يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس

10.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52580

⸱

فبراير 22, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry, University of California, Irvine, 2Physiology and Biophysics, University of California, Irvine, 3Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine, 4University of California San Francisco Diabetes Center, University of California, San Francisco, 5Pathology, University of Utah

في هذه المقالة

ملخص

وخارج الحي إعداد جديد لتصوير النخاع الشوكي الماوس. هذا البروتوكول يسمح لاثنين من الفوتون التصوير من التفاعلات الخلوية الحية في جميع أنحاء الحبل الشوكي.

الملخص

يتم استخدام الفحص المجهري ثنائي الفوتون (2P) < p class = 'jove_content'> للكشف عن الديناميكيات الخلوية والتفاعلات في أعماق الأنسجة الحية السليمة. هنا ، نقدم طريقة لتصوير الخلايا الحية في الحبل الشوكي للفئران. هذه التقنية مناسبة بشكل فريد لتحليل ديناميكيات الخلايا السليفة العصبية (NPC) بعد الزرع في الحبل الشوكي التي تخضع لاضطرابات إزالة الميالين العصبية. تهاجر الشخصيات غير القابلة للعب إلى مواقع التلف المحوري ، وتتكاثر ، وتتمايز إلى الخلايا قليلة التغصن ، وتشارك في إعادة تكوين الميالين المباشرة. وبالتالي فإن الشخصيات غير القابلة للعب هي علاج علاجي واعد لتخفيف الأمراض المزمنة المزيلة للميالين. نظرا لأن الشخصيات غير القابلة للعب المزروعة تهاجر إلى المناطق المتضررة على الجانب البطني من الحبل الشوكي ، فإن التصوير التقليدي داخل الحيوية 2P أمر مستحيل ، ولم تكن المعلومات سوى المعلومات حول التفاعلات الثابتة متاحة سابقا باستخدام أساليب التلوين الكيميائي النسيجي. على الرغم من أن هذه الطريقة تم إنشاؤها لتصوير الشخصيات غير القابلة للعب المزروعة في الحبل الشوكي البطني ، إلا أنه يمكن تطبيقها على العديد من الدراسات التي أجريت على الخلايا المزروعة والداخلية في جميع أنحاء الحبل الشوكي بأكمله. في هذه المقالة ، نوضح تحضير وتصوير الحبل الشوكي باستخدام محاور محسنة للبروتين الفلوري الأصفر المعبر عن البروتين الفلوري المحسنة ومحسنة غير قابلة للعب المزروعة التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر.

المقدمة

نماذج الماوس من إزالة الميالين، بما في ذلك التهاب الدماغ والنخاع التجريبي المناعة الذاتية (EAE) والعدوى داخل الجمجمة مع neuroadapted فيروس التهاب الكبد الماوس (MHV)، هي أدوات ممتازة لدراسة المسارات الجزيئية والتفاعلات الخلوية المرتبطة المرض. كما أدت إلى وبدعم وافقت ادارة الاغذية والعقاقير فعالية العلاجات الدوائية، وتستهدف وقف المناعة الذاتية والتهاب 1 في المقام الأول. ومع ذلك، مرة واحدة وفشلت عودة الميالين الذاتية، والعلاجات المعتمدة حاليا لا إصلاح فعال آفات عديمة الميلين في الجهاز العصبي المركزي. لذلك، والعلاجات التي تركز على إصلاح في هذه المرحلة من المرض الحرجة للتخفيف من الأعراض المزمنة وتحسين نوعية الحياة. في الآونة الأخيرة، أصبحت خلايا العصبية السلائف (الشخصيات) الى الواجهة كطريقة علاجية التجدد المحتملة لاستهداف مناطق الالتهاب وإزالة الميالين. وقد أبرزت العديد من الدراسات قدرة اللجان التحضيرية الوطنية للحث على endogenoلنا عودة الميالين والمشاركة مباشرة في عودة الميالين 2-8. وذلك لأن وتشارك الشخصيات في عودة الميالين المباشر، لا بد من فهم حركية والتفاعلات مع الخلايا الذاتية بعد زرع. بعد زرع، الشخصيات تهاجر البطني إلى مناطق الضرر المادة البيضاء، ثم rostrally ونحو caudally النسبية الى الموقع زرع 5،9. حركية الهجرة تختلف في استجابة لمنبهات البيئية؛ الشخصيات زرعها في الحبل الشوكي غير التالفة لها سرعات أكبر من الشخصيات زرعها في الحبل الشوكي التالفة 6. بعد فترة المهاجرة، ونقل الشخصيات تتكاثر على نطاق واسع، بمعدل أعلى في التالفة الحبل الشوكي بالنسبة إلى الحبل الشوكي سليما 6. وأخيرا، فإن غالبية الشخصيات تفرق في قليلة التغصن والشروع 4،6،9 عودة الميالين المباشر.

الآفة عديمة الميلين معقدة ويمكن أن تشمل مجموعة متنوعة من السكان من الخلايا في مراحل مختلفة منctivation. على سبيل المثال، يمكن أن تشمل على التصلب المتعدد (MS) الآفة النشطة عدد كبير من السكان من خلايا تنشيط T، الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة M1 M1، ولكن يمكن أن تتكون لالمزمنة الصامتة MS الآفة أساسا من الخلايا النجمية على رد الفعل مع عدد قليل من الخلايا الالتهابية 10-13. ونظرا لتنوع الخلايا المستجيب، واثنين من الفوتون (2P) التصوير في نماذج الماوس من إزالة الميالين هو أداة مفيدة للغاية للمساعدة في فهم التفاعلات الخلوية المحلية داخل الآفة. في MS والعديد من النماذج البحثية المستخدمة على نطاق واسع MS، والغالبية العظمى من الآفات وتقع على الجانب البطني من الحبل الشوكي، وهي منطقة يصعب الوصول إليها لتصوير حيوي داخلي 2P بسبب عمق الآفة والمحتوى الدهني المرتفع من الحبل الشوكي. للتحايل على هذه القضايا والتفاعلات دراسة خلية خلية داخل الآفات على طول الحبل الشوكي بطني قمنا بتطوير بسيط خارج الحي 2P إعداد التصوير 6.

هذه الدراسة بمتابعة أساليب نشر السابق، والذي أظهرالإجراء لزرع تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) الشخصيات -expressing في الحبل الشوكي للفئران التالية JHMV سلالة من MHV التي يسببها إزالة الميالين 14. يصاب خمسة أسابيع الفئران القديمة مع JHMV وزرعها مع EGFP-الشخصيات على مستوى الصدري 9 في يوم 14 بعد الإصابة. بروتوكول المعروضة هنا يوفر الخطوات مفصلة حول كيفية استخراج النخاع الشوكي، وجعل إعداد فيفو السابقين الاغاروز، وصورة زرع EGFP-NPC التفاعلات مع تعزيز بروتين فلوري الأصفر (EYFP) محاور -expressing. واستخدمت الفئران معربا عن EYFP تحت العصبية محددة Thy1 المروج في هذا الإجراء 15. فقط بعض من محاور التعبير عن EYFP، مما يجعلها مفيدة لتصوير محاور الفردية. نحن هنا تظهر النخاع الشوكي إزالتها في 7 أيام بعد زرع؛ ومع ذلك، النخاع الشوكي يمكن استخراجه في أي نقطة زمنية بعد زرع. في حين نظهر تفاعلات الشخصيات مع محاور التالفة، لدينا بروتوكول يمكن استخدامها في تركيبة مع علامات الفلورسنت الوراثيةمن أنواع الخلايا الأخرى للتحقيق في العديد من التفاعلات الخلوية التي تحدث في جميع أنحاء الحبل الشوكي الماوس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وتمت الموافقة على بروتوكول للتعامل مع الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة كاليفورنيا في ايرفين، بروتوكول # 2010-2943: بيان الأخلاق: ملاحظة.

1. إزالة الحبل الشوكي

  1. وضع المناشف الورقية المبللة مع ~ 100٪ الأيزوفلورين السائل، USP في القتل الرحيم الغرفة ووضع المناشف الورقية الجافة على القمة. ضع الماوس في غرفة في أعلى المناشف الورقية الجافة حتى الماوس لا لمس الأيزوفلورين وتأكد من تغطية الغرفة. الانتظار دقيقة واحدة على الأقل بعد التوقف عن التنفس للتأكد من أن الفأر هو الموت الرحيم.
  2. إجراء transection الشوكي من الرقبة لضمان الموت الرحيم الماوس. عدم تنفيذ خلع عنق الرحم وهذا يمكن أن يؤدي إلى تلف الحبل الشوكي.
  3. رش الفأر مع الايثانول 70٪ لترطيب الشعر.
  4. استخدام مقص الجميلة حادة لإزالة الشعر والجلد من الجزء الخلفي من الماوس لكشف العمود الفقري من نحو الصفيحة عنق الرحم 1 (C1) إلى الصفيحة العجزية 4 (S4).
  5. باستخدام مشرط بشفرة رقم 10، وجعل شقوق إلى اليسار واليمين من العمود الفقري لفصلها عن العضلات والدهون. وهذا سيجعل إزالة الحبل الشوكي أسهل بكثير.
  6. اختياري: أ رينجرز لور منحني يمكن أن تستخدم لحلج القطن بعيدا اللحم إضافية.
  7. في حين عقد الجزء العلوي من فقرات العمود الفقري مع ملقط غريف مسننة، وإدراج التيتانيوم منحني مقص Vannas مع الجانب المنحني تصل إلى العمود الفقري تتعرض في C1، والحرص على عدم لمس الحبل الشوكي.
  8. حرك التيتانيوم منحني مقص Vannas على طول الطريق إلى اليمين وجعل قطع صغيرة واحدة. يجب أن يسمع صوت أزمة صغير وشعرت كما قطعت مقص الفقرات. كرر هذا الخفض على الجانب أقصى اليسار من الحبل. يجب الحرص على عدم ذهاب بسرعة كبيرة جدا أو جعل كبيرة جدا من حيث سيؤدي ذلك إلى خفض خطر إتلاف سلك مع مقص.
  9. وينبغي أن تكون الصفيحة واحدة قادرة على أن يرفع مع ملقط مرة واحدة يتم قطع جانبي الفقرات. REPEAT هذه الخطوة لكل الصفيحة حتى S4، والاستمرار في عقد وسحب فقرات العمود الفقري.
    ملاحظة: سوف فقرات فوق موقع زرع المرجح أن يأتي قبالة بمجرد أقطعها الى الموقع زرع. مواصلة الإجراء ابتداء من أسفل الموقع زرع.
  10. اختياري: وضع فقرات أسفل لرؤية حيث الموقع زرع هو وقياس وخفض ~ 20 مم منقاري والذيلية الى الموقع زرع.
    ملاحظة: عندما زرع الشخصيات أكثر لن تكون هناك حاجة لأن الشخصيات المزروع عموما لا تهاجر أبعد من 15 ملم. فإن مقدار الحبل الشوكي حاجة أن تعتمد على التجربة والهجرة خصائص نوع من الخلايا المزروعة. مما يجعل تخفيضات منقاري والذيلية التي هي على مسافة واحدة الى الموقع زرع تمكين الموقع زرع أن تقع بسهولة أكبر أثناء التصوير.
  11. باستخدام مشرط بشفرة # 11 قطع بعناية العقد على اليمين واليسار من الجانب البطني من الحبل الشوكي ابتداء من نهاية منقاري. هذا ثسوء تمكين الحبل الشوكي إلى إزالتها من فقرات البطنية أكثر سهولة.
    ملاحظة: تم بسرعة (الخطوات 1،7 حتي 1،11)، والحبل الشوكي لا تجف. ومع ذلك، برنامج تلفزيوني 1X يمكن أن تدار على الحبل لإبقائها رطبة.
  12. عكس الماوس مع الاستمرار على الماوس لأعلى حتى النخاع الشوكي لأسفل. قشر بعناية الحبل الشوكي باستخدام ملقط مغلقة غريف مسننة. دون الخدش الحبل الشوكي، وقطع بعناية أي العقد المتبقية للسماح الحبل الشوكي إلى أن يرفع في قطعة سليمة واحد.
  13. تأكد من أن الحبل الشوكي هو في RPMI-1640 ووضعه على الجليد لنقلها إلى المجهر 2P.

2. إعداد الحبل الشوكي للتصوير

  1. تضمين الحبل الشوكي في الاغاروز
    1. الحفاظ على الحبل الشوكي معزولة في برود RPMI-1640 على الجليد قبل التصوير.
    2. تزن خارج الاغاروز (انخفاض درجة حرارة التبلور) وإعداد محلول 5٪ في 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X. الميكروويف الحل الاغاروز 5٪ لمدة 15 ثانية على حل AGنشأت وترك الحل بارد إلى 37 درجة مئوية.
    3. إعداد الحبل الشوكي عن طريق وضعها على ورقة من بارافيلم مع الجانب البطني مواجهة.
    4. الماصة حوالي 5 مل من 5٪ محلول الاغاروز على الجانب البطني من الحبل الشوكي. السماح للالاغاروز يصلب عن طريق التبريد إلى درجة حرارة الغرفة. التصلب الكامل يستغرق حوالي 5 دقائق.
    5. تطبيق طبقة خفيفة من مادة لاصقة من الأنسجة إلى 22 مم غطاء مربع زلة.
    6. عكس الحبل الشوكي جزءا لا يتجزأ، ووضع الجانب البطني على بارافيلم. والآن الجانب الظهري أن مواجهة. الالتزام انزلاق الغطاء إلى الجانب الظهري، وغمر الاغاروز جزءا لا يتجزأ من الحبل الشوكي / تغطية إعداد الانزلاق في RMPI لترسيخ لاصقة. إزالة الزائدة طدت الاغاروز باستخدام شفرة حلاقة.
  2. تركيب الحبل الشوكي على المسرح المجهر
    1. تطبيق الفازلين على الجزء السفلي من انزلاق الغطاء. وهذا الاستقرار في إعداد خلال نضح.
    2. ضع إعداد الحبل الشوكي فيالتصوير بشكل جيد على المسرح المجهر مع الجانب البطني مواجهة نحو الهدف غمس 25X. التصوير جيدا مبنية خصيصا حوالي 20 ملم عميق، 50 مم طويل، و 50 مم عبر.
    3. صورة بينما superfusing إعداد مع درجة حرارة (37 درجة مئوية)، المؤكسج (95: 5 الأكسجين: ثاني أكسيد الكربون-كربوجين) المتوسطة RPMI-1640 دون المصل.
      1. وسائل الإعلام قبل دافئ إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي وذلك لربط أنابيب مضخة عن طريق إدخال الأنبوب في زجاجة سائل الإعلام.
      2. الإبقاء على درجة حرارة سائل الإعلام في 37 ° C جهاز سخان في ربط أنابيب إلى غرفة. وسائل الإعلام Superfuse من خلال جيدا في 3 مل / دقيقة باستخدام أنابيب متصلة أنابيب مضخة (الشكل 1B).

3. 2P التصوير من الحبل الشوكي بطني

  1. الإعداد المجهر
    1. الحصول على صور من النخاع الشوكي Thy1-EYFP باستخدام الحرباء الترا تي: ليزر الياقوت ضبطها إلى 900 نانومتر. تخفيف قوة الليزر فيعينة إلى <5٪ لضمان الحد الأدنى من الضيائية 16. الحفاظ على درجة الحرارة عن طريق perfusing-perfused لالأكسجين RPMI-1640 في ثابت 37 ° C باستخدام واحد سخان حل مضمنة لضمان التصوير مستقرة، ومنع الانجراف الأنسجة وتلف الخلايا.
    2. لفصل EGFP وEYFP إشارة الفلورسنت، ووضع 520 نانومتر مزدوج اللون واحدة الحافة و560 نانومتر واحد حافة مزدوج اللون شعاع الخائن في سلسلة لفصل 2P الانبعاثات إلى ثلاث قنوات، تقسيم عمدا انبعاث الأخضر لتعزيز الرؤية.
      ملاحظة: هذه القناة ويشار إلى الأزرق والأخضر (الانبعاثات <520 نانومتر) والأخضر والأصفر (520-560 نانومتر)، والأحمر (الانبعاثات> 560 نانومتر). أنابيب مضخم كشف تنبعث الضوء في كل قناة.
  2. تحديد مناطق التصوير الفائدة
    1. باستخدام العدسة ومصدر الضوء الساطع المجال، والتركيز على الهدف غمس على حافة بطني من الحبل الشوكي لتحديد نقطة مرجعية.
    2. جعل مصدر الضوء المؤكد المحيطة هو خارج وجنوب غربحكة ل2P الإثارة عن طريق فتح مصراع الليزر.
    3. إذا كان متوفرا، عند البحث الأنسجة لمجالات الاهتمام، استخدام دقة إعداد أقل، وارتفاع حجم دون تقريب رقمي، وأعلى معدل المسح مما كانت عليه عندما الحصول على الصور النهائية. إعدادات نموذجية مع هذا النظام عند البحث عن الأنسجة المنطقة ذات الاهتمام هي: القرار: 256 بكسل. حجم: س = 600 ميكرون، ذ = 600 ميكرون، ض = 0-300 ميكرون.
    4. مراقبة محاور EYFP بالقرب من الحافة البطنية من النخاع الشوكي. سوف إشارة التوافقية الثانية من الكولاجين (الأزرق) سيكون ألمع في العمود الفقري حافة نسيج الحبل. تحديد محاور EYFP فقط الظهرية للإشارة التوافقية الثانية من الكولاجين وتصور إشارة EYFP في القناة الخضراء والأصفر.
    5. تحديد الموقع زرع في وسط الطولي للإعداد الحبل الشوكي 14. بالنسبة للفئران 1 يوم بعد زرع EGFP-مجلس الشعب، حدد موقع الموقع زرع من خلال التركيز على مسار شعاع في الطائرة ض عمق الأنسجة. واي الموقع زرعليرة لبنانية تختلف قليلا بين الحيوانات ولكن يقع عموما ~ 200 ميكرون من على حافة بطني. مراقبة مجموعات من EGFP-الشخصيات في مساحات المادة البيضاء، وأقرب إلى حواف البطنية والجانبية في الفئران بعد يوم 1 بعد الزرع.
  3. الحصول على الصور النهائية
    1. الحصول على صورة من القرار 512 بكسل. حجم: س = 270 ميكرون، ذ = 212 ميكرون، و z = 100 ميكرون باستخدام Slidebook 6 البرمجيات. تجميع أكوام Z-من خلال الحصول على طائرات التنسيق متتابعة في 2.5 ميكرون الزيادات.
    2. إجراء فحص ثنائي الاتجاه مع حابك السليم تعويض لضمان الكمي السريع للأي أجسام المهاجرة في الحبل الشوكي. ضمان المثالي معدل الإطار الاستحواذ لتحديد سرعة الخلوية داخل الحبل الشوكي هو حوالي 1 إطار / ثانية.
      يمكن تغيير إعدادات التصوير لتفضيلات المستخدم الفردية، مثل اكتساب معدل الإطار، القرار التصوير وأحجام التصوير: ملاحظة. سوف أحجام التصوير اكبر يستغرق عادة وقتا أطول لاكتساب في GIVقرار أون.
    3. تحليل، والمحاصيل، على نحو سلس، وpseudocolor ملفات Slidebook صورة مع برنامج تحليل الصور مثل Bitplane Imaris 7.7. إنتاج النهائية الفيديو الوقت الفاصل عن طريق تمشيط أحجام التصوير متتالية باستخدام عملية مؤتمتة في Slidebook وImaris.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في حين أن بروتوكول التصوير الحبل الشوكي explanted يمكن استخدامها لتصور أي مضان داخل الحبل الشوكي، نتائج ممثلة لدينا تظهر التفاعلات EGFP-NPC مع EYFP-محاور عصبية. أولا، نقدم لك مجموعة من بطني إعداد الحبل الشوكي جزءا لا يتجزأ في الشكل 1A. وبعد ذلك، نقدم لك مجموعة من الإعداد 2P المجهر والمكونات الرئيسية في الشكل 1B الشكل 2 يوضح EGFP وEYFP مضان في واحد ض المكدس داخل الحبل الشوكي بطني. اكتساب متتالية ض مداخن يمكن جمعها لإنتاج أشرطة الفيديو الوقت ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في الوقت الحقيقي هو مطلوب 2P التصوير من الأنسجة سليمة للتحقيق حركية مجلس الشعب والتفاعلات التالية زرع في النخاع الشوكي الماوس عديمة الميلين. ويستخدم حيوي داخلي 2P التصوير عادة لتحديد ديناميات الخلوية على الجانب الظهري للحبل الشوكي في الفئران الحية، واستخدمت لدراسة الظهرية إزالة الميالين في المزيل للمرض 17-19. ومع ذلك، لأن الشخصيات المزروع تهاجر إلى المادة البيضاء بطني، التي تقع عميق جدا لصورة في الموقع باستخدام 2P المجهر، وإعداد فيفو السابقين أمر ضروري. وقد است...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس للمؤلفين مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R01 GM-41514 (إلى MDC) ، و R39 GM-048071 (إلى IP) ، و R01 NS-074987 (إلى T.E.L.) وجائزة أبحاث المركز التعاوني للجمعية الوطنية للتصلب المتعدد (NMSS) CA1058-A-8 (إلى CMW و T.E.L. و MDC) ، NMSS Grant RG4925 ، منحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة T32-الذكاء الاصطناعي-060573 (إلى M.L.G.) ، زمالة ما بعد الدكتوراه NMSS FG 1960-A-1 (إلى JGW) ، وتمويل من مؤسسة جورج إي هيويت للأبحاث الطبية (MPM).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Isoflurane ، USPPiramal Critical Care، IncN / A
مقص ناعمأدوات العلوم الدقيقة14060-09
شفرة مشرط حادة # 10أدوات العلوم الدقيقة10010-00
مقبض مشرطأدوات العلوم الدقيقة10003-12
أدواتالعلوم الدقيقة16001-15
Graefe ملقطأدوات العلوم الدقيقة11052-10
مقص فاناسأدوات العلوم الدقيقة15615-08
شفرة مشرط # 11أدوات العلوم الدقيقة10011-00
RPMI-1640Gibco12-115F
agarose ، درجة حرارة تبلور منخفضةSigmaA9414-25G
ParafilmFisher Scientific13-374-12
Vetbond (لاصق الأنسجة)3M1469SB
22 مم غطاء مربع زلةفيشر Scientific12-547
25X هدف الغمس ، 1.1 NANikonCFI Apo LWD 25XW
سخان حل مضمن واحدWarner Instruments64-0102
520 نانومتر مقسم شعاع ثنائي اللون أحادي الحافةSemrockFF520-Di02-25x36Brightline
560 نانومتر أحادي الحافة ثنائي اللون شعاع الخائنSemrockFF560-FDi01-25x36
أنابيب المضاعف الضوئيHamamatsuR928
C / L مضخة أنابيب متغيرة السرعةMasterflex77122-22
ميزان الحرارة الرقميComar Instruments3501
Chameleon Ultra Ti: ليزر الياقوت   ؛متماسكةN / A
Slidebook 6 البرمجيات3iN / A
Imaris 7.7 برنامجBitplaneN / A
Brightline

المراجع

  1. Robinson, A. P., Harp, C. T., Noronha, A., Miller, S. D. The experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model of MS: utility for understanding disease pathophysiology and treatment. Handb Clin Neurol. 122, 173-189 (2014).
  2. Pluchino, S., Zanotti, L., Brini, E., Ferrari, S., Martino, G. Regeneration and repair in multiple sclerosis: the role of cell transplantation. Neurosci Lett. 456 (3), 101-106 (2009).
  3. Hatch, M. N., Schaumburg, C. S., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Endogenous remyelination is induced by transplant rejection in a viral model of multiple sclerosis. J Neuroimmunol. 212 (1-2), 74-81 (2009).
  4. Totoiu, M. O., Nistor, G. I., Lane, T. E., Keirstead, H. S. Remyelination, axonal sparing, and locomotor recovery following transplantation of glial-committed progenitor cells into the MHV model of multiple sclerosis. Exp Neurol. 187 (2), 254-265 (2004).
  5. Tirotta, E., Carbajal, K. S., Schaumburg, C. S., Whitman, L., Lane, T. E. Cell replacement therapies to promote remyelination in a viral model of demyelination. J Neuroimmunol. 224 (1-2), 101-107 (2010).
  6. Greenberg, M. L., et al. Two-photon imaging of remyelination of spinal cord axons by engrafted neural precursor cells in a viral model of multiple sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (22), E2349-E2355 (2014).
  7. Whitman, L. M., Blanc, C. A., Schaumburg, C. S., Rowitch, D. H., Lane, T. E. Olig1 function is required for remyelination potential of transplanted neural progenitor cells in a model of viral-induced demyelination. Exp Neurol. 235 (1), 380-387 (2012).
  8. Pluchino, S., et al. Injection of adult neurospheres induces recovery in a chronic model of multiple sclerosis. Nature. 422 (6933), 688-694 (2003).
  9. Weinger, J. G., et al. MHC mismatch results in neural progenitor cell rejection following spinal cord transplantation in a model of viral-induced demyelination. Stem Cells. 30 (11), 2584-2595 (2012).
  10. Vogel, D. Y., et al. Macrophages in inflammatory multiple sclerosis lesions have an intermediate activation status. J Neuroinflammation. 10, 35(2013).
  11. Coyle, P. K. Ch. 3. Clinical Neuroimmunology: Multiple Sclerosis and Related Disorders. Rizvi, S. A., Coyle, P. K. 3, Springer. 43-70 (2011).
  12. McManus, C., et al. MCP-1, MCP-2 and MCP-3 expression in multiple sclerosis lesions: an immunohistochemical and in situ hybridization study. J Neuroimmunol. 86 (1), 20-29 (1998).
  13. Calderon, T. M., et al. A role for CXCL12 (SDF-1alpha) in the pathogenesis of multiple sclerosis: regulation of CXCL12 expression in astrocytes by soluble myelin basic protein. J Neuroimmunol. 177 (1-2), 27-39 (2006).
  14. Carbajal, K. S., Weinger, J. G., Whitman, L. M., Schaumburg, C. S., Lane, T. E. Surgical transplantation of mouse neural stem cells into the spinal cords of mice infected with neurotropic mouse hepatitis virus. J Vis Exp. 53, e2834(2011).
  15. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).
  16. Nguyen, Q. T., Callamaras, N., Hsieh, C., Parker, I. Construction of a two-photon microscope for video-rate Ca(2+) imaging. Cell Calcium. 30 (6), 383-393 (2001).
  17. Nikic, I., et al. A reversible form of axon damage in experimental autoimmune encephalomyelitis and multiple sclerosis. Nat Med. 17 (4), 495-499 (2011).
  18. Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Implanting glass spinal cord windows in adult mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. 82, e50826(2013).
  19. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  20. Pakan, J. M., McDermott, K. W. A method to investigate radial glia cell behavior using two-photon time-lapse microscopy in an ex vivo model of spinal cord development. Front Neuroanat. 8, 22(2014).
  21. Fenrich, K. K., et al. Long-term in vivo imaging of normal and pathological mouse spinal cord with subcellular resolution using implanted glass windows. J Physiol. 590 (Pt 16), 3665-3675 (2012).
  22. Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. A decade of imaging cellular motility and interaction dynamics in the immune system. Science. 336, 1676-1681 (2012).
  23. Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296 (6089), 1869-1873 (2002).
  24. Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. Two-photon imaging of the immune system. Curr Protoc Cytom. Chapter 12 (Unit12 26), (2012).
  25. Matheu, M. P., et al. Toll-like receptor 4-activated B cells out-compete Toll-like receptor 9-activated B cells to establish peripheral immunological tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (20), E1258-E1266 (2012).
  26. Matheu, M. P., et al. Three phases of CD8 T cell response in the lung following H1N1 influenza infection and sphingosine 1 phosphate agonist therapy. PLoS One. 8 (3), e58033(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التصوير ثنائي الفوتون الخلوية ديناميكية في الحبل الشوكي ماوس
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.