مقالة منهجية

الحث المباشر من العصبية الإنسان الخلايا الجذعية من خلايا الدم المحيطي المكونة للدم السلف

DOI:

10.3791/52298

⸱

يناير 28, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Laboratory of Molecular Medicine and Neuroscience, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم تطوير طريقة لاستخلاص مباشرة الخلايا الجذعية العصبية البشرية من الخلايا الاصلية المكونة للدم التخصيب من خلايا الدم الطرفية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأمراض التي تصيب البشر الثقافات العصبية محددة ضرورية لتوليد نماذج في المختبر للأمراض العصبية البشرية. ومع ذلك، فإن عدم الوصول إلى الكبار البشري الثقافات العصبية الأولية يثير تحديات فريدة من نوعها. التطورات الأخيرة في الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (IPSC) توفر نهجا بديلا لاستخلاص الثقافات العصبية من الخلايا الليفية الجلد من خلال المريض IPSC محددة، ولكن هذه العملية كثيفة العمالة، ويتطلب خبرة خاصة وكميات كبيرة من الموارد، ويمكن أن يستغرق عدة أشهر. هذا يمنع تطبيق واسع لهذه التكنولوجيا لدراسة الأمراض العصبية. للتغلب على بعض من هذه القضايا، وقد وضعنا طريقة لاستخلاص الخلايا الجذعية العصبية مباشرة من الكبار البشري الدم المحيطي، وتجاوز عملية الاشتقاق IPSC. كانت الخلايا الاصلية المكونة للدم المخصب من الكبار البشري الدم المحيطي المستزرعة في المختبر، وtransfected مع ناقلات فيروس سينداي التي تحتوي على عوامل النسخي Sox2 أكتوبر3/4، Klf4، وج. Myc على. نتائج ترنسفكأيشن في تغيرات شكلية في الخلايا التي يتم اختيارها مزيد باستخدام البشري المتوسطة السلف العصبية التي تحتوي على عامل أساسي نمو الخلايا الليفية (bFGF) وعامل نمو بطانة الأوعية الدموية (VEGF). وتتميز الخلايا الناجم عن ذلك التعبير عن علامات الخلايا الجذعية العصبية، مثل nestin وSOX2. هذه الخلايا الجذعية العصبية يمكن أن تكون متباينة أيضا على الخلايا العصبية، دبق نجمي الخلايا و oligodendrocytes في وسائل الإعلام التمايز محدد. يمكن الوصول إليها بسهولة عن طريق عينات الدم المحيطية الإنسان، يمكن أن تستخدم هذه الطريقة لاستخلاص الخلايا الجذعية العصبية لمزيد من التمايز للخلايا العصبية في المختبر لنماذج من الاضطرابات العصبية ويمكن أن تقدم الدراسات المتعلقة المرضية وعلاج تلك الأمراض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في المختبر وقد استخدمت الثقافات العصبية كأداة أساسية للدراسات الأمراض العصبية. الحيوان الأساسي (ومعظمهم من القوارض) الثقافات العصبية 1 و 2 و خطوط الخلايا العصبية البشرية المستمدة من الاورام الدبقية أو الأورام الأخرى هي الأكثر استخداما في مثل هذه الدراسات. ومع ذلك، فقد تم الاعتراف بأن هناك اختلافات كبيرة بين القوارض والخلايا البشرية. لا يمكن أن تترجم العديد من النتائج على أساس القوارض للإنسان. وعلاوة على ذلك، مع التطورات السريعة في تحليل المعلومات الجينومية الجماعية والتحرير الجين السهل نسبيا وكله تسلسل الجينوم، فإن الاتجاه هو المزيد والمزيد من استعداداتها لاكتشاف المرض الجينات معرضة وترسيم وظائفهم وأدوارهم في أمراض معينة، مما يجعل الخلايا العصبية البشرية قليلة وقد خطوط الخلايا استخدام تقتصر فقط. من الناحية النظرية، والثقافات العصبية الأولية الإنسان المستمدة من عينات من الجهاز العصبي المريض هي أفضل خيار إلا أنه من المستحيل للحصول عليها. ميث بالتالي البديلالمواد المستنفدة للأوزون ضرورية. في السنوات الأخيرة، تم ملاحقة بعض المناهج، مع اثنين من كونها الأكثر تمييزها. بعد تطوير هذه التقنية لتوليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (IPSC) باستخدام الماوس والخلايا الجسدية الإنسان 3، 4، والخلايا العصبية يمكن أن يكون أبعد متباينة منها 5-7. ومع ذلك، وتوليد وتوصيف IPSC يطالب كثيفة العمالة، والتقنيات، والمدخلات الوقت، وأحيانا حتى باهظة. بعد فترة وجيزة، تم تطوير نهج آخر لتحويل الخلايا العصبية مباشرة من الخلايا الجسدية 8، 9. وبما أن الخلايا العصبية الناتجة غير التكاثري، فإنه يحد تطبيقه في الدراسات المكثفة وفحص المخدرات، الأمر الذي يتطلب كمية كبيرة من الخلايا. للاستفادة من التقنيات على حد سواء، الاشتقاق المباشر للالجذعية العصبية / الخلايا الاصلية من الخلايا الجسدية تم استكشافها من قبل عدة مجموعات 10-12، التي تتجاوز عملية شاقة من الجيل IPSC وتوصيف ولكن لا يزال. نحن نتعاملقصر عدد محترم من الخلايا الجذعية العصبية للتمايز العصبي لاحق. لقد أظهرنا سابقا أنه بعد إدخال عوامل النسخ ياماناكا في الخلايا الاصلية المكونة للدم والخلايا الجذعية العصبية يمكن أن تتولد مباشرة باستخدام خلية العصبية السلف اختيار المتوسطة 13. هنا، ونحن التقرير الطريقة بالتفصيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إثراء المكونة للدم السلف خلايا من الدم الكامل الكبار

ملاحظة: السلف المكونة للدم الخلايا أو CD34 + الخلايا يمكن تنقيته من خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMCs) المستمدة من مجموعة متنوعة من المصادر بما في ذلك دم الحبل السري، المواد فصادة الكريات البيض والدم كله باستخدام الأساليب القائمة على التدرج الكثافة الطرد المركزي. طريقة سردها هنا يستخدم الدم الكامل كمثال على ذلك.

  1. عزل PBMCs من الدم المجموع:
    1. إضافة 4.5 مل من فصل الخلايا اللمفاوية المتوسطة إلى أنبوب SepMate من قبل pipetting من خلال ثقب المركزي للإدراج.
    2. تمييع عينة من الدم مع حجم مساو من DPBS العقيمة التي تحتوي على مصل الإنسان 2٪ (ت / ت). على سبيل المثال، وتمييع 5 مل من العينة مع 5 مل من DPBS + 2٪ مصل البشري.
    3. إضافة نموذج المخفف من قبل pipetting عليه الجانب من الأنبوب. والحرص على عدم صب عينة مباشرة من خلال ثقب مركزي.
    4. أجهزة الطرد المركزي في 1،200 x ج لمدة 10 دقيقة في RT.
    5. إزالة بعناية طاف فوق طبقة PMBC.
    6. جمع طبقة PBMC (غائم) في أنبوب جديد.
    7. إضافة 15 مل من Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS) المحتوية على مصل الإنسان 2٪ في أنبوب والطرد المركزي في 150 x ج لمدة 10 دقيقة في RT مع قبالة الفرامل.
    8. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 15 مل من DPBS المحتوية على مصل الإنسان 2٪. حساب عدد الخلايا.
    9. أجهزة الطرد المركزي في 690 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. إزالة كافة طاف من الأنبوب.
    10. Resuspend الخلايا في 1 × 10 7 خلايا في 15 مل من تعديل Dulbecco Iscove في متوسطة (IMDM) التي تحتوي على 1٪ المضادات الحيوية (ت / ت) والمصل البشري 10٪ (ت / ت).
    11. احتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة قبل عزل خلايا CD34 +.
  2. اختيار الإيجابي للCD34 + الخلايا من PBMCs باستخدام CD34 MultiSort كيت:
    ملاحظة: العمل بسرعة واستخدام حلول تبريد مسبقا لجعل خلايا البرد ومنع السدالأجسام المضادة على سطح الخلية ووضع العلامات الخلايا غير محدد فقا للتعليمات عدة.
    1. جمع كل PMBCs في أنبوب 50 مل وحساب عدد من مجموع الخلايا في المتوسط.
    2. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة كافة طاف تماما.
    3. و resuspend تصل إلى 10 8 خلايا لكل 300 ميكرولتر العازلة في حبة (DPBS تحتوي على 0.5٪ مصل الإنسان (ت / ت) و 2 ملي EDTA).
    4. إضافة 100 ميكرولتر من FCR حجب الكاشف وإضافة 100 ميكرولتر من MultiSortMicroBeads CD34.
    5. تخلط جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في الثلاجة (2-8 ° C).
    6. غسل الخلايا بإضافة 2 مل من العازلة حبة لكل 10 8 خلايا وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. إزالة طاف تماما.
    7. و resuspend تصل إلى 10 8 الخلايا في 500 ميكرولتر من العازلة.
    8. وضع العمود MACS LS في المجال المغناطيسي لMACS فاصل وإعداد العمود قبل الشطف مع 3 مل من العازلة حبة.
    9. تطبيق تعليق خلية على CENTEص من العمود. غير المسماة الخلايا سوف تتدفق من خلالها يمكن جمعها إذا المفضل.
    10. غسل العمود ثلاث مرات مع 3 مل من العازلة حبة.
    11. إزالة عمود من الفاصل ووضعه على أنبوب 15 مل.
    12. إضافة 5 مل من العازلة حبة على العمود وتدفق على الفور خارج الخلايا المسمى مغناطيسيا عن طريق دفع المكبس في العمود.
    13. إضافة 20 ميكرولتر من MultiSort الإصدار الكاشف لكل 1 مل من التعليق الخلية. تخلط جيدا واحتضان لمدة 10 دقيقة في الثلاجة (2-8 ° C).
    14. إضافة 1 - 2 مل من العازلة حبة لكل 10 7 خلايا وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. إزالة طاف تماما.
    15. Resuspend الخلايا في 50 ميكرولتر من العازلة حبة لكل 10 7 الخلايا.
    16. إضافة 30 ميكرولتر من MultiSort وقف الكاشف لكل 10 7 الخلايا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الثلاجة.
    17. إضافة 5 مل من العازلة حبة وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. تجاهل طاف.

2. اشتقاق المستحثة الخلايا الجذعية العصبية من CD34 + الخلايا

  1. CD34 + الخلايا الثقافة:
    ملاحظة: يجب أن تستخدم أعدت طازجة المتوسطة خلال 7 أيام عند تخزينها في الثلاجة. ويمكن ملاحظة هامة فقدان خلايا CD34 بعد 24 ساعة ولكن ينبغي أن يكون انتشار كبير من خلايا ملحوظ، وخاصة بعد يوم 5. إذا يقلل من عدد الخلايا بشكل مستمر أو عدم وجود انتشار، فإنه يعني إما نوعية سيئة من خلايا متوسطة أو CD34 والخلايا لا ينبغي أن تستخدم للخطوة التالية.
    1. في resuspend والثقافة CD34 + الخلايا في CD34 الحفاظ المتوسطة (StemSpan SFEM المتوسطة التي تحتوي على ثرومبوبويتين الإنسان (TPO، 100 نانوغرام / مل)، FMS مثل التيروزين كيناز 3 (العميد بحري-3) يجند (100 نانوغرام / مل)، ووقف عامل الخلية (SCF، 100 نانوغرام / مل)، انترلوكين 6 (IL-6، 20 نانوغرام / مل)، وانترلوكين 7 (IL-7، 20 نانوغرام / مل)) في لوحة 24-جيدا (حتى 3 × 10 5 / جيد في 1 مل من المتوسط ​​لكل بئر) في 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    2. AFثالثا مدار 24 ساعة، وجمع الخلايا العائمة وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 110 x ج في RT للتخلص من أي خلايا المرفقة والحطام الخلية. تجاهل طاف و resuspend الخلايا في 1 مل من CD34 الحفاظ على الطازجة المتوسطة والبذور في الجديدة 24 لوحة جيدا (تصل إلى 1 × 10 5 / جيد) عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 5 أيام إضافية.
    3. استبدال نصف المتوسط ​​كل يوم الآخرين من خلال الشفط بعناية النصف العلوي من طاف في حين أن CD34 + الخلايا تطفو على الجزء السفلي من الآبار (الشكل 1A).
  2. سينداي ترنسفكأيشن الفيروس:
    1. في يوم 5، وجمع خلايا CD34 وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 170 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. تجاهل طاف.
    2. resuspend الخلايا في متوسطة جديدة في 1 × 10 5 / بشكل جيد في لوحة 24-جيدا في 1 مل من المتوسط.
    3. ذوبان الجليد مجموعة إعادة برمجة cytotune-الجذع سينداي عن طريق غمر أولا قيعان من الأنابيب في 37 ° C حمام الماء لمدة 10 ثانية ثم ذوبان الجليد تماما لتي RT. لفترة وجيزة الطرد المركزي الأنابيب ووضعها على الجليد. تحضير خليط فيروس سينداي عن طريق خلط حجم الموصى بها من كل فيروس المدرجة على شهادة تحليل (COA) لالكثير المقابلة. MOI 15 يوصى.
    4. إضافة سينداي مزيج الفيروس إلى كل بئر من خلايا CD34. مزيج من الآبار عن طريق هز بلطف. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    5. مراقبة كفاءة ترنسفكأيشن بعد 24 ساعة. لاحظ أن المجاميع الخلية وتكوين المجال هي مؤشرات للنجاح ترنسفكأيشن (الشكل 1B).
    6. تغيير نصف المتوسط ​​عن طريق نقل بعناية النصف العلوي من متوسطة إلى آخر أيضا. إذا كانت هناك مجالات الخلايا في البئر الجديد، إضافة نفس الكمية من متوسطة جديدة.
    7. تغيير المتوسطة كل في اليوم الآخر بتكرار الخطوة 2.2.6.
  3. العصبية تحريض الخلايا الجذعية:
    ملاحظة: اعتمادا على الظروف الخلية، وبعد حوالي 5 أو 7 أيام ترنسفكأيشن، سوف الخلايا الملتصقة أحادي الطبقة تصل الى 30 -50٪ التقاء (الشكل 1C).
    1. إزالة supernatants تحتوي على خلايا العائمة والمجالات وثم يضاف 1 مل من العصبية المتوسطة السلف (Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة: خليط من المغذيات F-12 (DMEM / F12)، التي تحتوي على 1X N2 ملحق، 0.1٪ (ث / ت) ألبومين المصل البقري ( BSA)، 1٪ (ت / ت) المضادات الحيوية، و 20 نانوغرام / مل من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF)، و 20 نانوغرام / مل من عامل نمو البشرة (EGF)) في الخلايا الملتصقة.
    2. اختياريا، فصل المجالات الخلية بواسطة pipetting بلطف وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 170 x ج لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف و resuspend الخلايا في 1 مل من العصبية المتوسطة السلف في 24 لوحة جيدا الجديدة المغلفة مع matrigel في التعليمات والنسخ الاحتياطي.
    3. تغيير المتوسطة كل يوم حتى تصل إلى خلايا 60-80٪ متموجة، وعادة بعد 1 أسبوع.
    4. تجاهل طاف وإضافة في 1 مل من الجذعية العصبية المتوسطة الخلية (المصل خالية المتوسطة، NSC SFM). فصل الخلايا باستخدام مكشطة الخلية يتبعقبل pipetting لطيف جدا.
    5. إزالة الخلايا والبذور كل منهم في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا. إضافة 1 مل أخرى من العصبية المتوسطة الخلايا الجذعية لجعل 2 مل سائل الإعلام لكل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    6. تغيير المتوسطة كل في اليوم الآخر.
    7. وعندما وصلت خلايا 60٪ التقاء، وفصل replate الخلايا في نسبة 1: 3 باتباع الخطوات المذكورة في 2.3.4 و2.3.6.
  4. تجميد الخلايا الجذعية العصبية:
    1. إعداد الخلايا الجذعية العصبية تجميد المتوسطة من خلال إضافة 20٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في العصبي المتوسطة الخلايا الجذعية. إبقاء المتوسطة تجميد على الجليد.
    2. فصل الخلايا في لوحة 6 جيدا، وذلك باستخدام مكشطة خلية تليها pipetting بلطف. عدد الخلايا. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 170 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. تجاهل طاف.
    3. resuspend الخلايا العصبية في متوسطة الخلايا الجذعية في 1 × 10 6 / مل. إضافة نفس الحجم من تجميد متوسطة إلى الخلايا.
    4. إضافة 1 مل (5 × 10 5 مجموع الخلايا) من الخلايا في cryovial. تجميد الخلايا باستخدام تجميد حاوية السيد Froster اتباع تعليمات.

3. تمايز الخلايا العصبية

  1. الخلايا العصبية التمايز:
    1. عندما تصل الخلايا الجذعية العصبية 80٪ التقاء، فصل الخلايا الجذعية العصبية باستخدام شرطي المطاط ثم فصل من قبل pipetting بلطف.
    2. عد الخلايا وضبط تركيز إلى 1 × 10 5 / مل في العصبي المتوسطة الخلايا الجذعية.
    3. لتمايز الخلايا العصبية، لوحة الخلايا على بولي-D-يسين / laminin المغلفة غطاء ينزلق في 24 لوحات جيدا في 1 × 10 5 / جيد. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    4. استبدال المتوسطة مع العصبية المتوسطة التمايز (DMEM / F12 تحتوي على 1X N2 ملحق، 1X B27 ملحق، 300 نانوغرام / مل المخيم، 0.2 ملي فيتامين C، 10 نانوغرام / مل الدماغ المستمدة عامل التغذية العصبية (BDNF) و 10 نانوغرام / مل الخلايا الدبقية مشتقة عامل التغذية العصبية (GDNF)) AFثالثا 24 ساعة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    5. تغيير العصبي المتوسطة التمايز مرتين في الأسبوع لمدة 2 أسابيع.
  2. التمايز Astroglial:
    1. فصل الخلايا الجذعية العصبية من قبل pipetting.
    2. عد الخلايا وضبط تركيز الخلية إلى 5 × 10 4 خلية / مل. البذور الخلايا على 24 لوحات جيدا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    3. استبدال المتوسطة مع DMEM / F12 مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة.
    4. تغيير متوسطة مرتين في الأسبوع لمدة 2 أسابيع. إذا خلايا الوصول إلى نقطة التقاء قبل 2 أسابيع، replate الخلايا الخطوات التالية 3.2.1 و3.2.2.
  3. دبقية قليلة التغصن التمايز:
    1. فصل الخلايا الجذعية العصبية من قبل pipetting.
    2. عدد الخلايا والبذور 1 × 10 5 الخلايا على بولي-L-الأورنيثين المغلفة 24 لوحات جيدا في 1 مل من دبقية قليلة التغصن differentiمتوسطة أوجه تتألف من DMEM / F12 تحتوي على ملحق N2، 10 نانوغرام / مل من الصفائح الدموية المستمدة عامل النمو-AA (PDGF-AA)، 2 نانوغرام / مل من neurotrophin-3 (NT-3)، 2 نانوغرام / مل من القنفذ سونيك ( SHH)، و 3 نيوتن متر من ثلاثي يودو ثيرونين (T3). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    3. تغيير متوسطة مرتين في الأسبوع لمدة 2 أسابيع.
    4. استبدال المتوسطة مع DMEM / F12 مع 1xN2 ملحق و 3 نيوتن متر من T3 و ثقافة الخلايا لمدة أسبوع إضافي لالبروتين الأساسي المايلين (ب ب) الإنتاج.

4. المناعي تلطيخ

  1. استبدال وسائل الإعلام مع 4٪ بارافورمالدهيد (PFA). احتضان لمدة 10 دقيقة في RT.
  2. تجاهل PFA وتغسل مع PBS تحتوي على 0.1٪ تريتون X-100 (PBS-T) 3 مرات، 5 دقائق في كل مرة.
  3. Permeabilize الخلايا مع PBS تحتوي على 0.5٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة في RT.
  4. منع الخلايا مع PBS-T تحتوي على 4٪ مصل الماعز لمدة 20 دقيقة في RT.
  5. احتضان الخلايا مع antibo الأساسي المقابلةوفاة مخففة في تحتوي على 0.1٪ BSA لمدة 2 ساعة على RT أو O / N في غرفة باردة PBS-T.
  6. غسل الخلايا لمدة 3 مرات مع PBS-T، 5 دقائق في كل مرة. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية إلى جانب وجود تألقي باستخدام 1 المقابلة: 400 التخفيف في تحتوي على 0.1٪ BSA لمدة 1 ساعة على شاكر في الظلام PBS-T.
  7. غسل الخلايا مع تحتوي على 4 "، 6-diamidino-2-phenylindole (دابي) لمدة 10 دقيقة في RT PBS-T.
  8. غسل الخلايا مرتين أخريين مع PBS-T لمدة 5 دقائق كل في RT.
  9. مراقبة الخلايا المسمى باستخدام المجهر والتقاط الصور (الشكل 3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نوعية خلايا CD34 أمر بالغ الأهمية لنجاح العصبي التنبيغ الخلايا الجذعية. خلايا CD34 جودة عالية تتكاثر خلال أول يومين من الثقافة ويبدو أنها غير ملتصقة، وخلايا مستديرة متجانس، وتطفو فوق الجزء السفلي من السفن الثقافة (الشكل 1A). نتائج العدوى الناجحة في المجاميع خلية، والذي يوسع على مر الزمن (الشكل 1B)، في حين قد تحدث المجاميع خلية غير محددة خلال زراعة الخلايا، التي تعمل على توسيع والجمعيات هي فضفاضة. وعادة ما تظهر الخلايا الملتصقة حول ثلاثة إلى خمسة أ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد بروتوكول مفصلة لتوليد مباشرة الخلايا الجذعية العصبية من الخلايا الاصلية المكونة للدم الطرفية.

مقارنة مع الخلايا الليفية، الدم المحيطي البشري هو أكثر سهولة. باستخدام بروتوكول المقدمة، أكثر من 1 × 10 5 الخلايا المكونة للدم السلف، أو خلايا إيجابية CD34، يمكن المخصب من 10 مل من الدم الكامل. على الرغم من أن التلوث مع الصفائح الدموية وعادة لا يمكن الوقاية منها، ويمكن تقليص النتيجة عن طريق الطرد المركزي ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تمويل الدراسة من قبل الصناديق الداخلية للمعاهد الوطنية للصحة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وسط فصل الخلايا الليمفاويةLonza17-829E1x
SepMateStemcell Technologies1541515 مل
مصل بشريInvitrogen34005-100
مضادات حيويةGibco15240-0621٪
CD34 MultiSort KitMiltenyi Biotec130-056-701
EDTACellgro46-034-Cl2 ملي متر
ماك LS عمودMiltenyi Biotec130-042-401
StemSpan SFEM تقنياتالخلايا الجذعيةالمتوسطة 96501x
IMDMجودة البيولوجية112-035-1011x
TPOPeprotech300-18100 نانوغرام / مل
Flt-3Peprotech300-19100 نانوغرام / مل
SCFPeprotech300-07100 نانوغرام / مل
IL-6Peprotech200-0620 نانوغرام / مل
IL-7Peprotech200-0720 نانوغرام / مل
IPS Sendai إعادة برمجة كيتLife TechnologiesA1378001
مكشطة خليةSarstedt83.183
قوارير
CryoTubeThermo368632
Mr. Frosty containerThermo5100-0001
DMEM / F12Life Technologies12400-0241x
N2 supplementLife Technologies17502-0481x
ألبومين مصل البقرSigmaA29340.1٪ (وزن / حجم)
bFGFPeprotech100-18B20 نانوغرام / مل
EGFمكمل PeprotechAF-100-15
B27Life Technologies17504-0441x
NSC مصل خال منمتوسطة تقنيات الحياةA10509011x
Poly-D-lysine / laminin الغطاء المطلي بزلاتBD Bioscences354087
cAMPSigmaA9501300 نانوغرام / مل
فيتامين سيسيجماA02780.2 ملي
BDNFPeprotech450-0210 نانوغرام / مل
GDNFPeprotech450-1010 نانوغرام / مل
بولي إل أورنيثينسيجماP49571x
PDGF-AAبيبروتك100-13أمبير 10 نانوغرام / مل
NT-3بيبروتك450-032 نانوغرام / مل
ShhPeprotech1314-SH / CF2 نانوغرام / مل
T3SigmaT63973 نانومتر
PFASigmaP61484٪
PBSجودة بيولوجية119-069-1011x
مصل الماعزSigmaG90234٪
TritonX-100SigmaT9284
فأر أحادي النسيلة مضاد ل NestinMilliporeAB59221: 1،000 التخفيف
المضاد ل SOX2 الأجسام المضادةتطبيق الخلايا الجذعيةASA0120جاهزة للاستخدام
الفأر المضادة وبيتا ؛ III-tubulin الأجسام المضادةPromegaG712A1: 1,000 تخفيف
الأرانب المضادة للجسم المضاد GFAPSigmaG45461:100 التخفيف
المضاد للجسم المضاد O4R & D SystemsMAB1326IgM ؛ 1 نانوغرام / مل
Alexa Fluor 594 الماعز المضاد للأجسام المضادة للأرانبالحياةA110121:400 التخفيف
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للأجسام المضادة للفأرتقنيات الحياةA110011:400 التخفيف
Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للفأر IgM الأجسام المضادةتقنيات الحياةA210421:250 التخفيف
DAPISigmaD95421 & مو جم / مل
DMSO Sigma D2650 تقنيات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941(2011).
  2. Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington's Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193(2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
  8. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  9. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
  10. Lee, S. -T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801(2011).
  11. Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  12. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
  13. Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720(2013).
  14. Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
  15. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
  16. Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD34 Nestin SOX2

مقالات ذات صلة