مقالة منهجية

إعداد وحيدة الخلية تعليق لتحليل Cytofluorimetric من المناطق الجلد ماوس مختلفة

DOI:

10.3791/52589

⸱

أبريل 20, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biotechnology and Biosciences, University of Milano-Bicocca, 2Boston Children's Hospital, Division of Gastroenterology, Harvard Medical School, 3Humanitas Clinical and Research Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجلد هو موطن لشبكة خلايا مناعية معقدة. نصف منهجية فعالة لهضم جلد الفأر ، من أجزاء مختلفة من جسم ، من أجل الحصول على تعليق أحادي الخلية وتحليل مجموعات الكريات البيض المختلفة الموجودة في الجلد عن طريق قياس التدفق الخلوي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجلد هو عضو حاجز يتفاعل مع البيئة الخارجية. نظرا لكونها تتعرض باستمرار لغزو ميكروبي محتمل ، فإن الأدمة والبشرة موطن لمجموعة متنوعة من الخلايا المناعية في كل من الظروف الاستتبابية والالتهابية. لذلك ، فإن أدوات الحصول على إطلاق خلايا الجلد لتحليلات القياس الخلوي مفيدة جدا لدراسة الشبكة المعقدة للخلايا المناعية الموجودة في الجلد واستجابتها للمنبهات الميكروبية. هنا ، نصف منهجية فعالة لهضم جلد الفأر للحصول على معلقات أحادية الخلية بسرعة وكفاءة. يسمح هذا البروتوكول بالحفاظ على أقصى قدر من صلاحية الخلية دون المساس بتعبير المستضد السطحي. نصف أيضا كيفية أخذ عينات الجلد وهضمها من مواقع تشريحية مختلفة ، مثل الأذن والجذع والذيل ووسادة القدم. ثم يتم تلطيخ المعلقات التي تم الحصول عليها وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي للتمييز بين مجموعات الكريات البيض المختلفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجلد هو أحد أكبر أعضاء الجسم وسطحه الكبير يتعرض باستمرار للبيئة الخارجية. لذلك يجب على الجلد حماية الكائن الحي من التهديدات المحتملة من أجل الحفاظ على التوازن ، سواء بالوسائل الفيزيائية ، أو من خلال توفير الحماية النشطة تجاه دخول مسببات الأمراض المحتملة. بطريقة مشابهة للغشاء المخاطي للأمعاء والرئة ، يضم الجلد مجموعة متنوعة من الخلايا المناعية التي تتفاعل باستمرار مع الظهارة من أجل الحفاظ على المراقبة المناعية. تم الاعتراف بهذا النظام المعقد الذي يشمل الخلايا المناعية وغير المناعية للجلد منذ الأيام الأولى لعلم المناعة ، عندما تمت صياغة مصطلح "الأنسجة اللمفاوية المرتبطة بالجلد" (SALT) 1 لأول مرة في عام 1978 لوصف هذا التعقيد.

يساعد العدد الكبير من الخلايا المناعية الموجودة في الجلد الكائن الحي ليس فقط على محاربة الغزوات المحتملة ، ولكن أيضا على تنظيم التئام الجروح والحفاظ على تحمل المستضدات الذاتية والجراثيم الجلدية 2،3.

بين الخلايا المناعية المقيمة في الجلد ، تلعب الخلايا المتغصنة (DCs) دورا مهما في تشكيل الاستجابات المناعية والحفاظ على التوازن 4. تستجيب خلايا DCs الجلدية وخلايا Langerhans بسهولة لغزوات مسببات الأمراض ، وعند الهجرة إلى الغدد الليمفاوية ، تنشط الخلايا التائية وتحفز التعبير عن مستقبلات الجلد الموجهة على الخلايا التائية المستجيبة التي تم إنشاؤها حديثا 5. تلعب DCs أيضا دورا أساسيا في تنظيم توازن الجلد. تنقل DCs التي تهاجر من الأدمة إلى الغدد الليمفاوية في ظروف التوازن المستضدات المعزولة للجلد بغرض تحفيز تحمل الخلايا التائية في الغالب من خلال تمايز الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) الخاصة بمستضدات الجلد 6-8.

تمثل الخلايا التائية < p class = 'jove_content'> أكثر الخلايا المناعية وفرة في الجلد. لا يقتصر الأمر على التسلل إلى الجلد أثناء الإصابة فحسب ، بل يمثلون أيضا مجموعة مستقرة من السكان بين الخلايا الليمفاوية المقيمة في الجلد 9،10. توجد كل من خلايا الذاكرة المقيمة CD8 + و CD4 + في الجلد ، وبعد الإصابة ، يمكن أن تستجيب قبل وقت طويل من تجنيد الخلايا التائية المستجيبة من الدم. في الجلد, يقيم أيضا مجموعة من الأنسجة المقيمة Tregs قادرة على الحفاظ على التسامح تجاه مستضدات الجلد وتوازن الأنسجة. يتم تنشيط هذه الخلايا بسرعة وقوة بعد التعرض لمستضدها المماثل ، وبالتالي تم تعريفها على أنها ذاكرة Tregs 11،12.

جنبا إلى جنب مع الخلايا النامية والخلايا التائية ، فإن العديد من الخلايا المناعية الفطرية ، مثل الخلايا القاتلة الطبيعية ، وخلايا جاما دلتا التائية ، والمجموعة 2 ILCs 13 ، والخلايا البدينة والضامة ، تملأ الجلد وتساهم في حماية المضيف. لتحليل مثل هذه البيئة المعقدة ، من الضروري الحصول على معلقات أحادية الخلية من عينات الجلد بكفاءة عالية مع الحفاظ في نفس الوقت على التعبير عن علامات السطح لتحليل أو فرز التدفق الخلوي.

يقدم جلد الفئران طبقة بشرة خارجية ، تتكون بشكل أساسي من الخلايا الكيراتينية وخلايا لانجرهانز والخلايا التائية للبشرة المتغصنة ؛ والطبقة الجلدية تحتها. تؤوي الأدمة معظم الخلايا المناعية وتتكون من مصفوفة خارج الخلية تكون فيها ألياف الكولاجين هي الأكثر وفرة ، وخاصة الكولاجين الأول والكولاجين الرابع. على عكس جلد الإنسان ، فإن جلد الفأر مغطى بالفراء ، وبالتالي فهو أكثر اكتظاظا ببصيلات الشعر. كما أنه أرق بكثير من جلد الإنسان ويحتوي على طبقة عضلية ، panniculus carnosus ، مما يساعد على التئام الجروح 14. تجعل هذه الخصائص من الصعب تعطيل شبكة الكولاجين في الأدمة بكفاءة من أجل إخراج الخلايا المناعية.

في هذه الورقة نقدم طريقة مناسبة لهضم المصفوفة خارج الخلية التي تعتمد على مزيج من الكولاجيناز عالي النقاء 1 و 2 والموليزين الحراري. علاوة على ذلك ، نظرا لأن تحليل الجلد من مناطق مختلفة يتطلب إجراءات تجريبية مختلفة ، فسوف نعرض طرقا مختلفة للحصول على عينات جلدية بكفاءة من وسادة القدم والذيل والأذن والجذع. سنقوم بعد ذلك بتسمية العينات من أجل تقييم وجود خلايا الضامة (MHCII + CD11c + CD45 +) (CD11b + F4 / 80 + CD45 +) و CD8 + و CD4 + T.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الموافقة دراسة: تمت الموافقة على البروتوكولات التجريبية من قبل الوزارة الإيطالية للصحة (روما، ايطاليا) وفقا لDecreto legislativo 27 gennaio 1992، ن. 116 "Attuazione ديلا Direttiva ن 86/609 / CEE في خواص المواد دي protezione ديلي animali utilizzati وفيني sperimentali س إعلان ألتري فيني scientifici."

1. الحصول على عينات الجلد

  1. الموت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.
  2. الأذن:
    1. قطع الجزء أصلع من آذان الفأر.
    2. الظهرية منفصل والجانب البطني عن طريق سحب بينهما بالملقط. إزالة أي غضاريف المتبقية عن طريق كشط بلطف الجزء الداخلي من الأذن مع ملقط.
  3. الجلد الجذع:
    1. حلق الجلد كله من الحيوان على حد سواء مع الحلاقة الكهربائية ومع محلول مزيل الشعر الدقيق.
    2. قطع عينة من الجلد المطلوبة (من 2 سم 2 حتى جلد الحيوان كله).
      1. إذا قطع ظهري كله وفينترال الجلد الماوس، وجعل قطع رأسي في منتصف الماوس مرة أخرى ثم قطع على طول حدود المناطق حلق في جميع أنحاء الجسم الماوس.
      2. فصل بلطف الجلد من الصفاق وعضلات الظهر، والحفاظ على عينة من الجلد لا يزال مع ملقط حين فصل عينة من الجلد مع إغلاق نصائح فوز جولة من مقص جراحي أو مشرط.
    3. إعداد لوحة الثقافة خلية 100 ملم تحتوي على 10 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
    4. القضاء على الدهون تحت الجلد عن طريق غمر عينة من الجلد في برنامج تلفزيوني في لوحة أعدت في الخطوة 1.3.3 وتجريف عينة من الجلد بالملقط.
  4. ذيل:
    1. قطع ذيل الماوس.
    2. جعل قطع رأسي على الذيل مع مقص جراحي أو مشرط جراحي، بدءا من قاعدة الذيل وصولا الى طرف الذيل.
    3. استخدام ملقط لفصل الجلد من الذيل. الاستيلاء على حافة القطع في قاعدة الذيل وسحب بلطف نحو الطرف في حين عقدالجسم من الذيل مع ملقط.
    4. إزالة أي الدهون الزائدة عن طريق كشط بلطف عينة من الجلد.
  5. قاطع الطريق
    1. قطع القدم الماوس كامل مع مقص جراحي. تجنب قطع أي الجلد شعر.
    2. قطع الجلد من القدم طوليا من الكاحل إلى بداية الأرقام.
    3. عقد عظام الكاحل مع ملقط أو باليد أثناء الاستيلاء على الجلد مع ملقط وسحب الجلد نحو الأرقام كما لو تقلع القفازات.

2. الهضم

  1. تحضير الكوكتيل الهضم من المحلول (المعدة كما هو الحال في قائمة المواد) مع الوصفة التالية: أنزيم مزيج (انظر قائمة هذه المواد لمواصفات) 300 ميكروغرام / مل، DNAse1 50 U / مل. تمييع في RPMI 5٪ FBS.
  2. ختم عينات الجلد مع مقص الى قطع صغيرة في طبق بتري 35 مم مع 2 مل من الهضم كوكتيل (للبشرة الجذع: 2 مل من كوكتيل الهضم كل 2 سم 2 من الجلد، وتصل إلى 3 مل المجموع).
  3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. يهز بلطف طبق بيتري 1-2 مرات خلال حضانة.
  4. صب عينات الجلد هضمها على مصفاة 70 ميكرومتر الخلية في 66 طبق ملم بتري تحتوي على 1 مل من RPMI1640 5٪ FBS.
  5. غسل مصفاة مع 5 مل من RPMI 1640 FBS 5٪.
  6. ضغط على عينة من خلال مصفاة الخلية مع المكبس حقنة.
  7. الغطاس دافق، طبق بيتري ومصفاة مع 20 مل من RPMI1640 5٪ FBS، ونقل إلى أنبوب 50 مل.

3. الأجسام المضادة وصفها

  1. غسل تعليق تم الحصول عليها مرتين مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1٪ FBS (أو BSA).
  2. تسمية تعليق خلية تم الحصول عليها مع الأجسام المضادة المطلوبة.
    1. Resuspend والعينات في 100 ميكرولتر / عينة من مزيج يحتوي على 2 ميكروغرام / مل من aCD16 / CD32 (استنساخ 2.4G2) المخفف في برنامج تلفزيوني 1٪ FBS.
    2. احتضان لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية وذلك لمنع غير محددة وملزمة من الأجسام المضادة المطلوبة عن طريق مستقبلات لكرة القدم.
    3. إضافة الأجسام المضادة هو مبين في الجدول1.
      1. إعداد مزيج تمييع الأجسام المضادة المطلوبة في 100 ميكرولتر / عينة من برنامج تلفزيوني 1٪ FBS بتركيز 4 ميكروغرام / مل.
      2. إضافة 100 ميكرولتر من المزيج المعد في الخطوة 3.2.3.1 لكل عينة حتى أنه في الأنبوب، وسوف يكون هناك حجم 200 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة في تركيز النهائي من 2 ميكروغرام / مل.
    4. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، وتغطي من الضوء.
  3. تغسل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني 1٪ FBS، الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 400 x ج، تجاهل وطاف resuspend في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1٪ FBS.
  4. إضافة دابي في تركيز النهائي من 2 ميكروغرام / مل واحتضان عند 4 درجات مئوية، محمية من الضوء لمدة 10 دقيقة.
  5. تحليل العينات التي تم الحصول عليها عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية.
    1. من أجل عزل الكريات البيض، استخدام استراتيجية النابضة التالية:
      1. أولا إزالة أي خلايا ميتة من قبل المعزولة على السكان DAPI-.
      2. اختر singlets لفي FSC-A مقابل FSC W مؤامرة كما هو مبين في الشكل رقم 1 .
      3. بوابة الخلايا استنادا إلى حجم وتحبب نموذجية من الكريات البيض من الفائدة.
      4. اختر CD45 + الخلايا في FSC-A مؤامرة CD45 كما هو مبين في الشكل 1.
    2. التمييز بين مجموعات مختلفة من الكريات البيض عن طريق التعبير عن علامات سطح النحو التالي:
      1. تحديد البلدان النامية كما CD11c و+ MHC II + الخلايا. ويمكن تحليلها في وقت لاحق للتعبير عن CD207 للتمييز خلايا لانغرهانس وCD207 + الجلدية البلدان النامية من CD207- الجلدية البلدان النامية.
      2. تحديد الضامة كما CD64 + الخلايا F4 / 80 +.
      3. تحديد الخلايا البائية إلى خلايا CD19 + MHCII +.
      4. تحديد الخلايا T كما CD8 + أو CD4 + الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم هضمها الجلد من منطقة مختلفة من الجسم وفقا للبروتوكول وصفها وملطخة الأجسام المضادة المشار إليها. وصفت استراتيجية المحاصرة في الشكل 1. حدد أول الخلايا الحية (خلايا DAPI-)، ثم البوابة على singlets ل(FSC-A مقابل FSC-W) وعلى خلايا لمفاوية مع التشكل (FSC-A مقابل SSC-A). عندما المشار إليها، ويتم اختيار خلايا CD45 + من أصل للدم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفناها طريقة لإعداد وحيدة الخلية تعليق من مختلف مناطق الجلد الماوس. طريقة الهضم الذي اعتمدناه، ليس فقط يعطي عوائد عالية ولكن أيضا يحافظ على التعبير عن علامات السطح، وهو أمر أساسي لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لاحق.

استخدام مزيج من كولاجيناز الأول والثاني وthermolysin، يضمن الحد الأدنى من دفعة لدفعة الاختلافات في نشاط انزيم يجعل هذا الأسلوب استنساخه للغاية. الأساليب الأخرى المنشورة تعتمد على الكوكتيلات انزي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل بمنح من Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC ، IG14593 ، MFAG13235) ، و Fondazione Cariplo (Grant 2010-0678 و NANOVAC) و Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

المواد < / قوي>جراحيجراحيجراحيبتريبتريبتري

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Recodes< / strong>
Supplemented RPMI 1640 medium RPMI1640 مكملة مع L-glu ، القلم العقدي مع بيتا ميركابتو الإيثانول
PBS
FBS
Liberase TM (مزيج الإنزيم)5401119001 Rocheresuspend [2.5 & nbsp; mg/ml] في dH2O; تخزين الحصص في -20   ؛ ° C
Dnase ISigma D4263-1VLإعادة التعليق في RPMI 1640 مع مصل [1,000  U / ml] <
مقص
ملقط
مشرط
35 مم أطباق
66 مم أطباق
100 مم أطباق
70 وميكرو ؛ م مصافي خليةديناربحريني 352350
<قوية>كوكتيل هضممخفف في RPMI 5٪ FBS
LIberase TM300 & micro; جم / مل
DNAse150 U / مل
<قوي >أجسام مضادة < / قوي >
<قوي> الاسم < / strong > Company < / strong > clone < / strong > Label < / strong>
aCD45.2104PE-Cy5.5
aCD11cN418PE-Cy7
CD11bM1 / 70FITC
F4 / 80A 3-1APC-Cy7
aCD4Gk1.5APC-Cy7
aCD853-6.7PE
aCD64X54-5 / 7.1PE-Cy7
aCD2074C7APC
td colspan = "4" >

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Streilein, W. J. Circuits and signals of the skin-associated lymphoid tissues (SALT). Journal of Investigative Dermatology. 85 (1 Suppl), 10s-13s (1985).
  2. Tay, S. S., Roediger, B., Tong, P. L., Tikoo, S., Weninger, W. The Skin-Resident Immune Network. Current dermatology reports. 3, 13-22 (2014).
  3. Shen, W., et al. Adaptive immunity to murine skin commensals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (29), E2977-E2986 (2014).
  4. Broggi, A., Zanoni, I., Granucci, F. Migratory conventional dendritic cells in the induction of peripheral T cell tolerance. Journal of leukocyte biology. 94 (5), 903-911 (2013).
  5. Pan, J., et al. DCs metabolize sunlight-induced vitamin D3 to'program'T cell attraction to the epidermal chemokine CCL27. Nature Immunology. 8 (3), 285-293 (2007).
  6. Vitali, C., et al. Migratory, and not lymphoid-resident, dendritic cells maintain peripheral self-tolerance and prevent autoimmunity via induction of iTreg cells. Blood. 120 (6), 1237-1245 (2012).
  7. Azukizawa, H., et al. Steady state migratory RelB+ langerin+ dermal dendritic cells mediate peripheral induction of antigen-specific CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells. European journal of immunology. 41 (5), 1420-1434 (2011).
  8. Idoyaga, J., et al. Specialized role of migratory dendritic cells in peripheral tolerance induction. The Journal of clinical investigation. 123 (2), 844-854 (2013).
  9. Boyman, O., Conrad, C., Tonel, G., Gilliet, M., Nestle, F. O. The pathogenic role of tissue-resident immune cells in psoriasis. Trends in immunology. 28 (2), 51-57 (2007).
  10. Di Meglio, P., Perera, G. K., Nestle, F. O. The multitasking organ: recent insights into skin immune function. Immunity. 35 (6), 857-869 (2011).
  11. Rosenblum, M. D., et al. Response to self antigen imprints regulatory memory in tissues. Nature. 480 (7378), 538-542 (2011).
  12. Rosenblum, M. D., Truong, H. A., Abbas, A. K., Gratz, I. K. 177: Maintenance of memory regulatory T cells in peripheral tissues. Cytokine. 63 (3), 284-285 (2013).
  13. Kim, B. S., et al. TSLP elicits IL-33-independent innate lymphoid cell responses to promote skin inflammation. Science translational medicine. 5 (170), (2013).
  14. Gopinathan, K. M. New insights into skin structure: scratching the surface. Advanced drug delivery reviews. 54 (Suppl 1), S3-S17 (2002).
  15. Sandrine, H., et al. CD207+ CD103+ dermal dendritic cells cross-present keratinocyte-derived antigens irrespective of the presence of Langerhans cells. The Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 189-206 (2010).
  16. Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin. Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة