (2006).
  9. Levi, B., et al. Depot-specific variation in the osteogenic and adipogenic potential of human adipose-derived stromal cells. Plastic and reconstructive surgery. 126, 822-834 (2010).
  10. James, A. W., et al. Estrogen/estrogen receptor alpha signaling in mouse posterofrontal cranial suture fusion. PloS one. 4, e1720(2009).
  11. Locke, M., Feisst, V., Dunbar, P. R. Concise review: human adipose-derived stem cells: separating promise from clinical need. Stem Cells. 29, 404-411 (2011).
  12. Glotzbach, J. P., et al. An Information Theoretic, Microfluidic-Based Single Cell Analysis Permits Identification of Subpopulations among Putatively Homogeneous Stem Cells. PLoS One. 6, e21211(2011).
  13. Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. Manual isolation of adipose-derived stem cells from human lipoaspirates. J. Vis. Exp. , e50585(2013).
  14. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24, 376-385 (2006).
  15. McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10, 637-644 (2011).
  16. Katz, A. J., Tholpady, A., Tholpady, S. S., Shang, H., Ogle, R. C. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells. Stem Cells. 23, 412-423 (2005).
  17. McIntosh, K., et al. The immunogenicity of human adipose-derived cells: temporal changes in vitro. Stem Cells. 24, 1246-1253 (2006).
  18. Choudhery, M. S., Badowski, M., Muise, A., Pierce, J., Harris, D. T. Donor age negatively impacts adipose tissue-derived mesenchymal stem cell expansion and differentiation. Journal of translational medicine. 12, 8(2014).
  19. Yoshimura, K., Suga, H., Eto, H. Adipose-derived stem/progenitor cells: roles in adipose tissue remodeling and potential use for soft tissue augmentation. Regenerative medicine. 4, 265-273 (2009).
  20. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CD90
العزلة وإثراء الإنسان الدهنية المشتقة من خلايا انسجة لتعزيز تكون العظم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.